CC BY
41
УДК: 579.017.8
ВЛИЯНИЕ НАНОКОМПОЗИТА СЕЛЕНА НА CLAVIBACTER MICHIGANENSIS виВБР. SEPEDONICUS В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОДЕРЖАНИЯ УГЛЕВОДОВ В СРЕДЕ
А.И. Перфильева1'2, А.В. Папкина2, Г.Б. Боровский2, Б.Г. Сухов3, И.А. Граскова2, Б.А. Трофимов3
Иркутский государственный технический университет, 664074, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83, [email protected] 2Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН,
664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132 3Иркутский институт химии СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Фаворского, 1
Исследовали пищевую зависимость жизнеспособности бактерий Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) - возбудителя кольцевой гнили картофеля от содержания углеводов в среде инкубации. Выявлена зависимость интенсивности роста бактерий от концентрации глюкозы в растворе культивирования. Наибольший прирост бактерий наблюдался при концентрации глюкозы 10 г/л. При добавлении в среду инкубации нанокомпозита селена (концентрация селена 1,23%), содержащего арабиногалактановую оболочку, наблюдалось значительное понижение жизнеспособности бактерий, что объясняется токсичным действием нанокомпозита. Cms поглощали нанокомпозит вне зависимости от содержания глюкозы в растворе инкубации, что может быть объяснено патогенной природой данного микроорганизма. Табл. 3. Библиогр. 9 назв.
Ключевые слова: clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus; глюкоза; нанокомпозит; селен; жизнеспособность.
INFLUENCE OF SELENIUM NANOCOMPOSITE ON CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. SEPEDONICUS DEPENDING ON THE CONTENT OF CARBOHYDRATES IN THE ENVIRONMENT
A.I. Perfileva1'2, A.V. Papkina2, G.B. Borovsky2, B.G. Sukhov3, .I.A. Graskova2,
B.A. Trofimov3
Irkutsk State Technical University 83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia, [email protected]
2 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, 132, Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia;
Irkutsk Institute of chemistry, 1, Favorskogo St., Irkutsk, 664033 Russia.
Investigated food dependence of viability of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) - the activator of potatoes ring decay from the content of carbohydrates in the environment of incubation. Dependence of bacteria growth intensity on glucose concentration in cultivation solution is revealed. The greatest gain of bacteria was observed at concentration of glucose of 10 g/l. Arabinogalactan covered selenium nanocomposite to be added to incubation medium (concentration of selenium was of 1,23%) reduced bacteria viability considerably, that can be explained by toxic action of nanocomposite.
Cms absorbed nanocomposite regardless of the glucose content in incubation solution that, can be explained probably by the pathogenic nature of this microorganism.
3 tables. 9 sources.
Key words: clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, glucose, nanocomposite, selenium, viability.
ВВЕДЕНИЕ
Потребление углеводов - одна из важнейшей пищевых потребностей бактерий. [1]. Большинство бактерий предпочитают в качестве источника углеводов моносахара: сахарозу, глюкозу, фруктозу [2], лактозу. Пищевую зависимость бактерий от источника углеводов можно использовать при регулировании их численности. Для этих целей могут применяться конструкции, состоящие из вещества, обладающего бактерицидным эффектом, погруженного в углеводную оболочку. Примером такой конструкции является нанокомпозит селена, представляющий собой комплекс, состоящий из мо-
лекулы селена, находящейся в арабиногалак-тановой оболочке [3]. Арабиноглактан является полисахаридом, выделяемым из растений рода лиственничных, состоящий из остатков двух моносахаридов: галактозы и арабинозы [4]. Предположительно, поглощение нанокомпозита бактерией будет осуществляться благодаря арабиногалактановой оболочке, что в дальнейшем приведет к непосредственному поглощению молекулы селена, обладающей токсическим эффектом на бактерии. Известно, что наночастицы селена обладают бактерицидным действием, например, подавляют рост золоти-
стого стафилоккока Staphylococcus aureus [5].
В качестве объекта для исследования нами была выбрана грамположительная фито-патогенная бактерия Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) с аэробным метаболизмом. Cms является возбудителем кольцевой гнили картофеля [6]. Данный микроорганизм обитает в клубнях, где источником углевода для Cms является полисахарид крахмал. Для культивирования Cms в лабораторных условиях известны питательные среды с добавлением глюкозы [7]. Однако отсутствует информация о зависимости жизнеспособности Cms от концентрационного содержания глюкозы в среде. Также интересно, при какой концентрации глюкозы в среде бактерии Cms начнут поглощать нанокомпозит. В связи с этим целью настоящей работы являлось изучение влияния нанокомпозита на бактерии Cms в зависимости от содержания глюкозы в среде инкубации.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследования проводились на бактериях Cms штамм Ас-1405, получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Москва). Бактериальную культуру выращивали на скошенном агаре в пробирках на твердой среде рН 7.0, содержащей диализат дрожжевого экстракта («Sigma», США) 10 г/л, глюкозу 15 г/л, агар-агар («Биотехновация», Россия) 10 г/л, 5 г СаСО3/л («Реахим», Россия). Бактерии культивировали в термостате, в темноте при температуре 25°С. Для опытов бактерии помещали в физиологический раствор с содержанием глюкозы: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 г/л как с добавлением нано-композита селена (1,23 %), так и без них. Бактерии культивировали на качалке (80 об./мин) при температуре 25 °С в темноте. Ежесуточно производили измерение оптической плотности бактерий при длине волны 595 нм и осуществляли высев на твердую среду. Спустя 7 суток контролировали количество колониеобразую-щих единиц (КОЕ).
Полученные результаты были статистически обработаны с использованием пакета программ MS Excel.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Для выявления пищевой зависимости Cms от содержания углеводов в среде нами была проведена серия экспериментов по культивированию Cms в физиологическом растворе с различным содержанием глюкозы. Данные настоящего эксперимента позволят выявить необходимую концентрацию сахаров в обедненной среде (физиологический раствор) при которой бактерии могут существовать. После
истощения этого запаса углеводов они могут переключиться на поглощение арабиногалакта-на, входящего в состав нанокомпозита.
Бактерии помещали в физиологический раствор с содержанием глюкозы: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 г/л. Ежесуточно в течение 10 дней производили измерение оптической плотности бактерий при длине волны 595 нм (табл. 1 ).
В качестве контроля был взят физиологический раствор без глюкозы. Согласно полученным результатам (табл. 1), в контрольном варианте наблюдалось снижение жизнеспособности бактерий уже после трех суток инкубации. В вариантах с добавлением глюкозы в физиологический раствор 5 г/л, 15 г/л, 20 г/л, 25 г/л и 30 г/л снижение жизнеспособности отмечалось на 6-е сутки культивирования. При добавлении в физиологический раствор 10 г/л глюкозы отмечался наибольший прирост бактерий. Логарифмическая фаза длилась 6 суток, на восьмые сутки культура начинала отмирать.
Таким образом, наблюдалась зависимость интенсивности роста бактерий от концентрации глюкозы в среде инкубации. Предполагается, что нанокомпозит может конкурировать с глюкозой в качестве источника углевода для бактерий, либо после истощения глюкозы в культу-ральной жидкости бактерии начнут использовать в пищу нанокомпозит. В составе наноком-позита помимо углеводной молекулы арабино-галактана имеется молекула селена, обладающая бактерицидным действием.
В серии следующих экспериментов исследовали влияние нанокомпозита селена на интенсивность роста бактерий Cms в зависимости от содержания глюкозы в растворе инкубации. Бактерии помещали в физиологический раствор с различным содержанием глюкозы: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 г/л, далее вносили водный раствор нанокомпозита селена (концентрация 1,23 %). Ежесуточно в течение 7 дней производили измерение оптической плотности бактерий при длине волны 595 нм (табл. 2) и высев бактерий для определения жизнеспособности по КОЕ (табл. 3).
Согласно полученным результатам, при добавлении нанокомпозита Se с арабиногалак-таном, полученным из SeO2 (1,23 % Se) отмечалось снижение жизнеспособности бактерий во всех вариантах, за исключением 5 г/л глюкозы, в этом варианте обработки наблюдается даже стимуляция роста Cms, далее идет постепенное снижение количества клеток (табл. 2.)
Низкая оптическая плотность бактерий в варианте с нанокомпозитом может быть объяснена быстрым поглощением агента. По-видимому, бактерии способны активно погло-
3 ■О
>
I
>
iQ
01 s о
X
01 s
0 ч m X
1
о ^
о
Влияние содержания глюкозы в физиологическом растворе на прирост бактерий Cms
Таблица 1
С. Оптическая плотность, у. е. (длина волны 595 нм)
Физ. р-р Б/гл Физ. р-р + 5 г/л гл Физ. p-p + 10 г/л гл. Физ. p-p + 15 г/л гл. Физ. p-p + 20 г/л гл. Физ. p-p + 25 г/л гл. Физ. p-p + 30 г/л гл.
1 0,112 ± 0,011 0,163 t 0.022 0,184 tO.007 0.166 tO,025 0.159 tO.012 0.193 tO.055 0.192 ± 0,024
2 0.098 t 0.00& 0,166 t 0.032 0,187 tO.006 0.156 tO.030 0,146 tO.001 0.187 tO.041 0.176 tO.012
3 0,111 ± 0,024 0,212 t0.051 0,220 t 0,012 0.194 tO.033 0.183 tO.001 0.207 tO.065 0,233 t 0.016
4 0.080 ± 0,022 0,181 t 0.043 0,177 tO.001 0.173 tO.032 0,162 tO.001 0.178 tO.057 0.200 t 0.004
5 0.068 tO,023 0,183 t 0.045 0,220 t 0,001 0.206 t 0,026 0,197 tO.004 0,201 t 0.041 0.192 ± 0.004
6 0.066 ± 0,022 0,173 t 0.038 0,300 t 0.120 0,209 t 0,023 0.191 t 0.011 0,209 tO.055 0.205 ± 0.009
7 0.058 t0,024 0,179 tO.032 0,305 tO 139 0.183 tO.016 0.182 ± 0.012 0.209 t 0.055 0.195 ± 0.001
& 0.055 t0,021 0,152 tO. 027 0,241 i 0.096 0.153 tO,020 0.158 ± 0.009 0.179 tO.038 0.161 t 0.004
9 0.031 t 0,015 0,148 tO.014 0,250 t 0,104 0.172 ± 0.065 0,145 ± 0.004 0.160 t 0.030 0.154 t 0.015
10 0.039 t0.019 0,161 t 0.019 0,258 i 0.102 0.205 ± 0.086 0,161 t 0.011 0.179 tO.061 0.170 t 0.012
Примечание. С. - сутки инкубации; Физ. р-р - физиологический раствор; гл. - глюкоза.
Таблица 2
C. Оптическая плотность, у. е. (длина волны 595 нм)
Физ. р-р Б/гл Физ. p-p + 5 г/л гл Физ. p-p + 10 г/л гл. Физ. p-p + 15 г/л гл. Физ. p-p + 20 г/л гл. Физ. p-p + 25 г/л гл. Физ. p-p + 30 г/л гл.
0 0.047 tO,013 0.036 tO.017 0,045 i 0.013 0.077 tO.013 0.065 tO,027 0.041 t 0.031 0.054 ± 0.012
2 0.037 tO.007 0.058 tO.010 0.039 tO.003 0.046 tO.011 0.041 t 0.007 0.027 tO.007 0.031 t 0.001
5 0.047 tO,019 0,043 t 0.017 0.033 i 0.011 0.034 ± 0.010 0.029 tO.004 0.023 tO.008 0.038 ± 0.004
7 0.045 tO.008 0.050 t 0,013 0.040 t 0,017 0,046 t 0,022 0,040 t 0.011 0,028 ± 0.005 0,052 ± 0.016
Примечание. С. - сутки инкубации; Физ. р-р - физиологический раствор; гл. - глюкоза.
Таблица J
c. Колониеобразующая способность /10 мкл культуральной среды
Физ. р-р б/гл. Физ. р-р + 5 г/л гл Физ. р-р + 10 г/л гл. Физ. р-р + 15 г/л гл. Физ. р-р + 20 г/л гл. Физ. р-р + 25 г/л гл Физ. р-р + 30 г/л гл.
0 1575,333 i 792,778 1833.667 t 314.038 941,666 t 340.426 3827.667 ± 2709,519 5186,333 ± 2490.128 1743.333 ± 626,923 2509,667 ± 880,108
2 724,500 i120:915 3,000 t 5,196 - - - 157,500 1222,738 42,000 t 36,373
5 - - - - - - -
7 - - - - - - -
§
DO гп
0
1
DO
S §
I
So
I
X СП X
0
! §
1
l\J
о
-л
Со §
КЗ
3
Примечание. С. - сутки инкубации; Физ. р-р - физиологический раствор; гл. - глюкоза.
щать арабиногалактан, находящийся в составе нанокомпозита, в не зависимости от количества глюкозы в среде. Снижение количества бактерий может быть связано с непосредственным потреблением селена. Настоящее предположение подтверждается также результатами, полученными методом высевов (табл. 3).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, результаты, представленные в настоящей работе, свидетельствуют о том, что бактерии Cms не являются узкоспециализированными по источнику углевода. По-видимому, это объясняется патогенной природой данного микроорганизма. Известно, что
бактерии Cms обнаруживались не только в картофеле, но и в растениях сахарной свеклы [8], пшеницы, ячменя, овса, кукурузы, бобов, фасоли и гороха, а также в сорняках [9]. Возможно, Cms способен утилизировать не только крахмал и глюкозу, но и другие углеводы, в том числе и арабиногалактан. Результаты по влиянию нанокомпозита на оптическую плотность и КОЕ свидетельствуют о наличии бактерицидного эффекта у нанокомпозита в не зависимости от концентрации глюкозы в среде инкубации. Полученные данные подтверждают возможность использования нанокомпозита селена в качестве агента для оздоровления клубней картофеля от возбудителя кольцевой гнили Cms.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М.: Академия, 2003. 464 с.
2. Стоддарт Дж. Стереохимия углеводов. М.: Мир, 1975. 304 с.
3. Новый метод синтеза диселенофосфинатов / Б.А. Трофимов [и др.] // Доклады Академии наук. 2009. Т. 428, № 3. С. 338-341.
4. Дудкин М.С., Громов В.С. Гемицеллюлозы. Рига: Зинатне, 1991. 488 с.
5. Tran P., Webster T. Selenium nanoparticles inhibit Staphylococcus aureus growth // International Journal of Nanomedicine. 2011. № 6. P. 1553-1558.
6. Eichenlaub R., Gartemann K.H. The Clavibacter michiganensis subspecies: molecular investigation of gram-positive bacterial plant pathogens // Annu. Rev. Phytopathol. 2011. V. 49. P. 445-64.
7. Калач В.И., Жукова М.И., Ильяшенко Д.А., Ерчик В.М., Романович А.С., Криштофик Л.Д. Методические указания по локализации и ликвидации бактериальной кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicum (Spieckermann and Kotthoff) Davis et al. Самохваловичи: научн.-практ. центр НАН Белоруссии по картофелеводству и плодоовощеводству, 2010. 12 с.
8. Bugbee W.M., Gudmestad N.C. The recovery of Corynebacterium sepedonicum from sugarbeet seed // Phytopathology. 1988. V. 78. P. 205-208.
9. Fate of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, the causal organism of bacterial ring rot of potato, in weeds and field crops / Van der Wolf J.M. [et al.] // J. Phytopathol. 2005. V. 153. № 6. P. 358-365.
Поступило в редакцию 20 декабря 2013 г.
