CC BY
56
ВЛИЯНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПОКРЫТИЙ ТИТАНОВЫХ ИМПЛАНТАТОВ НА КЛЕТКИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА
Н.Г. Плехова 1, И.М. Ляпун 2, Е.В. Пустовалов 3, Е.В. Просекова 1, С.В. Гнеденков 4, СЛ. Синебрюхов 4, А.В. Пузь 4
1 Тихоокеанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ, Владивосток, Россия
2 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова РАН, Владивосток, Россия
3 Дальневосточный государственный федеральный университет, Владивосток, Россия
4 Институт химии Дальневосточного отделения Российской академии наук, Владивосток, Россия
Effect of modified coatings titanium implants on innate immunity cell
N.G. PlekhovaI.N. Lyapun 2, E.V. Pustovalov 3, E.V. Prosekova 1, S.V. Gnedenkov 4, S.L. Sinebryukhov 4, AV. Puz 4
1 Pacific State Medical University, Vladivostok, Russia
2 G.P. Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology of RAS, Vladivostok, Russia
3 Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russia
4 Institute of Chemistry of the Far-Eastern Branch of RAS, Vladivostok, Russia
Цель исследования — охарактеризовать ультраструктуру и функциональную активность (метаболизм и продукцию цитокинов) клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов, макрофагов) при контакте с новыми антикоррозионными остеоиндуктивными покрытиями, нанесенными на титан марки ВТ1-0.
После контакта клеток с титаном без покрытия, с кальций-фосфатным покрытием, нанесенным методом плазменного электролитического оксидирования (ПЭО), и с ПЭО-покрытием, в состав которого входил гидроксиапатит, оценивалась, адгезия клеток, их морфология, метаболизм и продукция нейтрофилами и макрофагами цитокинов.
Установлено, что наиболее плотный контакт клеток отмечался в отношении покрытия, содержащего гидрокси-апатит, тогда как адгезия клеток к поверхности титана без и с кальций-фосфатным ПЭО покрытием, была значительно ниже. Определение активности ферментов показало максимальную стимуляцию метаболизма клеток в течение первого часа контакта с покрытиями, в дальнейшем, в отличие от клеток, контактировавших с титаном, эти показатели снижались. Наиболее выраженная стимуляция антиоксидантной защиты клеток обнаружена при контакте с покрытием, включающем гидроксиапатит. Наименьшим иммуностимулирующим воздействием обладало кальций-фосфатное покрытие, о чем свидетельствовали показатели продукции клетками тканевых медиаторов — катионных белков, про- и противовоспалительных цитокинов.
Из полученных результатов следует, что покрытия титана, сформированные методом ПЭО, оказывают корригирующее влияние на функциональное состояние клеток врожденного иммунитета.
Ключевые слова: имплантаты, титан, плазменное электролитическое оксидирование, биоактивность, клетки врожденного иммунитета, ферменты, цитокины.
The aim of the investigation was to investigate of the functional state effector inflammatory cells (macrophages, neutrophils) in contact with new anti-corrosion osteoinductive coatings deposited on titanium BT1-0.
The architectonics of cellular surface, morphology, metabolism and production of cytokines by neutrophils and macrophages in their contact with titanium without coating, with the calcium phosphate coated on titanium deposited by plasma electrolytic oxidation (PEO) and PEO-coated with hydroxyapatite were studied.
It was established that the most active cells adhered to the surface of the hydroxyapatite-coated titanium, while for titanium without and with calcium-phosphate PEO coated the number of these cells was significantly lower. The study of enzymes showed maximum of stimulation cellular metabolism during the first hour of contact with the coating, further, indicators of enzyme activity decreased in contrast to cells contacted with titanium. The most marked stimulation of the cellular antioxidant protection were detected in contact with a hydroxyapatite-coating. Meanwhile, the calcium-phosphate coating showed lowest immunostimulatory effect, as evidenced by indicators of tissue mediator production: cationic proteins, pro- and anti-inflammatory cytokines.
The coatings of titanium formed by PEO have a corrective effect on the functional state of innate immune cells reducing inflammation that develops at the foci of implant introducing.
Keywords: implants, titanium, plasma electrolytic oxidation, activity, innate immune cells, enzymes, cytokines.
Введение
К числу наиболее оптимальных материалов для изготовления хирургических имплантатов, используемых в травматологии, относят титан [1, 2]. Однако при длительном нахождении в организме под влиянием окружающей среды изменяется химический состав имплантата и для повышения механической прочности и коррозионной устойчивости используется легирование титана различными металлами [3, 4]. С другой стороны, наличие токсичных ионов в составе легированного титана может вызывать
e-mail: pl_nat@hotmail.com
аллергические реакции, которые проявляются в виде асептического воспаления [5, 6]. При нанесении на титановые сплавы биосовместимых покрытий улучшаются физико-химические характеристики поверхности, повышается износоустойчивость и инертность в отношении биологических жидкостей организма, а также изменяются иммуномодулирующие свойства имплантатов [7—10].
Реакция организма на внедрение чужеродного материала основана на каскаде событий, характерных для воспаления, как правило, сопровождаемого
активацией и хоумингом иммунокомпетентных клеток в зону имплантации [10—12]. Хемотаксис клеток врожденного иммунитета, а именно, нейтрофилов и макрофагов к месту асептического воспаления, инициированного контактом имплантата с окружающими тканями, протекает очень быстро и через 6—12 ч. наблюдается формирование выраженного лейкоцитарного вала, где отмечается массированная гибель клеток и развивается ацидоз. Адгезивные и неадгезивные проявления реактивности клеток в отношении имплантата и адсорбция межтканевых белков на его поверхности стимулируют синтез биологически активных веществ [13]. Продукты секреции и распада нейтрофилов, такие как коллагеназы, эластазы, нейтральные протеазы и цитокины, оказывают влияние на хемотаксис других ключевых регуляторных клеток воспаления [14, 15]. В свою очередь, макрофаги, фагоцитируя продукты распада тканей и имплантируемого материала, отграничивают инородное тело, в результате последовательно формируются барьеры из иммунокомпетентных клеток, предшествующие образованию грануляционной ткани [16, 17]. Таким образом, роль инициирующих воспаление нейтрофилов и макрофагов, как антигенпрезенти-рующих клеток, является важной в определении биосовместимости имплантируемых материалов. Опосредовано, через продукцию мессенджеров, они оказывают воздействие на другие клеточные элементы процесса воспаления и репарации тканей, осуществляя контроль над процессом пролиферации фибробластов и синтезом ими белков внеклеточного матрикса [18].
Цель исследования — охарактеризовать ультраструктуру и функциональную активность (метаболизм и продукцию цитокинов) клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов, макрофагов) при контакте с новыми антикоррозионными остеоиндуктивны-ми покрытиями, нанесенными на титан марки ВТ1-0.
Материал и методы
В работе использовали технически чистый титан марки ВТ1-0 (содержание примесей: Ре 0,25; 0,12; С 0,07; О 0,12; N 0,04 и Н 0,01%,) (Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, Россия). Покрытия наносили на образцы размером 15x20x2 мм, подвергнутые предварительной механической обработке до уровня шероховатости Па = 0,12 мкм. После шлифовки образцы промывали в дистиллированной воде, поверхность обезжиривали спиртом. Плазменное электролитическое оксидирование (ПЭО) проводили в электролите, содержащем 30 г/л глицерофосфата кальция, (С3И706Р)Са-2И20, и 40 г/л ацетата кальция, Са(СИ3С000)2-И20 (Компонент-Реактив, Россия), рН электролита доводили до значений 10,9—11,3 посредством добавления 20% раствора №0Н. В качестве источника тока использовали реверсивный тиристорный агрегат (Флерон, Россия). Частота поляризующих импульсов составляла 300 Гц при контроле с помощью автоматизированной системы управления, сопряженной с компьютером, оснащенным соответствующим программным обеспечением. Плазменное электролитическое оксидирование образцов проводили при плотности тока 0,67 А/см2 в течение 300 сек., при этом конечное напряжение на аноде достигало 540 В.
Фазовый состав поверхностных слоев определяли на рентгеновских дифрактометрах ДР0Н-2,0 (НПП Буревестник, Россия) и D8 Advance (Cu/K^-излучение) (Brucer, Великобритания) по методу Брегга-Брентано. Относительное содержание фаз в покрытии оценивали по отношению интенсивностей самых сильных линий. При выполнении рентгенофа-зового анализа использована программа поиска EVA с банком данных PDF-2 для порошковых образцов.
Эксперименты проводили с образцами покрытий, включающих кальций и фосфор (Са и Р) и гидрокси-апатиты Ca.n(PO .L(OH)„ (Fluka, США) на титановой
10 4 b 2
подложке.
В работе использовали следующие образцы титана: без покрытия — Ti 1; титан с кальций-фосфатным ПЭО-покрытием Ca/P = 1.1 — Ti 2; титан с ПЭО-покры-тием, обработанным в 20% растворе NaOH, в состав которого входил гидроксиапатит Ca/P = 1.1 — Ti 3. Полученные образцы перед применением стерилизовали в сухожаровом шкафу (ТермоЭлектрон, Германия) при 180°С в течение 15 мин., что соответствовало правилам стерилизации медицинских изделий, при этом проводили контроль поверхностных свойств образцов.
Первичную культуру нейтрофилов и макрофагов получали из перитонеальной полости беспородных белых мышей, которым предварительно за 18 ч. для инициации асептического воспаления вводили 5 мл стерильного 1% мясопептонного бульона (BioRad, США). Все процедуры выполняли в соответствии с международными правилами обращения с животными (National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publications No. 80023, 199b).
Концентрацию клеток доводили до 4x10b кл/мл в среде RPMI (Sigma-Aldrich, США) с 5% фетальной бычьей сывороткой (ICN Biomedicals, США), разливали во флаконы с покровными стеклами (контроль) и образцами. После 40 мин. инкубации в термостате при 37°С в смешанной атмосфере с 5% С02 неадгезированные клетки дважды отмывали средой RPMI и монослой клеток оставляли в среде RPMI, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки, 2 мкМ глутамина и 0,2 мкМ гентамицина (ICN, США). Контроль культуры осуществляли с помощью фазово-контрастной микроскопии, процентное содержание нейтрофилов и макрофагов составило 48±4,2 и 3b±2,7% соответственно, согласно морфологической верификации ядер.
Для изучения адгезии клеток к испытуемым образцам после контакта в течение 10, 15, 30, 45 мин.; 1,5, 2, 3, 4, 8, 18, 24 и 48 ч. отбирали надосадок, а образцы помещали на лед для снятия монослоя. Надосадочную жидкость и отдельно суспензию клеток, полученную путем отмывания монослоя холодным раствором Хенкса (200 мкл, ICN, США), вносили по 100 мкл в пять лунок иммунологического плоскодонного планшета на каждую временную точку, оставляли на 40 мин. в термостате при 37°С в смешанной атмосфере с 5% С02. Затем удаляли надосадочную жидкость, монослой клеток фиксировали и добавляли 100 мкл красителя по Нохт — Максимову (0,1% эозина и 0,1% азура). Контроль полного отмывания красителя осуществляли визуально, под инвертированным микроскопом (Nikon, Япония). Окрашенные клетки разрушали путем внесения 100 мкл изопропилового спирта, содержащего 0,04 М HCl, с инкубацией на термошейкере (BioRad, США)
при 37°С и измеряли оптическую плотность субстратов на иммунологическом анализаторе «Multiskan FC» (Thermo Fisher Scientific, Финляндия) при длине волны 650 нм.
Для определения активности АТФазы и 5"-ну-клеотидазы в лунки планшета к адгезированным клеткам добавляли 20 мкл субстрата для АТФазы, содержащего 8 мг АТР (Sigma-Aldrich, США) на 1 мл трис-НС1-буфера (рН 7,8), включавшего 87 мг NaCl, 28,7 мг KCl, 52 мг MgCl2 6 H2O, и 20 мкл субстрата для 5"-нукпеотидазы, содержащего 4 мг АМФ (Sigma-Aldrich, США) на 1 мл трис-НО-буфера (рН 7,8), включавшего 87 мг NaCl и 70 мг MgCl2, и оставляли при комнатной температуре на 30 и 60 мин., соответственно. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл смеси аскорбиновой и молибденовой кислот в соотношении 1:1. Через 20 мин. оптическая плотность субстратов измерялась на анализаторе «Multiskan FC» при длине волны 620 нм.
Определение активности сукцинатдегидрогена-зы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) проводили методом Лойда в собственной модификации [19]. В лунки планшета с адгезированными клетками добавляли по 100 мкл субстрата для выявления СДГ, содержащего 2 мг/мл метилтиазолилтетразолий бромид (3-[4,5-диметилтиазолил-2]-2,5-дифенил тетразолиум бромида (Sigma-Aldrich, США) на основе фосфатного буфера (рН 7,2) с 0,4% MnCl2, а для определения ЛДГ субстрат, содержащий 2 мг/мл йоднитротетразолия (Sigma-Aldrich, США) на основе указанного выше буфера, и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Клетки с включенными гранулами диформазана разрушали внесением 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,04 М HCl, в течение 20 мин. Оптическую плотность субстратов измеряли на спектрофотометре при длине волны 540 нм для СДГ и 650 нм для ЛДГ.
Для определения активности миелоперокси-дазы (МПО) в лунки планшета с монослоем клеток вносили 100 мкл субстрата, содержащего 4 мг o-фенилиндиамина (Sigma-Aldrich, США) на основе фосфатно-цитратного буфера (рН = 5,0), включающего 0,33% перекиси водорода, оставляли на 10 мин. при комнатной температуре. Реакцию останавливали внесением 100 мкл 10% серной кислоты и измеряли оптическую плотность субстратов на анализаторе «Multiskan FC» при длине волны 492 нм.
Для определения количества неферментных кати-онных белков в лунки планшетов с адгезированными клетками вносили 50 мкл раствора 1 мг/мл красителя зеленого прочного (Sigma-Aldrich, США) в метаноло-вом трис-буфере (pH = 8,2), оставляли на 30 мин. при 37°С и трижды отмывали монослой фосфатно-солевым буфером. Контроль полного отмывания красителя осуществляли визуально, под инвертированным микроскопом. Включенный в клетки краситель растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида (Sigma-Aldrich, США), предварительно разогретого до 800С и измеряли оптическую плотность субстратов на спектрофотометре при длине волны 620 нм.
Определение активности ферментов и содержание неферментных белков выполняли на одинаковом количестве образцов — пять показателей на одну временную точку. Результаты спектрофотометриче-ского исследования выражали в виде индекса стимулирования в процентах (Т), который вычислялся как отношение разности между средними показателями оптической плотности растворов, содержащих про-
дукты реакции клеток, контактировавших с образцами и со стеклом (контроль), к среднему показателю оптической плотности раствора для клеток, после контакта со стеклом. Таким образом, контроль был принят за 0.
С помощью метода «сэндвич» ELISA (иммунофер-ментный твердофазный анализ) определяли уровень провоспалительных цитокинов — TNF-a, RANTES, IL-ip и противовоспалительных цитокинов — IL-6, IL-10, IL-12 p40/p70. Согласно протоколам наборов Mouse ELISA Kit (Abcam, США), проводили количественное определение цитокинов в супернатантных культу-ральных жидкостях. Образцы в двух разведениях и серийные разведения калибровочных проб вносили по 100 мкл в лунки иммунопланшета с нанесенными субстратами для каждого цитокина, оставляли при температуре +4°С на 18 ч., после чего трижды промывали фосфатно-буферным раствором с трило-ном. Далее в каждую лунку вносили по 100 мкл био-тилизированных антител против цитокинов, инкубировали при комнатной температуре 30 мин., удаляли супернатант, трижды промывали ФСБ, добавляли по 100 мкл раствора стрептовидина, повторяли этапы отмывания, вносили конъюгат и о-фенилендиамин и инкубировали 25—30 мин. при комнатной температуре. Остановку реакции осуществляли добавлением 50 мкл стоп-реагента на каждую лунку. Результаты анализа регистрировали фотометрически при длине волны 450 нм. По данным измерения строили калибровочный график и определяли концентрацию цитокинов.
Для изучения ультраструктуры с помощью сканирующего электронного микроскопа монослой клеток обрабатывали комплексным фиксатором по Ито. Постфиксацию осуществляли в 1% растворе четырехокиси осмия, обезвоживание — в растворах ацетона восходящей концентрации, после чего производили покрытие клеток углеродом методом термического испарения в вакууме. Изображения образцов были получены на электронном микроскопе Ultra 55 (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 0,8—1 кВ.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel. Оценивали средние значения и стандартные ошибки средних значений. Статистическую значимость различий показателей контрольных и экспериментальных групп проверяли в зависимости от соответствия закону нормального распределения по U-критерию Манна — Уитни и t-критерию Стьюдента (уровни значимости: 0,05 и 0,01).
Результаты и обсуждение
Разработанный способ формирования покрытий с использованием метода ПЭО позволяет нанести на титановую основу кальций-фосфатные биоактивные покрытия, содержащие в своем составе достаточное количество кальция и фосфора в их соотношении — Ca/P = 1.1, которое по величине сопоставимо с таковым в костной ткани (1.67). Согласно данным рентгенофазового анализа в состав поверхности входили гидроксиапатит и фосфаты кальция (рис. 1). После оценки морфологии покрытий методами электронной и оптической микроскопии можно сделать вывод, что поверхность развитая, имеет поры, наличие которых благоприятно для врастания в них костной ткани и формирования более прочного соединения имплантата с костью (рис. 2А, Б).
Рис. 1. Дифрактограмма поверхности образца ВТ1-0 с покрытием, полученным в глицерофосфат-ацетатном электролите, обработанном в 20% растворе 1\1аОН (образец Т 3)
Рис. 2.
Поверхность (А) и поперечный шлиф (Б) покрытия, полученного в глицерофосфат-ацетатном электролите, обработанном в 20% растворе 1\1аОН (образец Т 3). Сканирующая электронная микроскопия
Важное значение для биосовместимости изучаемых покрытий имеет определение способности клеток адгезироваться к их поверхности, так как мобилизация лейкоцитов из сосудистого русла в ткани является ключевым этапом развития воспаления. Обработанное для адгезии стекло является эталоном для определения скорости прикрипления клеток. Относительно этого количества мы выявляли долю адгезированных клеток на испытуемых образцах с покрытиями при совместной инкубации от 10 мин. до 18 ч. Было установлено, что наибольшая адгезивная активность клеток после 30 мин. контакта выявлялась в отношении образца с покрытием Т 3, в состав которого входит гидроксиапатит (рис. 3А). Затем в интервале между 45 мин. и 1,5 ч. инкубации различие между значениями при взаимодействии клеток с образцами было недостоверным (р<0,05), наиболее плотная адгезия клеток к поверхности наблюдалась после 2 ч. контакта.
При изучении «архитектоники» клеток на образцах с помощью сканирующей электронной микроскопии обнаружено, что при взаимодействии с титаном без покрытия, клетки, как при адгезии к стеклу, плотно прилегали к поверхности, имели уплощенную форму, сглаженную морфологию, без наличия складок, и по периметру наблюдались немногочисленные псевдоподии (рис. 3Б). Описанная архитектоника соответствовала состоянию клеток при отсутствии стимулирующего компонента. Подобная структура отмечалась при контакте клеток с кальций-фосфатным покрытием титана (рис. 3В). С течением времени морфология поверхности клеток изменялась, появлялись многочисленные складки, клетки округлялись, увеличивались в размерах и обнаруживались многочисленные нитчатой формы псевдоподии, что указывало на стимуляцию клеток (рис. 3Г). При контакте с покрытием, в составе которого был гидрокси-
апатит, рельеф поверхности клеток соответствовал их стимулированному состоянию и характеризовался вышеуказанными признаками (рис. 3Д). Также в этом образце обнаруживались многоклеточные структуры, в которых морфологически обособленные тела клеток были связаны между собой цитоплазма-тическими мостиками (рис. 3Е). Таким образом, изучение структуры поверхности клеток показало, что выраженность изменения архитектоники зависела от вида покрытия, нанесенного на титан.
Процесс адгезии нейтрофилов и макрофагов к поверхности помимо морфологических изменений сопровождался активацией метаболизма, который характеризуется состоянием ферментных систем и продукцией молекулярных мессенджеров — реактивных метаболитов кислорода и оксида азота, а также цитокинов. При хемотаксисе плазматическая мембрана клеток пространственно преобразовывалась, и данный процесс находился в прямой зависимости от активности ее эктоферментов — 5"-нукпеотидазы и АТР-азы. Для дифференцировки активированных и покоящихся нейтрофилов и макрофагов используется тест по определению внутриклеточного содержания ферментов 5"-нуклеотидазы и АТФазы, уменьшение внутриклеточного содержания которых свидетельствует о стимуляции клеток [20]. При контакте клеток с изучаемыми образцами наблюдалось уменьшение содержания указанных ферментов в начальный период до 5 ч. (рис. 4А). Минимальные показатели для АТФазы отмечались после 1 ч. и составили при контакте с Т 1 — 26,21±2,3; Т 2 — 13,95±1,07 и И 3 - 14,25±1,3%. Динамика показателей активности 5 "-нуклеотидазы была подобна таковой для содержания АТФазы и составила 26,4±1,95; 14,5±1,65 и 17,24±1,6%, соответственно (рис. 4Б). Эти данные демонстрируют максимальную стимуляцию клеток, связанную с адгезией
на поверхности образцов в течение первого часа, а достоверное различие (р<0,05) между показателями — на меньшее стимулирующее воздействие покрытий по сравнению с титаном.
При оценке цитотоксического действия изучаемых покрытий по выявлению состояния НАДФ-Н-зависимых клеточных оксидоредуктазных ферментов (СДГ, ЛДГ) обнаружена неоднозначная реакция клеток. В начальный период наблюдения (4 ч.) не наблюдалось снижения показателей активности СДГ и ЛДГ, что указывало на отсутствие цитотоксиче-ского действия изучаемых образцов (рис. 4В, Г). Достоверное повышение внутриклеточного содержания ферментов в этот период отражало повышение метаболической активности клеток после контакта с
образцами, при наличии более высоких показателей в отношении клеток (р<0,05), контактировавших с титаном. Так, показатели для СДГ после 4 ч. контакта составили для И 1 — 16,8±1,45; Т 2 — 1,85±0,63 и Т 3 - 1,34±0,68%, а для ЛДГ в этот же период наблюдения для Т 1 — 11,21 ±1,72; Т 2 — 1,85±0,78; Т 3 — 1,27±0,86%, соответственно.
МПО локализуется в лизосомах преимущественно нейтрофилов, катализирует реакцию преобразования гипохлорит-аниона, проявляя свою активность в качестве компонента антиоксидатной защиты клетки. Под влиянием образцов на фоне указанной выше выраженной активации НАДФ-Н-зависимых клеточных оксидоредуктазных ферментов нами было обнаружено повышение активности МПО (рис. 4Д).
Рис. 3. Клетки, адгезированные к различным поверхностям: А — доля адгезировавшихся клеток (1 — Т 1; 2 — Т 2; 3 — Т 3); Б — к поверхности сплава титана; В, Г — к кальций-фосфатному покрытию; Д, Е — к покрытию с гидроксиапатитом. Сканирующая электронная микроскопия. Отрезок: Б-Д — 10 мкм; Е — 20 мкм
Рис. 4. Активность ферментов и количество неферментных катионных белков в клетках после контакта со сплавом титана (Т 1), с кальций-фосфатным покрытием на титане (Т 2) и с покрытием, включающем гидроксиапатит (Т 3): А — активность 5"-нуклеотидазы; Б — АТФазы; В — сукцинатдегидрогеназы; Г — лактатдегидрогеназы; Д — миелопероксидазы; Е — количество неферментных катионных белков
Статистически значимые различия между показателями были выявлены после контакта в течение 2 ч.: Т 1 - 32,7±2,85; И 2 - 34,07±2,67 и Т 3 -65,7±4,75%, что указывало на более выраженную стимуляцию антиоксидантной защиты клеток при контакте с покрытием, включающим гидроксиапатит. Что же касается внутриклеточного содержания неферментных катионных белков, которые относятся к классу низкомолекулярных межклеточных посредников бактерицидной активности нейтрофилов, то подобного достоверного отличия между показателями для клеток, контактировавших с изучаемыми образцами, не было установлено (рис. 4Е).
Исход имплантации зависит как от прямого взаимодействия клеток с искусственной поверхностью, так и от секреторной активности иммунокомпе-тентных клеток. При негативном развитии событий происходит резорбция костной ткани вокруг им-плантата, что приводит к его расшатыванию, присоединению инфекционных агентов к воспалению и
неизбежному удалению [6, 7]. Поэтому в тестах, проводимых в условиях in vitro, помимо определения жизнеспособности клеток, измеряют уровень межтканевых медиаторов [12, 13]. При изучении уровня провоспалительных цитокинов достоверное различие между показателями для интактных клеток и после контакта с образцами было обнаружено в отношении двух цитокинов: ФНОа и регулятора активации экспрессии и секреции клеток RANTES (табл.). Причем, наибольшее количество цитокинов продуцировалось клетками при контакте с титаном Ti 1, а наименьшее при контакте с кальций-фосфатным покрытием Ti 2. Подобная зависимость была установлена и в отношении продукции клетками противовоспалительных цитокинов — интерлей-кинов 6, 10 и 12. Вышеизложенные результаты демонстрируют, что по сравнению с другими изучаемыми образцами наименьшим иммуностимулирующим действием обладало кальций-фосфатное покрытие Ti 2.
Таблица. Продукция цитокинов клетками врожденного иммунитета (инкубация в течение 24 ч.) при контакте с модифицированными покрытиями титана
Цитокины (пг/мл) Норма Контроль Ti 1 Ti 2 Ti 3
ФНО а 25,48±9,8 170,12±161,95# 50,65±37,6** 30,27±4,8 45,2±6,7**
RANTES 17,67±5,7 285,54±570,12# 96±9,7* 88±9,8* 70±6,85*
ИЛ 1 1,7±0.2 15,54±57,12# 2,4±0,15* 1,84±0,08 1,78±0,07
ИЛ 6 18,17 138,56±87,58# 87,78±7,7** 57,17±9,71* 78,67±9,75*
ИЛ 10 22,2±2,8 300±27,9# 98±21,7* 82±17,6* 79±15,7*
ИЛ 12 2,78±2,8 210,76±19,8# 8,7±0,7* 2,86±1,55 6,52±5,75
Примечания: норма — продукция цитокинов клетками после контакта со средой; контроль — после контакта с липополи-сахаридом (1 мг/мл); # - различия при сравнении с группой «норма» статистически значимы при P = 0,05; * — различия при сравнении с контролем статистически значимы при P = 0,005; ** — различия при сравнении с контролем статистически значимы при P = 0,001.
Заключение
Изменение функционального состояния нейтро-филов и макрофагов после контакта с имплантатами можно рассматривать как триггерный фактор воспалительного процесса, сопровождающего внедрение чужеродного материала. Оптимизация ферментативной реакции клеток врожденного иммунитета на присутствие титана с помощью нанесения на него новых биоактивных остеогенерирующих покрытий является одним из условий прочной и долговременной фиксации имплантатов в костной ткани по сравнению с биоинертными изделиями [21, 22]. Продукция клеток врожденного иммунитета во внеклеточную среду медиаторов, а именно, про- и противовоспалительных цитокинов может способствовать усилению межклеточных биохимических сигналов для фор-
мирования тканевого окружения. В конечном итоге, сбалансированное с помощью покрытий на титане, сформированных методом ПЭО, функциональное состояние клеток врожденного иммунитета оказывает влияние на воспаление, сопровождающее процесс репарации окружающих имплантат тканей. Данный феномен делает представленные технологии нанесения покрытий весьма перспективными для индукции остеосинтеза и указывает на необходимость дальнейшего изучения свойств новых покрытий в качестве остеогенерирующих.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 14-33-00009) и Федерального агентства научных организаций.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Попков А.В. Биосовместимые имплантаты в травматологии и ортопедии. Гений ортопедии 2014; 94-9.
2. Hamilton R.F., Wu N., Xiang C. et al. Synthesis, characterization, and bioactivity of carboxylic acid-functionalized titanium dioxide nanobelts. Part. Fibre. Toxicol. 2014; 11: 43.
3. Van Hove R.P., Sierevelt I.N., Van Royen B.J. et al. Titanium-nitride coating of orthopaedic implants: a review of the literature. Biomed. Res. Int. 2015; 9: 485975.
4. Ляхов Н.З., редактор. Биокомпозиты на основе кальций-фосфатных покрытий, наноструктурных и ультрамелкодисперсных биоинертных металлов, их биосовместимость и биодеградация. Томск: изд-во ТГУ; 2014.
5. Montanaro L., Testoni F., Poggi A. et al. Emerging pathogenetic mechanisms of the implant-related osteomyelitis by Staphylococcus aureus. Int. J. Artif. Organs 2011; 34(9): 781-8.
6. Pierre C.A., Chan M., Iwakura Y. et al. Periprosthetic osteolysis: characterizing the innate immune response to titanium wear-particles. J. Orthop. Res. 2010; 28(11): 1418-24.
7. Ахтямов И.Ф., Шакирова Ф.В., Гатина Э.Б. и др. Морфологическое исследование местного действия имплантата с твердой поверхностью при индуцированной травме. Журн. Клин. Эксперим. Ортоп. им. Г.А. Илизарова 2015; 1: 65-70.
8. Yang H.W., Lin M.H., Xu Y.Z. et al. Osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells on strontium-substituted nano-hydroxyapatite coated roughened titanium surfaces. Int. J. Clin. Exp. Med. 2015; 8(1): 257-64.
9. Wu K., Xu J., Liu M. et al. Induction of osteogenic differentiation of stem cells via a lyophilized microRNA reverse transfection formulation on a tissue culture plate. Int. J. Nanomedicine 2013; 8: 1595-607.
10. Hove R.P., Sierevelt I.N., Royen B.J. et al. Titanium-nitride coating of orthopaedic implants: a review of the literature. Biomed. Res. Int. 2015; 2015: 485975.
11. Thomas P., Iglhaut G., Wollenberg A. et al. Allergy or tolerance: reduced inflammatory cytokine response and concomitant IL-10 production of lymphocytes and monocytes in symptom-free titanium dental implant patients. Biomed. Res. Int. 2013; 2013: 539834.
12. Lee H.G., Hsu A., Goto H. et al. Aggravation of inflammatory response by costimulation with titanium particles and mechanical perturbations in osteoblast- and macrophage-like cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2013; 304(5): 431-9.
13. Moura C.C., Zanetta-Barbosa D., Dechichi P. et al. Effects of titanium surfaces on the developmental profile of monocytes/ macrophages. Braz. Dent. J. 2014; 25(2): 96-103.
14. Kim H.D., Kim K.S., Ki S.C. et al. Electron microprobe analysis and tissue reaction around titanium alloy spinal implants. Asian Spine J. 2007; 1(1): 1-7.
15. Tecchio C., Micheletti A., Cassatella M.A. Neutrophil-derived cytokines: facts beyond expression. Front. Immunol. 2014; 5: 508.
16. Jhunjhunwala S., Aresta-DaSilva S., Tang K. et al. Neutrophil responses to sterile implant materials. PLoS One 2015; 10(9): e0137550.
17. Boersema G.S., Grotenhuis N., Bayon Y. et al. The effect of biomaterials used for tissue regeneration purposes on polarization of macrophages. Biores. Open Access 2016; 5 (1): 6-14.
18. Holt D.J., Chamberlain L.M., Grainger D.W. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials 2010; 31(36): 9382-94.
19. Ляпун И.Н., Плехова Н.Г., Сомова Л.М. и др. Функциональная активность нейтрофилов, зараженных РНК-содержащими вирусами. ТМЖ 2012; 1: 93-6
20. Park K.R., Bryers J.D. Effect of macrophage classical (M1) activation on implant-adherent macrophage interactions with Staphylococcus epidermidis: A murine in vitro model system. J. Biomed. Mater. Res. A 2012; 100(8): 2045-53.
21. Masoud R., Bizouarn T., Trepout S. et al. Titanium Dioxide Nanoparticles Increase Superoxide Anion Production by Acting on NADPH Oxidase. PLoS One 2015; 10(12): e0144829.
22. Chen X., Li H.S., Yin Y. et al. Macrophage proinflammatory response to the titanium alloy equipment in dental implantation. Genet. Mol. Res. 2015; 14(3): 9155-62.
Поступила: 01.04.2016
