CC BY
21УДК: 612.063 DOI: 10.37279/2224-6444-2020-10-4-29-35
ВЛИЯНИЕ МИОКИНОВ НА СОДЕРЖАНИЕ ГОРМОН-ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ЛИПАЗЫ В МСК И КЛЕТКАХ АДИПОГЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
Мишра А.1,2, Цыпандина Е. В.3, Гапонов А. М.1, Румянцев С. А.4, Ханферьян Р. А.5, Шестопалов А. В.1
'НМИЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева (НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева), 117997 ул. Саморы Машела, д. 1, г. Москва, Россия
2Московский физико-технический институт (МФТИ), 141701, Институтский пер., 9, Московская область, г. Долгопрудный, Россия
3ФНКЦ реаниматологии и реабилитологии, НИИ общей реаниматологии им. В. А. Неговского, 107031, ул. Петровка, д. 25, стр. 2, г. Москва, Россия
^Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, 117997, ул. Островитянова, д. 1, г. Москва, Россия
5Российский университет дружбы народов, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6, г. Москва, Россия Для корреспонденции: Мишра Апурва, аспирант МФТИ, лаборатории инфекционной иммунологии НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева, e-mail: mishra@phystech.edu
For correspondence: Apoorva Mishra, PhD candidate in Biological Sciences, researcher in the laboratory of infectious immunology "Dmitry Rogachev National Medical Research Center for Pediatric Hematology Oncology and Immunology", e-mail: mishra@phystech.edu
Information about authors:
Mishra A., https://orcid.org/0000-0001-5594-3805 Tsypandina E. V., https://orcid.org/0000-0002-9037-9266 Gaponov A. M., https://orcid.org/0000-0002-3429-1294 Rumyantsev S. A., https://orcid.org/0000-0002-7418-0222 Khanferyan R. A., https://orcid.org/0000-0003-1178-7534 Shestopalov A. V., https://orcid.org/0000-0002-1428-7706
РЕЗЮМЕ
Базовым метаболическим процессом, обеспечивающим функцию как белой, так и бурой/бежевой жировой ткани, является липолиз - ступенчатый ферментативный процесс гидролиза триацилглицеридов жировой ткани. Многократно показано, что физическая активность активирует липолиз. В последнее время установлено, что скелетные мышцы обладают эндокринной активностью, продуцируя ряд мышечных гормонов - миокинов. В литературе имеются неполные сведения о взаимоотношении скелетных мышц и жировой ткани.
Исследовано влияние секретируемых миоцитами цитокинов (миокинов) - метеорин-подобного белка (METRNL) и р-аминоизомасляная кислота (BAIBA), а также адренергического агониста изопротеренола на содержание общей и фосфорилированной (Ser552) гормон-чувствительной липазы (ГЧЛ) в мезенхимальных стромальных клетках жировой ткани (МСК) и клеточных продуктах их адипогенной дифференцировки. В ходе исследования МСК были получены из жировой ткани 5 здоровых доноров. Адипогенная дифференцировка МСК продолжалась в течение 21 дня. После того, как были получены адипогенные культуры, вносили стимуляторы в следующих концентрациях: 5мкМ METRNL, 5мкМ BAIBA и 5 мкМ изопротеренола. С помощью вестерн-блоттинга оценили изменение содержание общей и активной (Ser552) ГЧЛ в клетках трех различных видов адипогенной дифференцировки в МСК. Мы наблюдали, что ГЧЛ и ее активная форма продуцируются в клеточных культурах, индуцированных факторами белой, бежевой и бурой адипогенной дифференцировки.
Ключевые слова: адипоциты; мезенхимальные стволовые клетки; метеорин-подобный белок; BAIBA.
EFFECT OF MYOKINES ON THE QUANTITY OF HORMONE SENSITIVE LIPASE IN MSCS AND THE PRODUCTS OF THEIR ADIPOGENIC DIFFERENTIATION
Mishra A.1,2, Tsypandina E. V.3, Gaponov A. M.1, Rumyantsev S. A.4, Khanferyan R. A.5, Shestopalov A. V.1
'Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology, and Immunology, 117997 Samory Mashela 1, Moscow, Russia
2Moscow Institute of Physics and Technology, 141701, Institutskiy per. 9, Dolgoprudny, Russia
3V. A. Negovsky Research Institute of General Reanimatology of Federal Research and Clinical Center of Intensive Care Medicine and Rehabilitology, 107031, Petrovka 25, bldg. 2, Moscow, Russia
4N. I. Pirogov Russian National Research Medical University, 117997, Ostrovetyanovo 1, Moscow, Russia 5Peoples' Friendship University of Russia, 117198, Ulitsa Miklukho-Maklaya, 6, Moscow, Russia
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
SUMMARY
The basic metabolic process associated with white and beige/brown adipose tissues is lipolysis - the sequential enzymatic process of the hydrolysis of triglycerides in the adipose tissue. It has been repeatedly shown that physical activity activates lipolysis. It has recently been shown that skeletal muscles have an endocrine role; producing a host of myogenic hormones - myokines. Current literature has an incomplete understanding of the interdependent relationship between skeletal muscles and adipose tissue.
We researched the influence of myocyte secreted cytokines (myokines) - meteorin-like protein (METRNL) and P-aminoisobutyric acid (BAIBA), and the adrenergic agonist isoproterenol on the levels of total and phosphorylated (Ser552) hormone sensitive lipase (HSL) in adipose tissue derived mesenchymal stromal cells (MSCs) and the cellular products of their adipogenic differentiation. The MSCs were obtained from 5 healthy donors. The adipogenic differentiation protocol was carried out for a span of 21 days. After procuring the adipocyte cultures, the following stimulators were added - 5 |jM METRNL, 5 |jM BAIBA, and 5 |jM isoproterenol. With the help of western blot, the change in the amount of total and activated levels of HSL were monitored in cells of three different adipogenic differentiation protocols in MSCs. We observed that HSL and its activated form are produced in cell cultures induced with factors for white, beige, and brown adipogenic differentiation.
Key words: adipocytes; mesenchymal stem cells; meteorin-like protein; BAIBA.
В организме человека сосуществуют три вида жировой ткани: белая, бурая и бежевая. Несмотря на то, что все вместе они рассматриваются как «жировая ткань», они имеют различное клеточное происхождение, морфологию и функции в организме. В то время как белая жировая ткань депонирует энергию в виде триацилглицеридов в одиночной липидной вакуоли, бурая и бежевая жировая ткань содержат несколько липидных включений и больше цитоплазмы, что позволяет им функционировать на более высоком метаболическом уровне. Третий тип жировой ткани - бежевая - является продуктом дифференци-ровки/трансдифференцировки белых адипоци-тов под действием специальной стимуляции и обозначается как «браунинг».
Бурая жировая ткань играет важную роль в поддержании температуры тела путем выработки тепла. Бурая жировая ткань, характерной, как казалось раньше, только для мелких млекопитающих и новорожденных, с недавних времен привлекла большое внимание после выявления ее функциональной активности у взрослых и потенциальной роли в лечении ожирения и сахарного диабета. Многочисленные исследования показали, что трансплантация или активация бурых или бежевых адипоцитов снижает степень ожирения и улучшает чувствительность к инсулину [1; 2].
Влияние физических упражнений на термо-генез бурой жировой ткани получил противоречивые результаты. При исследовании на людях отмечалось снижение активности бурой жировой ткани (измеряемой по снижению поглощения глюкозы) в ответ на физическую нагрузку [3].
В белой жировой ткани физические упражнения уменьшают размер адипоцитов, изменяют экспрессию генов и увеличивают активность митохондрий. Трансплантация тренированных подкожных белых адипоцитов улучшает метаболическое здоровье всего тела [4]. Таким образом, изменения в жировой ткани, вызван-
ные физическими упражнениями, могут быть частью механизма, с помощью которого физические упражнения улучшают метаболическое здоровье [5].
Базовым метаболическим процессом, обеспечивающим функцию как белой, так и бурой/ бежевой жировой ткани, является липолиз - ступенчатый ферментативный процесс гидролиза триацилглицеридов жировой ткани.
Многократно показано, что физическая активность активирует липолиз, что подтверждается увеличением концентрации свободных жирных кислот и глицерола в сыворотке крови. Эта активация вызвана секрецией катехолами-нов, натрийуретических пептидов, гормона роста и кортизола [6; 7].
В последнее время установлено, что скелетные мышцы обладают эндокринной активностью, продуцируя ряд мышечшых гормонов - миокинов. К ним относятся ирисин, метеорин-подобный белок (METRNL), Р-аминоизобутират (ВА1ВА), миостатин, фактор роста фибробла-стов 21 (FGF21), интерлейкин-6 и ряд других факторов [8; 9]. В литературе имеются неполные сведения о влиянии данных факторов на липо-лиз [10; 11]. Однако, влияние этих факторов на активность ГЧЛ в различных типах жировой ткани отсутствуют.
Поэтому целью нашей работы явилось изучение влияния миокинов (метеорин-подобного белка и ВА1ВА) на содержание гормон-чувствительной липазы в клетках жировой ткани различных линий дифференцировки.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использовали 5 образцов МСК выделенных из жировой ткани здоровых доноров, полученной в процессе косметической липосак-ции. Все доноры подписали информированное согласие на участие в исследовании.
МСК из жировой ткани выделяли с использованием 0,2% коллагеназы типа I (Панэко) в
течение 45 минут при 37°С в шейкере. Последующую стромально-сосудистую фракцию высевали во флаконы T-75 (Corning) и доводили до конфлуенции 80-85% с помощью базальной среды - DMEM/F12 (Панэко) с 2мМ L-глютамина, 10% FBS и 40 мкг/мл гентамицина. После того, как ADSCs были пересеяны как минимум 6 раз, был начат протокол адипогенной дифференци-ровки.
Культуру белых адипоцитов получали из МСК путем их культивирования в среде MesenCult Adipogenic Differentiation Medium (StemCellTechnologies) после 21 дней.
Адипогенная дифференцировка для бурых и бежевых адипоцитов проводилась в чередующихся фазах индукции (4 дня) с последующим поддержанием (3 дня) в течение 21 дня.
Культуру бурых адипоцитов получали из МСК путем их инкубации с 125 нг/мл BMP7 (PeproTech) в течение 3 дней до начала индукции. Во время индукционной фазы адипо-циты выращивались в MesenCult Adipogenic Differentiation Medium (StemCellTechnologies), с добавлением 1нМ Т3 (Сигма) и 1 мкМ рози-глитазон (Сигма). Во время фазы поддержки они росли на базальной среде для МСК.
Культуру бежевых адипоцитов получали из адипоцитов путем их культивирования в MesenCult Adipogenic Differentiation Medium (StemCellTechnologies), с добавлением 1нМ Т3 (Сигма) во время фазы индукции и на базальной среде для МСК во время фазы поддержки.
В конце 21-дневного цикла дифференциров-ки клетки были обработаны одним из следующих стимуляторов: 5 мкМ метеорин-подобным белком (METRNL) (Aviscera Bioscience, США), 5 мкМ бета-аминоизомаслянной кислотой (BAIBA) (Сигма, США) и 5 мкМ изопротерено-лом (Сигма, США) в течение 16 часов.
Уровень общей ГЧЛ и ее фосфорилированной формы (Ser552) определяли методом иммуно-блота с использованием специфичных монокло-нальных антител. Клеточные лизаты были получены при обработке клеток лизисным буфером NP40. Концентрацию белка измеряли методом Брэдфорда с использованием красителя Кумасси G-450, затем образцы разбавляли до концентрации 1 мг/мл. Белки в образцах денатурировали путем инкубации с загрузочным буфером при температуре 95С в течение 10 минут. Затем белки разделяли в 12% СДС-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм). Мембрану блокировали в 5% NFDM в течение 12 часов при температуре +4°С, после добавляли первичные антитела HSL (orb40070) и HSL (p-Ser552) (orb99159) в концентрации [1:1000].
Статистическую обработку проводили параметрическими и непараметрическими методами с использованием критерия Стьюдента и Уил-коксона с помощью программы OrigmLab.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Наши результаты показали, что в интакт-ном состоянии в МСК отсутствует экспрессия ГЧЛ. При стимуляции МСК адреномиметиком изопротеренолом, и миокинами ГЧЛ также не появляется (табл. 1, табл. 2). Вероятно, это свидетельствует о том, что в мультипотентных стволовых клетках липолиз не является обязательным метаболическим процессом.
В результате адипогенной дифференцировки активируется синтез ГЧЛ, о чем свидетельствует обнаружение этого фермента в белых, в бурых и бежевых адипоцитах (рис. 1). При этом максимальное содержание общей и фосфорили-рованной формы ГЧЛ обнаружено в белых ади-поцитах. Содержание ГЧЛ в бурых адипоцитах было ниже, чем в белых в 2,21 раз, при этом содержание активной фосфорилированной ГЧЛ формы было значительно ниже (в 2,73 раза). В бежевых адипоцитах содержание ГЧЛ было минимальным - в 5,3 и 2,4 раз меньше, чем в белых и бурых адипоцитах, соответственно. При этом содержание фосфорилированной формы ГЧЛ было 1,76 раз больше, чем в бурых адипоцитах.
Таким образом, при различной адипогенной дифференцировке наблюдается разное содержание ГЧЛ: максимальное в белых адипоцитах, при этом 42,58% в активной фосфорилирован-ной форме, а промежуточное в бурых адипоци-тах, но только 34,4% в активной форме.
Стимуляция культур различной адипогенной дифференцировки метеорин-подобных белков и ВА1ВА, не показала статистически значимых изменений в содержании ГЧЛ (табл.1, рис. 1). Также, при стимуляции миокинами, не изменилось уровень активной фосфорилированной формы этого фермента (табл. 2, рис. 2).
Классический активатор липолиза изопрена-лин показал статистически значимое уменьшение содержания общей гормон-чувствительной липазы (табл. 1, рис. 1). Данный факт, вероятно, свидетельствует об активации изопреналином протеосомной деградации ГЧЛ по принципу отрицательной обратной связи регуляции липо-лиза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в результате исследования нами установлена индукция экспрессии ГЧЛ во всех трех типах адипогенной дифференцировки и отсутствие статистически значимого влияния
2020, т. 10, № 4
крымскии журнал экспериментальном и клиническои медицины
А
мск
Белые адипоциты Бежевые адипоциты
/
/ / / / / ^ # «Г & /
• •
Бурые адипоцпты
о
sb -
О
400
350
300
250
§ 200 о
- 150
х
100 50 0
Li
Mi
Контроль METRNL BAIBA Изопротеренол I Белые адипоциты ■ Бежевые адипоциты ■ Бурые адипоциты
Рис. 1. Экспрессия ГЧЛ в адипоцитах: Лизаты белых, бежевых и бурых адипоцитов были количественно проанализированы с помощью иммуноблоттинга. (а) полоски на нитроцеллюлозных мембранах (б) относительная интенсивность полосовых сигналов (x10000), рассчитанная по отношению к интактным культурам внутри каждого вида адипоцитов (т. е. белый, бежевый и бурый отдельно).
Содержание ГЧЛ в клетках адипогенной дифференцировки
Таблица 1
Контроль METRNL BAIBA Изопротеренол
МСК Медиана 0 0 0 0
Q1 0 0 0 0
Q3 0 0 0 0
Белые адипоциты Медиана 900218.3 629695.9 487021.5 482725.9
Q1 650145.5 376818 199262.5 342438.1
Q3 1200646 1103005 1059750 915789.6
Бежевый адипоциты Медиана 614878.5
p1 < 0.05 427606.1 509554.6 604476.8
Q1 562364.6 338059 428310 547907.5
Q3 664605.1 576990.6 664000.1 710775.2
Бурый адипоциты Медиана 289110.6
p, < 0.05 238794.6 720006.7 296391.5
Q1 223856.3 178056.3 519250.2 248364.7
Q3 412911.8 320707.8 1606596 394454.9
Примечания: р1 - при сравнении с белыми адипоцитами. р2 - при сравнении с соответствующей интактной клеточной культурой
Рис. 2. Экспрессия ГЧЛ Ser552 в адипоцитах: Лизаты белых, бежевых и бурых адипоцитов были количественно проанализированы с помощью иммуноблоттинга. (а) полоски на нитроцеллюлозных мембранах (б) относительная интенсивность полосовых сигналов (х10000), рассчитанная по отношению к интактным культурам внутри каждого вида адипоцитов (т. е. белый, бежевый и бурый отдельно).
Содержание ГЧЛ в клетках адипогенной дифференцировки
Таблица 2
Контроль METRNL ВА1ВА Изопротеренол
Медиана 0 0 0 0
МСК Q1 0 0 0 0
Q3 0 0 0 0
Белые Медиана 2090847 2173099 2180587 1084410 р7 < 0,05
адипоциты Q1 1633541 1517560 1703371 925311.3
Q3 2689641 3048104 2823120 1678473
Бежевые Медиана 330676.6 р, < 0,05 448182.8 594420.5 629105.4
адипоциты Q1 280379.4 361621.5 550354.7 523306.3
Q3 468244.3 570334.1 629864.2 699261.3
Бурые адипоциты Медиана 883709.6 р, < 0,05 1060735 1067019 416041.9
Q1 690804.6 704887.4 708561.1 364172.2
Q3 1202827 1373072 1390204 572584.4
Примечания: р1 - при сравнении с белыми адипоцитами. р2 - при сравнении с соответствующей интактной клеточной культурой
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
на эти процессы гормонов мышечной ткани ме-теорин-подобного белка и BAIBA.
Финансирование. Работа выполнена в рамках договора № 03731001221200000006, по проекту «Изучение эффектов молекул-кандидатов видонеспецифических медиаторов систем QS на толерогенную и провоспалительную активности клеток иммунной системы, на клеточные культуры адипогенной дифференцировки МСК и на клеточные культуры трансформированных линий кишечного эпителия. Разработка лабораторного регламента получения ГЛФ кандидат-ного препарата».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Funding. This research was conducted under the contract number 03731001221200000006 belonging to the project "Study on the effect of molecular candidates on species-specific mediators of QS systems on the immunological tolerance and proinflammatory activity of immune cells on cell cultures of adipogenic differentiation from MSCs and on transformed intestinal epithelial cell cultures. The development of laboratory regulated production of viable drug dosage form.
Conflict of Interest. The authors declare that there is no conflict of interest.
ЛИТЕРАТУРА
1. Soler-Vázquez M. C., Mera P., Zagmutt S., Serra D., Herrero L. New Approaches Targeting Brown Adipose Tissue Transplantation as a Therapy in Obesity. Biochemical Pharmacology. 2018;155:346-355. doi:10.1016/j.bcp.2018.07.022.
2. White J. D., Dewal R. S., Stanford K. I. The Beneficial Effects of Brown Adipose Tissue Transplantation. Molecular Aspects of Medicine. 2019;68:74-81. doi:10.1016/j.mam.2019.06.004.
3. Lehnig A. C., Stanford K. I. Exercise-Induced Adaptations to White and Brown Adipose Tissue. The Journal of Experimental Biology. 2018;221(1). doi:10.1242/jeb.161570.
4. Dewal R. S., Stanford K. I. Effects of Exercise on Brown and Beige Adipocytes. Biochimica Et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 2019;1864(1):71-78. doi:10.1016/j.bbalip.2018.04.013.
5. Tran T. T., Kahn C. R. Transplantation of Adipose Tissue and Stem Cells: Role in Metabolism and Disease. Nature Reviews Endocrinology. 2010;6(4):195-213. doi:10.1038/nrendo.2010.20.
6. Frayn K. N. Fat as a Fuel: Emerging Understanding of the Adipose Tissue-Skeletal Muscle Axis. Acta Physiologica. 2010;199(4):509-518. doi:10.1111/j.1748-1716.2010.02128.x.
7. Moro C., Polak J., Hejnova J., Klimcakova E., Crampes F., Stich V., Lafontan M., Berlan
M. Atrial Natriuretic Peptide Stimulates Lipid Mobilization during Repeated Bouts of Endurance Exercise. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 2006;290(5):E864-869. doi:10.1152/ajpendo.00348.2005.
8. Schnyder S., Handschin C. Skeletal Muscle as an Endocrine Organ: PGC-1a, Myokines and Exercise. Bone. 2015;80:115-125. doi:10.1016/j. bone.2015.02.008.
9. Gomarasca M., Banfi G., Lombardi G. Myokines: The Endocrine Coupling of Skeletal Muscle and Bone. Advances in Clinical Chemistry. 2020;94:155-218. doi:10.1016/bs.acc.2019.07.010.
10. Aldiss P., Lewis J. E., Lupini I., Boocock
D. J., Miles A. K., Ebling F. J. P., Budge H., Symonds M. E. Exercise Does Not Induce Browning of WAT at Thermoneutrality and Induces an Oxidative, Myogenic Signature in BAT. 2019. doi:10.1101/649061.
11. Laurens C., Bergouignan A., Moro C. Exercise-Released Myokines in the Control of Energy Metabolism. Frontiers in Physiology. 2020;11:91. doi:10.3389/fphys.2020.00091.
REFERENСES
1. Soler-Vázquez M. C., Mera P., Zagmutt S., Serra D., Herrero L. New Approaches Targeting Brown Adipose Tissue Transplantation as a Therapy in Obesity. Biochemical Pharmacology. 2018;155:346-355. doi:10.1016/j.bcp.2018.07.022.
2. White J. D., Dewal R. S., Stanford K. I. The Beneficial Effects of Brown Adipose Tissue Transplantation. Molecular Aspects of Medicine. 2019;68:74-81. doi:10.1016/j.mam.2019.06.004.
3. Lehnig A. C., Stanford K. I. Exercise-Induced Adaptations to White and Brown Adipose Tissue. The Journal of Experimental Biology. 2018;221(1). doi:10.1242/jeb.161570.
4. Dewal R. S., Stanford K. I. Effects of Exercise on Brown and Beige Adipocytes. Biochimica Et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 2019;1864(1):71-78. doi:10.1016/j.bbalip.2018.04.013.
5. Tran T. T., Kahn C. R. Transplantation of Adipose Tissue and Stem Cells: Role in Metabolism and Disease. Nature Reviews Endocrinology. 2010;6(4):195-213. doi:10.1038/nrendo.2010.20.
6. Frayn K. N. Fat as a Fuel: Emerging Understanding of the Adipose Tissue-Skeletal Muscle Axis. Acta Physiologica. 2010;199(4):509-518. doi:10.1111/j.1748-1716.2010.02128.x.
7. Moro C., Polak J., Hejnova J., Klimcakova
E., Crampes F., Stich V., Lafontan M., Berlan M. Atrial Natriuretic Peptide Stimulates Lipid Mobilization during Repeated Bouts of Endurance Exercise. American Journal of Physiology-
Endocrinology and Metabolism. 2006;290(5):E864-869. doi:10.1152/ajpendo.00348.2005.
8. Schnyder S., Handschin C. Skeletal Muscle as an Endocrine Organ: PGC-1a, Myokines and Exercise. Bone. 2015;80:115-125. doi:10.1016/j. bone.2015.02.008.
9. Gomarasca M., Banfi G., Lombardi G. Myokines: The Endocrine Coupling of Skeletal Muscle and Bone. Advances in Clinical Chemistry. 2020;94:155-218. doi:10.1016/bs.acc.2019.07.010.
10. Aldiss P., Lewis J. E., Lupini I., Boocock D. J., Miles A. K., Ebling F. J. P., Budge H., Symonds M. E. Exercise Does Not Induce Browning of WAT at Thermoneutrality and Induces an Oxidative, Myogenic Signature in BAT. 2019. doi:10.1101/649061.
11. Laurens C., Bergouignan A., Moro C. Exercise-Released Myokines in the Control of Energy Metabolism. Frontiers in Physiology. 2020;11:91. doi:10.3389/fphys.2020.00091.
