Влияние модификаторов Са 2+-проницаемости на н 2о 2-индуцированный апоптоз перитонеальных макрофагов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Биохимия и физиологе я человека и животных

13. Роль переписного окисления липидов мембран (ПОЛ) и антирадикальной защиты в патогенезе бронхиальной астмы / В. Г. Аматуни, К. Г. Карагезян, М. Д. Сафарян // Терапевтический архив. 1980.

№ 3. С. 96 — 99.

14. Состояние процессов перекисного окисления липидов при хроническом бронхите / Г. Л. Игнатова, И. А. Волчегорский, Э. Г. Волкова // Терапевтический архив. 1998. № 3. С. 36 — 37.

15. Тяжелые внебольничные пневмонии / Л. Д. Сидорова, Л. Н. Можина, Т. Н. Курбетьева, Е. Г. Тихомирова / / Проблемы клинической медицины. 2005. № 1. С. 36 — 39.

16. Хышиктуев Б. С. Метод определения продуктов перекисного окисления липидов / Б. С. Хы-шиктуев, Н. А. Хышиктуева / / Вопросы медицинской химии. 1990. № 1. С. 25 — 26.

Поступила 18 АО.06.

\

%

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАТОРОВ Са2+-ПРОНИЦАЕМОСТИ НА Н202-ИНДУЦИР0-ВАННЫЙ АПОПТОЗ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРО- 1 ФАГОВ

Ж

В. А. Трофимов, доктор биологических наук (Саранск), |

О. Н. Аксенова, кандидат биологических наук (Саранск), I

А. В. Никулин (Саранск)

Генетическая детерминированность апоп-тоза определяется наличием генов индукторов апоптоза, транскрипционная активность которых резко возрастает при окислительном стрессе [5]. Мощными индукторами апоптоза являются активные формы кислорода, в частности перекись водорода, продуцируемые активированными макрофагами [1]. Показано, что перекись водорода влияет на кальциевую проницаемость и способствует накоплению Са2+ в цитоплазме перитонеальных макрофагов [3]. В свою очередь запуск триггерных звеньев программы апоптоза клетки также является зависимым от кальция [2; 8]. В этой связи представляет интерес изучение роли Са2+ в реализации программы Н202-индуцированного апоптоза перитонеальных макрофагов.

В данной статье представлены данные о влиянии модификаторов Са2+-проницаемости на Н202-индуцированный апоптоз перитонеальных макрофагов.

Методика исследования. Объектом исследования служили резидентные перитоне-альные макрофаги (ПМФ) крыс линии АМэ1аг весом 200 — 250 г, полученные по методу

Conrad [7]. Клетки культивировали в течение 2 ч в монослое на предметных стеклах влаж- j ных камер и в эппендорфовых пробирках при j температуре 37 °С. Рабочая концентрация I суспензии составляла 106 кл / мл. Жизнеспособность клеток проверяли с помощью теста | с трипановым синим. Эксперименты проводи- \ ли при комнатной температуре (20 — 22 °С) j на 1-е сутки культивирования макрофагов. В J культуральную среду добавляли Н202 (1 мМ), j модификаторы Са2+-проницаемости: Са2+- j ионофор А23187 (0,1 и 1 мкМ); Са2+-блокаторы: j верапамил (0,05 мг / мл) и LaCl3 (0,5 мМ); j Са2+-хелатор-ЭДТА (2 мМ) (все реактивы про- j изводства «Sigma»). Инкубировали в термо- j стате при температуре 37 °С в течение 3 ч.

t

Затем монослои клеток фиксировали и окра- ¡

шивали для световой микроскопии, используя j

краситель Гимза («Sigma»). На эксперимен- j

тальную точку анализировали 100 клеток. Вы- j

деление и электрофоретический анализ ДНК j

проводили по стандартной методике j

S. Н. Kaufmann. Размер фрагментов ДНК оп- !;

ределяли путем сравнения их подвижности с j

маркером (фрагменты фага А,). Количествен- J

© В. А. Трофимов, О. Н. Аксенова, А. В. Никулин, 2007 j

ия «Биологические науки»

91

Биохимия и физиология человека н животных

ное определение ДНК проводили путем сравнения яркости полос анализируемых фрагментов и стандартного препарата ДНК. О достоверности различий между группами судили при помощи /-критерия Стьюдента.

Результаты исследования. Известно, что реализация физиологической активности перекиси водорода может осуществляться посредством ее влияния на кальциевую проницаемость [3]. Нами исследована способность перекиси водорода индуцировать апоптоз в перитонеальных макрофагах в зависимости от кальциевой составляющей.

Показано, что при действии Н202 в концентрации 1 мМ в кальциевой среде доля апопто-тирующих перитонеальных макрофагов составила 79 %, доля клеток, погибших некрозом — 9 %, на долю нормальных клеток приходилось 12 % (рис. 1, а). У апоптотирующих клеток накапливались фрагменты (180 — 200 н. п.)

ДНК (рис. 2).

Для усиления кальциевой проницаемости используют карбоксильный кальциевый ионофор

Рисунок 2

Электрофоретическое разделение ДНК

перитонеальных макрофагов

1 - Н202 (1 мМ);

2 — Н 20 2 (1 ЯЩ + кальциевый ионофор

А23187 (0,1 мкМ);

3 — Н202 (1 мМ) + кальциевый ионофор А23187 (1 мкМ);

4 — Н202 (1 мМ) + ЭДТА (2 мМ);

5

6

Н202 (1 мМ) + Lad, (0,5 мМ);

Н202 (1 мМ) + верапамил (0,05 мг/мл)

А

23187'

который в концентрации 0,5

2 мкМ

усиливает продукцию активных форм кислорода, вызванную увеличением концентрации Са2+ в клетках [6]. Са2+-ионофор А23187 (0,1 и 1 мкМ) концентрационно зависимо усиливал проапоптотическое действие перекиси водорода (1 мМ). Но если в концентрации 0,1 мкМ

А

апоптозу, то при его применении в концентрации 1 мкМ отмечалось накопление клеток, погибших по типу некроза (рис. 1, б, в). Это подтверждают и результаты электрофореза ДНК (рис. 2).

Для понижения концентрации кальция в макрофагах использовали ингибиторы кальци-

23187

склонял перитонеальные макрофаги к евых каналов

верапамил и LaCl При дей-

120 -

100 -

80 -

60 -

40 -

20 -

живые клетки апоптоз клеток □ некроз клеток

в

Д

Рисунок I

Влияние на гибель (%) перитонеальных

макрофагов:

а) Н202 (1 мМ);

б) Н202 (1 мМ) + кальциевый ионофор А23187 (0,1 мкМ);

в) Н202 (1 мМ) + кальциевый ионофор А23187 (1 мкМ);

г) И202 (1 мМ) + верапамил (0,05 мг / мл); Д) И202 (1 мМ) + LaCl3 (0,5 мМ).

ствии Н202 (1мМ) в присутствии верапамила (0,05 мг/мл) цитотоксический эффект Н202 снижался, в присутствии ЬаС13 (0,5 мМ) цито-токсичность Н202 практически отсутствовала (рис. 1, г, д). При электрофорезе ДНК из модифицированных макрофагов нуклеосомной лестницы не наблюдалось (см. рис. 2).

Таким образом, ингибиторы кальциевых токов верапамил и ЬаС13 резко уменьшают про-апоптотический эффект перекиси водорода. Причем известна разная способность ингибиторов подавлять поступление кальция в клетку: верапамил снижает поглощение Са2+ на 57 %, а ЬаС13 — на 71 % [4], находит свое проявление и на их способности неравнозначно понижать процент апоптотирующих клеток.

При действии Н202 (1 мМ) в присутствии проникающего кальциевого хелатора — ЭДТА (2 мМ) предотвращается возникновение разрывов в ДНК и цитотоксический эффект перекиси водорода (см. рис. 2).

92

ВЕСТНИК Мордовского университета | 2007 I № 4

Биохимия и физиология человека и животных

j

Полученные нами данные об усилении Н202-индуцированного апоптоза перитонеальных макрофагов при действии Са2+-ионофора А23187, его замедлении при действии верапа-мила и блокаде апоптоза при действии ЬаС13 и ЭДТА позволяют обнаружить важную роль ионов Са2+ в апоптозе фагоцитов.

Очевидно, что и реализация программы Н202-индуцированного апоптоза в перитонеаль-

ных макрофагах должна включать изменения ( кальциевой проницаемости. Подчеркнем, что на- \ рушение кальциевой проницаемости является важным фактором, толкающим перитонеальные макрофаги к программируемой гибели. В качестве механизма, усиливающего проапоптотичес-кое действие перекиси водорода, может рассматриваться ФИ-цикл, регулирующий уровень ионов кальция в цитоплазме и ядре.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Зенков Н. К. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз / Н. К. Зенков, В. А. Козлов / / Успехи современной биологии. 1991. № 5. С. 440 — 445.

2. Измерение внутриклеточной концентрации Са2+ в макрофагах, влияние фактора активации тромбоцитов / В. Г. Пинелис, Д. В. Загулова, А. А. Галкин [и др.] // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1991. № 6. С. 579 — 582.

3. Меньшикова Е. Б. Окислительный стресс при воспалении / Е. Б. Меньшикова, Н. К. Зенков / / Успехи современной биологии. 1999. № 2. С. 1056 — 1063.

4. Модель динамики внутриклеточного Са2+, основанная на уточненной кинетике ингибирования ино-зитол - 1,4,5 - трифосфатчувствительного кальциевого канала / В. Г. Вересов, А. Г. Кабак, И. Д. Волот-ковский / / Биофизика. 2002. Т. 47, вып. 1. С. 31 — 37.

5. Пескин А. В. Взаимодействие активного кислорода с ДНК / А. В. Пескин / / Биохимия. 1997. № 12. С. 1571 — 1578.

6. Усиливающее действие кальциевых ионофоров на вызываемый форболовым эфиром респираторный взрыв в перитониальных нейрофилах мыши / Е. Н. Дедкова, А. А. Аловская, А. Г. Габдулхакова [и др.] // Биохимия. 1999. Т. 64, вып. 7. С. 941.

7. Conrad R. Е. Induction and collection of peritoneal exudate macrophages / R. E. Conrad / / Manual of macrophages methodology. New York: Marcell Dekker, 1981. P. 5 — 11.

8. Gamaley I. A. Roles of reactive oxygen species signaling and regulation of cellular functions / I. A. Gamaley, I. V. Klyubin // Int. Rev. Cytol. 1999. Vol. 188. P. 203 — 255.

Поступила 18.10.06.

Серия «Биологические науки»

93