CC BY
36
УДК 615.015:616.831-005:599.323.4
ВЛИЯНИЕ НАТРИЕВОЙ СОЛИ 4 - (2-ОКСО-3-МЕТИЛ-2Н-[1,2,4] ТРИАЗИНО [2,3-с] ХИНАЗО-ЛИН-6-ИЛ) БУТАНОВОЙ КИСЛОТЫ (СОЕДИНЕНИЕ DSK-38) НА СОСТОЯНИЕ ОКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНОГО РАВНОВЕСИЯ В МОЗГЕ КРЫС В УСЛОВИЯХ ОСТРОГО НАРУШЕНИЯ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ
© Семененко Н.А.
Кафедра фармакологии
Винницкого национального медицинского университета им. М.И. Пирогова, Винница, Украина
E-mail: [email protected]
В статье приведены данные о динамике показателей оксидантно-антиоксидантного равновесия в ишемизированном мозге крыс на фоне курсового лечения натриевой солью 4 - (2-оксо-3-метил-2Н-[1,2,4] триазин [2,3-с ] хиназолин-6-ил) бутановой кислоты (соединением DSK-38) и референс-препаратом цитиколином. Курсовое (18-дневное) введение крысам с ОНМК DSK-38 (10 мг/кг в/б) так же, как и цитиколина (250 мг/кг в/б), способствует нормализации оксидантно-антиоксидантного гомеостаза в ишемизированном мозге. Соединение DSK-38, как и цитиколин, ослабляет выраженность окислительной модификации белков тканей головного мозга. На фоне действия соединения DSK-38 и цитиколина на 4 и 18 сутки эксперимента имеет место уменьшение содержания МДА и повышение активности анти-оксидантных ферментов: на 4 и 18 сутки эксперимента регистрируется увеличение активности супероксиддисмутазы, каталазы по сравнению с группой контроля.
Ключевые слова: головной мозг, натриевая соль 4 - (2-оксо-3-метил-2Н-[1,2,4] триазин [2,3-с] хиназолин-6-ил) бутановой кислоты, цитиколин, оксидантно-антиоксидантное равновесие.
INFLUENCE OF THE SODIUM SALT OF 4 - (2-OXO-3-METHYL-2H-[1,2,4] TRIAZINE [2,3-C] QUINAZOLIN -6-YL) OF BUTYRIC ACID (COMPOUND DSK-38) ON THE OXIDANT-ANTIOXIDANT BALANCE IN THE BRAIN OF RATS WITH AN ACUTE CEREBRAL CIRCULATION DISORDER
Semenenko N.A.
Department of Pharmacology, MI Pirogov Vinnitsa National Medical University, Vinnitsa, Ukraine
The article presents the data on the dynamics of indicators of the oxidant-antioxidant balance in the ischemic brain of rats against the background of the therapy with sodium salt of 4 - (2-oxo-3-methyl-2H-[1,2,4] triazine [2,3-c ] quinazolin-6-yl) of butyric acid (compound DSK-38) and reference-preparation Citicoline. The course (18-day) administration of DSK-38 (10 mg/kg intraabdominally) as well as Citicoline (250 mg/kg intraabdominally) to rats with acute cerebral circulation disorder contributes to the normalization of the oxidant-antioxidant homeostasis in the ischemic brain. The compound DSK- 38 as well as Citicoline weakens the intensity of the oxidative protein modification of the brain tissue. Against the background of the compound DSK-38 action and Citicoline on the 4th and 18th day of the experiment a decrease in MDA and an increase in the antioxidant enzymes activity took place: on the 4th and 18th day of the experiment the increase in activity of superoxide dis-mutase, catalase was recorded, as compared with the control group.
Keywords: brain, sodium salt of 4 - (2-oxo-3-methyl-2H-[1,2,4] triazine [2,3-c] quinazolin-6-yl) of butanoic acid, Citico-line, oxidant-antioxidant balance.
Известно, что в условиях церебральной ишемии происходит гиперпродукция активных форм кислорода (АФК), что приводит к активации в нейроцитах процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ) и, как следствие, появлению высокотоксичных соединений (диенкетонов (ДК), три-енкетонов (ТК), малонового диальдегида (МДА) и др.) и образованию в структуре макромолекул карбонильных и карбоксильных групп [5]. В условиях кислородной недостаточности активируются ферментативные комплексы дыхательной цепи митохондрий, генерирующие АФК (НАД Н-зависимая дегидрогеназа, НАД-зависимая убихи-нон-редуктаза) [1, 12]. Антиоксидантная система нейрона является многоуровневой и сложно организованной системой. Первое звено представлено
жирорастворимыми экзогенными и эндогенными антиоксидантами (сюда можно отнести токоферолы, убихинон, ретинол и мелатонин) [11]. Существенная защита нейронов от токсического действия АФК в условиях ишемии реализуется за счет функционирования ферментативного антиоксидантного звена. Она состоит из антиради-кальных, антиокислительных, оксидоредуктазных и других ферментов (каталаза, супероксиддисму-таза, глутатионпероксидаза). К этому же звену относят соединения, содержащие тиольные и се-леногруппы (цистеин, метионин и цистин), а также гистидинсодержащие дипептиды (карнозин, анзерин, гомокарнозин). Супероксиддисмутаза (СОД) является основным ферментом, который восстанавливает супероксидный радикал в пероксид водорода, ограничивая тем самым скорость
ПОЛ [13]. Для полноценной работы СОД необходима функционально активная каталаза и низкомолекулярные тиосодержащие антиоксиданты (цистеин), которые контролируют уровень Н2О2 [9, 11]. При ишемическом поражении нейронов недостаточное количество составляющих данной системы антиоксидантной защиты приводит к прогрессированию процессов ПОЛ и ОМБ и, как следствие, увеличению зоны инфаркта ткани мозга.
Сегодня ведется интенсивный поиск природных и синтетических соединений с церебропро-текторным действием, пригодных для создания на их основе новых, более эффективных и безопасных отечественных лекарственных средств. Перспективным для поиска веществ с церебропротек-торным действием является производное натриевой соли 4 - (2-оксо-3-метил-2Н-[1,2,4] триазин [2,3-с] хиназолин-6-ил) бутановой кислоты, поскольку данное соединение имеет выраженное церебропротекторное действие, которое проявляется снижением показателя летальности крыс с двусторонней окклюзией общих сонных артерий [8]. Поэтому представляло интерес исследовать влияние соединения DSK-38, синтезированного под руководством проф. С.И. Коваленко на кафедре фармацевтической химии Запорожского государственного медицинского университета, на состояние оксидантно-антиоксидантного равновесия в ишемизированном головном мозге,
Цель данной работы - на модели экспериментального ишемического повреждения головного мозга охарактеризовать влияние соединения DSK-38 на ход оксидантно-антиоксидантных процессов в тканях мозга как возможного механизма защитного действия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проведены на 70 белых крысах-самцах массой 160-170 г. Острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) моделировали путем двусторонней перевязки общих сонных артерий. Через 1 ч после воспроизведения патологии начинали внутрибрюшинное (в/б) введение DSK-38 (10 мг/кг) и препарата сравнения - цитиколина (250 мг/кг) по аналогичной схеме в лечебном режиме - через 1 ч после воспроизведения ОНМК и дальше каждые 24 ч 1 раз/сут в течение 18 суток наблюдения. Оба вещества использовали в оптимальных церебропротекторных дозах, заимствованных из литературы [8, 10]. Контрольной группе в/б вводили изотонический раствор №С1 в эквивалентном объеме. Определение исследуемых продуктов оксидантно-антиоксидантных процессов проводили на 4 сутки (так как это конец ост-
рейшего периода - начало острого периода инсульта) и на 18 сутки (конец острого периода -начало раннего восстановительного периода ОНМК). Моделирование церебральной ишемии и вывод животных из эксперимента проводили в условиях пропофолового наркоза (60 мг/кг в/б).
Биохимические исследования выполнены в научно-исследовательской клинико-диагностической лаборатории ВНМУ им. М.И. Пирогова, сертифицированной МЗ Украины (свидетельство о переаттестации № 002/10 от 11 января 2010 г.).
Для биохимических исследований выделяли мозг крыс, перфузировали его холодным 1,15% раствором калия хлорида и гомогенизировали при 3000 об/мин (тефлон-стекло) в среде 1,15% калия хлорида (соотношение 1:3). Гомогенаты центрифугировали в течение 30 мин при 600 g, отбирали аликвоты постъядерного супернатанта в микропробирки Ерpendorf и к проведению исследований хранили при температуре -20оС.
Содержание в гомогенате мозга малонового диальдегида (МДА) определяли по реакции с ти-обарбитуровой кислотой [2], карбонильных групп белков (КГ) - по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином [7]. Активность СОД в гомогенате мозга оценивали по проценту торможения окисления кверцетина [4], а каталазы - по скорости деградации пероксида водорода [3]. Цифровые данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием ^критерия Стьюдента, изменения показателей считали достоверными при р<0,05 [6].
Результаты исследования приведены в таблице и рисунках.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Острое нарушение мозгового кровообращения сопровождается активацией процессов свободнорадикального окисления липидов в головном мозге, о чем доказательно свидетельствовало достоверное возрастание содержания вторичного продукта липопероксидации - МДА (рис. 1). На 4 и 18 сутки после двусторонней перевязки сонной артерии отмечалося статистически достоверное возрастание содержания МДА соответственно в 2,6 и 2,2 раза по сравнению с аналогичными показателями в группе псевдооперованных животных. Курсовое введение крысам с ОНМК соединения DSK-38, как и цитиколина, в течение 4 суток сопровождалось уменьшением содержания малонового диальдегида соответственно на 34,2 и 40,4% относительно группы контроля. Зато в условиях введения этих веществ в течение 18 суток снижения содержания малонового диальдегида по срав-
Рис. 1. Влияние DSK-38 и цитиколина на содержание малонового диальдегида (МДА) в мозге крыс при ОНМК (М ± т, п = 6).
Примечания: 1) * - р<0,05 относительно соответствующей группы псевдооперированных животных; 2) # - р<0,05 относительно соответствующей контрольной группы животных.
Рис. 2. Влияние DSK-3S и цитиколина на содержание карбонильных групп протеинов (КГП) в мозге крыс при ОHMК (M ± m, n = 6).
Примечания: 1) * - р<0,05 относительно соответствующей группы псевдооперированных животных; 2) # - р<0,05 относительно соответствующей контрольной группы животных.
нению с контролем было более выразительное и составило соответственно 46,8 и 54,1%, при этом его уровень приближался к таковому в группе псевдооперованных животных.
Наряду с активацией процессов свободнорадикального окисления липидов, ОНМК сопровождалось усилением окислительной деструкции белков в тканях головного мозга, доказательством чего служило достоверное повышение содержания карбонильных групп протеинов (КГП) (рис. 2). На 4 и 18 сутки эксперимента отмечалось увеличение уровня карбонильных групп протеинов соответственно на 65,1 и 53,1% по сравнению с псевдооперированные животными. Лечение крыс с ОНМК соединением DSK-38, как и цити-колином, способствовало достоверному ослаблению выраженности окислительной деструкции протеинов тканей головного мозга: на 4 сутки эксперимента уровень карбонильных групп достоверно уменьшился на 16,0 и 23,0%, а на 18 сутки - на 28,3 и 33,6% соответственно по сравнению с показателями в группе контрольных животных.
Поскольку одной из причин активации свободнорадикального окисления липидов и белков является дисбаланс в про- и антиоксидантных системах, мы оценили влияние ОНМК на активность антиоксидантных ферментов - супероксид-дисмутазы и каталазы в тканях головного мозга, а также ее изменения на фоне лечения веществами (табл. 1).
Нами установлено, что ишемическое поражение головного мозга сопровождалось достоверным падением активности супероксиддисмутазы (на 40,0 и 35,2% соответственно на 4 и 18 сутки эксперимента), что вело к накоплению цитоток-сического супероксидного анион-радикала. Наряду с этим отмечается снижение способности тканей головного мозга обезвредить пероксид водо-
рода в энзиматической реакции с участием ката-лазы (активность этого энзима уменьшается на 35,8 и 32,1% соответственно на 4 и 18 сутки эксперимента). На фоне лечения ОНМК исследуемыми веществами имело место уменьшение де-примирующих воздействий ишемического поражения головного мозга на активность антиокси-дантных ферментов. В частности, на 4 сутки после введения DSK-38, так же как и цитиколина, регистрировалось увеличение активности супе-роксиддисмутазы (на 23,9 и 33,1% соответственно) и каталазы (на 17,8 и 25,2% соответственно), относительно нелеченых животных. В то же время введение этих веществ в течение 18 суток показало более выразительное влияние на активность антиоксидантных ферментов: увеличение активности супероксиддисмутазы составляло 38,2 и 45,9%, а каталазы - 31,7 и 40,5% соответственно по сравнению с группой контроля. Таким образом острое нарушение мозгового кровообращения, индуцированное двусторонней перевязкой сонных артерий, сопровождается выраженными пертурбациями метаболических процессов в головном мозге крыс. Ишемическое поражение клеток головного мозга ассоциируется с развитием дисбаланса в про- и антиоксидантных системах (уменьшается активность СОД и каталазы), что сопровождается активацией процессов свободнорадикального окисления липидов (возрастает содержание МДА) и окислительной деградации белков (увеличивается уровень карбонильных групп протеинов). Таким образом, результаты проведенного исследования дают основание считать, что механизм защитного действия на ишемизированный мозг натриевой соли 4 - (2-оксо-3-метил-2Н-[1,2,4] триазин [2,3-с] хиназолин-6-ил) бутановой кислоты, как и цитиколина, в определенной степени связан с наличием у них антиок-
Таблица 1
Влияние DSK-38 и цитиколина на активность антиоксидантных ферментов в мозге крыс при остром нарушении мозгового кровообращения (M ± m, n = 6)
Показатели Срок эксперимента Псевдо- оперированные животные Острое нарушение мозгового кровообращения
Контроль без лечения Крысы, леченные DSK-38 в дозе 10 мг/кг Крысы, леченные Цитиколином в дозе 250 мг/кг
СОД, ус. ед/мг протеина 4 сутки 2,55±0,11 1,53±0,14* 1,89±0,07*# 2,03±0,15*#
18 сутки 2,58±0,08 1,67±0,14* 2,31±0,13# 2,44±0,07#
Каталаза, мккат/мг протеина 4 сутки 6,22±0,21 4,0±0,22* 4,71±0,11*# 5,0±0,35*#
18 сутки 6,40±0,16 4,35±0,36* 5,72±0,24*# 6,11±0,19#
Примечания: 1) * - р<0,05 относительно соответствующей группы псевдооперированных животных; 2) # - р<0,05 относительно соответствующей группы животных с острым нарушением мозгового кровообращения без лечения.
сидантного эффекта. По мнению авторов, не исключено, что антиоксидантный эффект, присущий DSK-3S, возможно, связан со способностью данного соединения быть «ловушкой» АФК, а также - восстанавливать равновесие в про-антиоксидантной системе, что требует дальнейшего более глубокого изучения. Из полученных результатов вытекают следующие выводы:
1. Курсовое (^-дневное) введение крысам с ОHMК DSK-3S (10 мг/кг в/б), так же как и цити-колина (250 мг/кг в/б), способствует нормализации оксидантно-антиоксидантного гомеостаза в ишемизированном мозге.
2. ^ фоне действия соединения DSK-3S и цитиколина на 4 сутки эксперимента имеет место уменьшение содержания МДА соответственно на 34,2 и 40,4% и в течение 1S суток на 46,S и 54,1% соответственно относительно группы контроля.
3. Использование DSK-3S, как и цитиколина, повышает активность антиоксидантных ферментов: на 4 сутки эксперимента регистрируется увеличение активности супероксиддисмутазы на 23,9 и 33,1% и каталазы на 17,S и 25,2% соответственно, а на 1S сутки наблюдения активность супе-роксиддисмутазы составила 3S,2 и 45,9%, а ката-лазы - 31,7 и 40,5% соответственно по сравнению с группой контроля.
4. Соединение DSK-3S, как и цитиколин, ослабляет выраженность окислительной модификации белков тканей головного мозга: на 4 сутки эксперимента уровень карбонильных групп достоверно уменьшился на 16,0 и 23,0%, а на 18 сутки - на 2S,3 и 33,6% соответственно по сравнению с показателями в группе контрольных животных.
5. Перспективным для исследования следует считать подтверждение полученных данных морфологическими методами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беленичев И.Ф., Левицкий Е.Л., Губский Ю.И., Коваленко С.И., Марченко О.М. Антиоксидантная система защиты организма (обзор) // Лекарства. -2002. - № 3. - С. 9-13.
2. Владимиров Ю.В., Aрчаков A.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М. : Шука, 1972. - 252 с.
3. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
4. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцитина // Вопр. мед. химии. - 1990. - № 2. - С. 88-91.
5. Куровская В.А., Тимофийчук И.Р. Перекисное окисление липидов в гиппокампе крыс при ишемии-реперфузии головного мозга и ввода 1-аргинина // Буковинский медицинский вестник. -2010. - Т. 14, № 1 (53). - С. 124-127.
6. Лапач С.Н., Чубенко А. В., Бабич П.Н. Статистика в науке и бизнесе: Практическое руководство. -К.: Морион, 2002. - 640 с.
7. Способ определения карбонильных соединений в сыворотке крови : заявка № 58110 Украина, МПК 7 А61К35/16 / С.В. Шевчук, А.А Пентюк, Г.А. Мусин, Н.В. Заичко. - № 2002107890; заявлено 04.10.2002; опубл. 15.07.2003; Бюл. № 7. - 2 с.
8. Степанюк Г.И., Семененко Н.А., Коваленко С.И., Скорина Д.Ю., Семененко С.И. Оценка церебро-протекторного действия производных (3-Я-2-оксо-2Н-[1,2,4] триазин [2,3-с] хиназолин-6-ил) карбоновых кислот на модели острого нарушения мозгового кровообращения у крыс // Фармакология и лекарственная токсикология. - 2011. - № 6 (25). -С. 22-26.
9. Трофимова С.А., Балунов А.А., Дубина Е.Е. Окислительный стресс в больных в постинсультном периоде // Неврологический вестник. - 2007. - № 1 -С. 31-36.
10. Ходаковский А.А. Оценка влияния экспериментальной терапии адемолом на интенсивность протекания деструктивных изменений в мембранах нейронов у монгольских песчанок в условиях острой церебральной ишемии // Вестник морфологии. - 2011. - Т. 17, № 1. - С. 62-65.
11. Chan P.H. Role of oxidants in ishemic brain damage // Stroke. - 2006. - Vol. 27. - P. 1124-1129.
12. Filho A.C., Hot'finann M.F., Meneghimii R. Cell killing and DNA damage by hydrogen peroxide are mac-dialed by intracellular iron // J. Biochein. - 2010. -Vol. 218. - Р. 273-275.
13. Sureda F.X., Gabriel C., Comas J., Pallàs M., Es-cubedo E., Canarasa J., Canins A. Evaluation of free radical production, mitochondrial membrane potential and cytoplasmic calcium in mammalian neurons by flow cytometry // Brain Res. Brain Res. Protoc. -2009. - Vol. 4. - P. 280-287.
