CC BY
11
Вестник Томского государственного университета. Биология. 2022. № 59. С. 42-63 Tomsk State University Journal of Biology. 2022;59:42-63
БИОТЕХНОЛОГИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ
Научная статья
УДК 606
doi: 10.17223/19988591/59/2
Влияние микрокапсулированных стартовых культур на образование биологически активных пептидов в готовых мясных продуктах
Дмитрий Алексеевич Афанасьев1, Ирина Михайловна Чернуха2, Вера Ивановна Ганина3, Наталья Геннадьевна Машенцева4, Леонид Иванович Ковалев5, Анна Владиславовна Коврижных6, Махбубех Ахангаран7, Махмуд Гаравири8
12 Федеральный научный центр им. В.М. Горбатова РАН, Москва, Россия 3 Московский государственный университет технологий и управления им. К.Г. Разумовского, Москва, Россия 4 б, 7 8 Московский государственный университет пищевых производств, Москва, Россия 4 Федеральный исследовательский центр биотехнологии, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, Россия 1 dmitr. afanasjew2010@yandex. ru 2 imcher@inbox. ru
3 vigan5428@yandex. ru
4 natali-mng@yandex. ru
5 kovalyov@inbi. ras. ru
6 anya-1998@mail. ru
7 ahangaran @hotmail. com
8 gharaviri@hotmail. com
Аннотация. Особое значение в производстве ферментированных мясных продуктов играют стартовые культуры, посредством протеолитической системы которых происходит протеолиз белков мясного сырья с образованием коротких пептидов, обусловливающих качественные и функциональные характеристики готового продукта. Однако существуют некоторые технологические сложности в применении бактерий, способствующих образованию биологически активных пептидов в мясном сырье и готовых мясных продуктах. Решением этой проблемы может стать микрокапсулирование. В данном исследовании подобраны промышленно ценные штаммы стартовых культур, а также предложена технология их микрокапсулирования, основанная на заключении клеток в капсулы из 5%-го раствора альгината натрия. При оценке термостабильности капсул определено, что штаммы сохраняют свою активность в пределах от 30 до 90%. Исследован белковый профиль образцов вареных колбас, выработанных с применением микрокапсулированных стартовых культур. Результаты протеомного исследования свидетельствуют об изменениях в белках актомиозинового комплекса и ферментах мышечной ткани.
Ключевые слова: стартовые культуры, микрокапсулирование, альгинат натрия, мясное сырье, протеомика, биологически активные пептиды
Источник финансирования: работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 16-16-10073).
© Афанасьев Д. А., Чернуха И.М., Ганина В.И., Машенцева Н.Г., Ковалев Л.И.,
Коврижных А.В., Ахангаран М., Гаравири М., 2022
Для цитирования: Афанасьев Д. А., Чернуха И.М., Ганина В.И., Машенцева Н.Г., Ковалев Л.И., Коврижных А.В., Ахангаран М., Гаравири М. Влияние микрокапсулированных стартовых культур на образование биологически активных пептидов в готовых мясных продуктах // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2022. № 59. С. 42-63. doi: 10.17223/19988591/59/2
Original article
doi: 10.17223/19988591/59/2
The Effect of Microencapsulated Starter Cultures on the Formation of Biologically Active Peptides in Finished Meat Products
Dmitry A. Afanasev1, Irina M. Chernukha2, Vera I. Ganina3, Natalya G. Mashentseva4, Leonid I. Kovalev5, Anna V. Kovrizhnykh6, Mahboobeh Ahangaran7, Mahmud Gharaviri8
12 Gorbatov Federal Center for Food Systems RAS, Moscow. Russia 3 Razumovsky Moscow State University of Technology and Management, Moscow, Russia 4 6,7, s Moscow State University of Food Production, Moscow, Russia 5 Federal Research Center for Biotechnology, Bakh Institute of Biochemistry RAS,
Moscow, Russia 1 dmitr. afanasjew2010@yandex. ru 2 imcher@inbox. ru
3 vigan542S@yandex. ru
4 natali-mng@yandex. ru
5 kovalyov@inbi. ras. ru
6 anya-199S@mail. ru
7 ahangaran @hotmail. com
s gharaviri@hotmail. com
Summary. Of particular importance in the production of fermented meat products are starter cultures with a proteolytic system that promotes the proteolysis of the protein components of meat raw materials. Numerous compounds, which may have biological activity, were formed as a result of the proteolysis, for example, biologically active peptides or bacteriocins. Nevertheless, there are some technological difficulties in the use of bacteria that contribute to the formation of biologically active peptides in raw meat. The solution to this problem can be microencapsulation. In this study, industrially valuable strains of starter cultures were selected, and proteolytic activity genes were identified. Thus, the proteolytic genes of the PRTB10/PRTB20 and P15C/P06C families were found in the P. acidilactici 38 and P. pentosaceus 28 strains, while the genes of the Jp23/Jp25 and prti2/IP6Xba families were found in the L. acidophilus AT-45 strain. The prti2/IP6Xba genes were also found in the S. carnosus 111-2 strain. A technology is proposed for incorporating microorganisms into alginate capsules with an alginate gel concentration of 5%, which makes it possible to form strong capsules capable of maintaining the viability of starter cultures in the production of boiled sausage: when incubating heat-treated capsules to 72 °С on chalk agar, the survival rate of microorganisms from 30 to 90% was recorded. The protein profile of the samples of boiled sausages produced using microencapsulated starter cultures was studied. A significant interaction of some strains with proteins of the actomyosin complex was shown, and the enzymes of energy metabolism from muscle tissue were subjected to destructive changes - muscle creatine phosphate kinase, enolase, and adenylate kinase 1.
The paper contains 4 Figures, 4 Tables, and 27 References.
Keywords: starter cultures, microencapsulation, sodium alginate, raw meat, proteomics, biologically active peptides
Funding: This work was partially supported by the Russian Science Foundation (Project No.16-16-10073)
For citation: Afanasev DA, Chernukha IM, Ganina VI, Mashentseva NG, Kovalev LI, Kovrizhnykh AV, Ahangaran M, Gharaviri M. The Effect of Microencapsulated Starter Cultures on the Formation of Biologically Active Peptides in Finished Meat Products. Vestnik Tomskogo gosudarstvennogo universiteta. Biologiya = Tomsk State University Journal of Biology. 2022;59:42-63. doi: 10.17223/19988591/59/2. In Russian, English Summary
Актуальность
Интерес к природным пептидам в значительной степени обусловлен их необычно высокой биологической активностью. Они оказывают мощное фармакологическое воздействие на множество физиологических функций организма, что делает их ценными компонентами лечебно-профилактического питания. В то же время отмечены их низкая стабильность и быстрый распад в организме при физиологических значениях рН среды, что требует разработки более качественных методов их сохранения, например путем иммобилизации [1].
Немаловажной проблемой также является разработка методов выделения и идентификации биологически активных пептидов ввиду широкого спектра их функциональных свойств. Наиболее точным методом оценки эффективности и физиологических функций пептидов мясного происхождения являются клинические испытания с участием людей, однако такие исследования характеризуются сложностью, длительностью и значительными экономическими затратами. Экспериментальный дизайн может быть упрощен путем использования методов биоинформатики для компьютерного моделирования in silico, объединяющих инструменты биоинформатики и базы данных о пептидах. Данные методы являются более выгодными в плане экономики, менее энергоемкими и эффективными альтернативами эмпирических методов [2].
Существенное влияние на образование биологически активных пептидов в мясном сырье и готовых мясных продуктах оказывают стартовые культуры, в особенности молочнокислые бактерии и денитрифицирующие стафилококки, широко используемые в мясном производстве. Физиологическое наличие у этих культур широкого спектра ферментативных активностей, в особенности протеолитических ферментов эндо- и экзотипов, позволяет им в разной мере гидролизовать саркоплазматические и мио-фибриллярные белки мышечной ткани с образованием низкомолекулярных продуктов гидролиза, среди которых могут идентифицироваться и биологически активные пептиды.
Пептиды, образуемые молочнокислыми бактериями, включают рибо-сомально продуцируемые бактериоцины и продукты гидролиза белков —
биоактивные пептиды, которые могут выполнять функции природных консервантов и нутрицевтиков соответственно [3].
Биологически активные пептиды могут быть получены из субстратных белков под действием внутримембранных протеаз стартовых культур. Биоактивные пептиды являются внеклеточными, поскольку они представляют собой белковые остатки, которые не используются протеолитической системой молочнокислых бактерий для ассимиляции азота. В ряде случаев необходим лизис клеток, в результате которого ферменты, участвующие в протеолизе и генерации биоактивных пептидов, высвобождаются [4].
Способность штаммов молочнокислых бактерий образовывать биоактивные пептиды основана на гидролитических реакциях, производимых ферментами, участвующими в этом процессе. Новые технологии, такие как транскриптомная и протеомная, предоставили информацию, объясняющую этот сложный процесс. Ферменты, непосредственно участвующие в образовании биоактивного пептида, - это протеиназы, связанные с клеточной стенкой (семейство PrtP), с молекулярной массой порядка 200 кДа. Данные протеазы также могут быть внеклеточными. Гены PrtP могут быть обнаружены в Lactococcus lactis на уровне плазмид и в хромосоме Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus johnsonii, Lacticaseibacillus casei, Lacticaseibacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus. На экспрессию протеиназ PrtP влияют различные факторы в зависимости от штамма LAB. Например, у L. lactis BGMN1-5 экспрессия протеиназы зависела от концентрации казеинового пептона в питательной среде [5], тогда как у Lactobacillus hevelticus H9 два разных паттерна экспрессии гена PrtP идентифицированы во время фазы роста и были связаны с расщеплением альфа- и бета-казеинов [6]. Различия, обнаруженные в протеиназах молочнокислых бактерий, объясняют разнообразие образующихся биоактивных пептидов, даже когда используется один и тот же белковый матрикс, и их состав зависит от аминокислотной специфичности, в которой проводится гидролитическая ферментативная реакция.
Существуют некоторые серьезные проблемы с применением биоактивных пептидов, связанные с их структурными характеристиками и экономическими затратами на производство [7]. Ферментация молочнокислых бактерий считается экономичным и масштабируемым способом получения биоактивных пептидов, но как только устанавливаются оптимальные условия роста бактерий, которые способствуют высвобождению биоактивных пептидов, наступает этап, когда начинаются такие нежелательные модификации в сырье, как деградация и денатурация, влияющие на биоактивность. Как и в случае бактериоцинов, методы инкапсуляции могут способствовать не только повышению их стабильности, но и усилению их транспорта через клеточную мембрану [8].
Принимая во внимание доступность полных бактериальных геномов онлайн, теоретические исследования функциональности генных кластеров различных молочнокислых бактерий требуют меньше времени, чем классические методы обнаружения функциональных пептидов.
Потенциал биоактивных пептидов на основе молочнокислых бактерий можно предсказать двумя способами: (а) геномный анализ компонентов протеолитической системы молочнокислых бактерий для выявления различных ферментативных активностей или субэлементов и их стратегических особенностей и (б) подход т зйгео с использованием методов количественного соотношения структура - активность ^БАЯ) для оценки белкового матрикса, который может высвобождать биоактивные пептиды [9]. Объединение биоинформационных инструментов с экспериментальными результатами обеспечивает основу для прогноза потенциального пептида и может служить для выбора из больших количеств штаммов молочнокислых бактерий.
Образование биоактивных пептидов зависит от ферментативной активности микроорганизма. Как и в случае бактериоцинов, факторы, влияющие на биосинтез ферментов, специфичны для штамма. На молекулярном уровне на экспрессию протеолитической системы влияет наличие белков, аминокислот и углерода. Кроме того, на уровень синтеза ферментов влияет фаза роста микроорганизмов - активность сохраняется в течение экспоненциальной фазы и в начальный период стационарной фазы, но уменьшается в ходе прогрессирования стационарной фазы. Также изменения ферментативной активности связаны с целостностью бактериальных клеток -ферментативная активность внутриклеточных экстрактов будет существенно ниже ферментативной активности целой живой клетки.
При выработке ферментированных колбасных изделий со стартовыми культурами их пептидный профиль значительно изменяется. Так, рост микроорганизмов в мясной системе на стадии ферментации приводит к уменьшению концентрации пептидов с молекулярными массами свыше 3 кДа и увеличению образования низкомолекулярных пептидов с молекулярными массами ниже 3 кДа, что позволяет сделать предположение о возможном наличии у них биологической активности.
Тем не менее, как указано выше, существуют некоторые сложности с применением биоактивных пептидов, связанные с их структурными характеристиками и экономическими затратами на производство [10]. Так, установление оптимальных условий для роста культур, повышающих к тому же их способность к гидролизу мышечных белков, может отрицательно сказаться на биологической активности продуктов гидролиза. Данную проблему можно решить, используя методы микрокапсулирования. Включение стартовых культур в микрокапсулы может не только повысить их жизнеспособность, но и способствовать повышению стабильности и увеличению эффективности транспортировки через клеточную мембрану их метаболитов.
Также использование стартовых культур в мясной промышленности ограничивается производством сырых ферментированных мясопродуктов и изделий с длительной осадкой. Это связано с потерей жизнеспособности стартовых культур после термической обработки. При нагреве продукта до температуры 70±2 °С в процессе тепловой обработки наблюдается практи-
чески полное прекращение роста мезофильной и частично термофильной микрофлоры и спорообразующих бактерий в вегетативной форме. Поэтому, на наш взгляд, решением такой проблемы будет использование микрокапсулированных стартовых культур, способных сохранять свою жизнедеятельность во время технологического процесса. У микрокапсулированных стартовых культур усиливается синтез вторичных метаболитов (ферментов, бактериоцинов), которые проникают через капсулу и попадают в мясное сырье [11]. В связи с этим целью данного исследования являлось изучение влияния микрокапсулированных стартовых культур на образование биоактивных пептидов в вареных колбасах.
Материалы и методы
Культивирование клеток микроорганизмов. Культивирование выбранных штаммов осуществлялось в течение 24-48 ч при температуре 37±1 °С на плотной питательной среде de Man, Rogosa и Sharpe (MRS), рН среды -6,2±0,2 при 25±1 °С [12]. Отобранные штаммы представлены в табл. 1.
Таблица 1 [Table 1] Промышленно ценные штаммы микроорганизмов, используемые в работе [Industrially valuable strains of microorganisms used in the work]
№ п/п Штамм Номер ВКПМ
[No.p/p] [Strain] [VKPM number]
1 Latilactobacillus sakei 105 В-8905
2 Lactobacillus acidophilus AT-41 В-6545
3 Latilactobacillus curvatus 1 В-8889
4 Latilactobacillus sakei 103 В-8932
5 Latilactobacillus curvatus 2 В-8906
6 Pediococcus acidilactici 38 В-8902
7 Pediococcus pentosaceus 28 В-8888
8 Staphylococcus carnosus 111-2 В-8950
ПЦР протеолитических штаммов. Скрининг протеолитических генов исследуемых штаммов осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплификацию образцов проводили на амплифкаторе «T100 Thermal Cycler» (BIO-RAD, Бангладеш). Детекцию ПЦР-ампли-фикационной смеси осуществляли путем электрофоретического разделения в агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием. Визуализацию электрофоретической картины проводили в системе гель-документирования Gel Doc XR+ (BIO-RAD, США).
Исследование термостабильности микрокапсул и заключенных в них стартовых культур. Для определения термостабильности выбранных микрокапсулированных стартовых культур проведена термическая обработка капсул - нагрев до 72±1 °С. Для более равномерного прогрева капсулы помещали в дистиллированную воду с температурой 25±1 °С, после достижения температуры воды 72±1 °С прогрев продолжали еще в течение
5 мин. По завершении термической обработки капсулы остужали и помещали в стерильные чашки Петри в количестве 10 штук в каждую, а затем заливали охлажденным стерильным меловым агаром (опыт).
Аналогичным образом меловым агаром заливали капсулы, не подвергнутые тепловой обработке (контроль). Состав мелового агара (МА) (г/л): протеозопептон - 5,0, дрожжевой экстракт - 10,0, лактоза - 10,0, глюкоза -10,0, кальция карбонат - 5,0, агар - 12,0. Инкубация чашек осуществлялась в течение 48 ч при температуре 37±2 °С. О результатах судили по количеству капсул, вокруг которых образовалась зона просветления, обусловленная нейтрализацией кальция в среде молочной кислотой, которую синтезировали микрокапсулированные стартовые культуры.
Выработка вареной колбасы. В полупроизводственных условиях ФГБОУ ВО «МГУПП» осуществлена выработка вареной колбасы «Докторская» по ГОСТ 23670-2019 Изделия колбасные вареные мясные. Технические условия (Russian Standard). Технические условия (Russian Standard), а также с внесением в рецептуру (табл. 2) микрокапсулированных клеток.
Таблица 2 [Table 2] Рецептура вареной колбасы «Докторская» по ГОСТ 23670 с микрокапсулами [Recipe for boiled sausage "Doctorskaya" according to GOST 23670 with microcapsules]
№ п/п [No.p/p] Сырье/ингредиенты [Raw materials/ingredients] Содержание на 100 кг [Content per 100 kg]
Несоленое сырье, кг
1 Говядина жилованная в/с 25,0
2 Свинина жилованная п/ж 70,0
3 Меланж 3,0
4 Молоко коровье сухое 2,0
Итого 100,0
5 | Влага на сырье (+лед) 20,0
Итого 120,0
Пряности, г
6 Нитритно-посолочная смесь 2090,0
7 Сахар-песок 200,0
8 Мускатный орех молотый 50,0
9 Капсулы 500,0
Протеомное исследование. Состояние белкового профиля вареных колбас с микрокапсулами исследовали с помощью двумерного электрофореза (2ДЭ) по О'Фарреллу [13] с изоэлектрофокусированием в амфолиновом градиенте рН (1БР-РЛОБ); последующую детекцию белков проводили окрашиванием бромфеноловым синим СВВ R-250 и азотнокислым серебром. При подготовке препаратов для 2Б-электрофореза 100 мг измельченного образца гомогенизировали в 2 мл лизирующего раствора (9 М мочевины, 5% меркаптоэтанола, 2% Тритона Х-100, 2% амфолинов, рН 3,5-10, система тефлон-стекло). Гомогенат осветляли центрифугированием (5 мин, 800 §), надосадочную фракцию, содержащую экстракт белков, использовали для фракционирования в равных нанесениях по 50-75 мкл.
После трипсинолиза белковые фракции идентифицировали методами MALDI-TOF (опосредованная матрицей времяпролетная лазерная десорбция / ионизация) и MS/MS (тандемная) масс-спектрометрии (масс-спектрометр Ultraflex, «Bruker», Германия) с УФ-лазером (X = 336 нм) в режиме детекции положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да с их калибровкой по известным пикам автолиза. Для изучения спектра коротких пептидов (с m/z 1500-5000) 100 мг препарата гомогенизировали в 2 мл буфера (5,8 мг KH2PO4; 232 мг Na^O^^O; 2,2 г NaCl; 0,5 мл 10% Тритона Х-100; 1,87 г KCl) и дополнительно разводили водой до 50 мл. Гомогенат осветляли центрифугированием (5 мин, 800 g). В надосадочной фракции определяли спектры пептидов. Анализ масс-спектров триптиче-ских пептидов выполняли с помощью программы Mascot, опция Peptide Fingerprint («MatrixScience», США) при точности определения массы МН+ 0,01% с поиском по базам данных NCBI.
Статистическая обработка. Статистическую обработку количественных данных проводили с использованием пакета программ STATISTICA 14.0 («StatSoft, Inc.», США). Все измерения выполняли в 3 повторностях. Результаты представлены в виде взвешенного среднего (WAM, weighted arithmetic mean) со стандартным отклонением (±SD). Статистическую достоверность рассчитывали с применением непараметрических U-критерия Манна-Уитни (Mann-Whitney U-test) и H-критерия Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis H-test). Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.
Результаты и обсуждения
Отбор штаммов. Подобранные для микрокапсулирования штаммы являются промышленно ценными стартовыми культурами, разрешенными к применению в мясной промышленности. Протеолитическая активность штаммов и их специфичность воздействия на белки мышечной ткани установлены на основании ранних этапов исследований [14, 15].
На данном этапе для некоторых исследуемых стартовых культур также проведен скрининг генов протеиназ, обусловливающих протеолитическую активность, методом ПЦР (рис. 1).
По результатам ПЦР-скрининга у штаммов P. acidilactici 38 и P. pento-saceus 28 выявлены протеолитические гены семейства PRTB10/PRTB20 (597 п.н.) и P15C/P06C (560 н.п.), а у штамма L. acidophilus AT-45 обнаружены гены семейства Jp23/Jp25 (1034 п.н.) и prti2/IP6Xba (1052 п.н.). Пара генов prti2/IP6Xba (1052 п.н.) также обнаружена у штамма S. сarnosus 111-2. Полученные результаты подтверждают закономерное присутствие генов протеиназ у штаммов рода Lactobacillus. Например, работа Strahinic et al. [16], в которой проводили поиск генов протеиназ у штаммов рода Lactobacillus, показала, что у 28 штаммов Lactoplantibacillus plantarum и 2 штаммов Lactoplantibacillus paraplantarum выявлен широкий спектр генов семейства PrtP/PrtM, позволяющих им гидролизовать Р-казеин.
10000
8000 L. л-II-1
s № ® rt -t C1 W OO ГЛ ^r
5000 ^ О-. Ю On «Л О a.00 S Л
4ППЛ » » » ® « M & » & ю
Рис. 1. Результат электрофоретического разделения ПЦР-смеси: 8902 - Pediococcus acidilactici 38, 8888 - Pediococcuspentosaceus 28, 8950 - Staphylococcus earnosus 111-2, 6545 - Lactobacillus acidophilus AT-45, 8932 - Latilactobacillus sakei 103; a - пара генов
PrtP700 и PrtM700 (685 н.п.), b - пара генов Jp23 и Jp25 (1034 п.н.), c - пара генов PRTB10 и PRTB20 (597 п.н.); d - пара генов P15C и P06C (560 н.п.), e - пара генов prti2 и IP6Xba (1052 п.н.); St, bp - стандартный маркер GeneRuler 1kb DNA Ladder.
Стрелками на электрофореграмме указаны соответствующие гены [Fig. 1. The result of electrophoretic separation of the PCR mixture: 8902 - Pediococcus acidilactici 38, 8888 - Pediococcus pentosaceus 28, 8950 - Staphylococcus carnosus 111-2, 6545 - Lactobacillus acidophilus AT-45, 8932 - Latilactobacillus sakei 103; a, PrtP700 and PrtM700 gene pair (685 bp), b, Jp23 and Jp25 gene pair (1034 bp), c, PRTB10 and PRTB20 gene pair (597 bp); d, P15C and P06C gene pair (560 bp), e, prti2 and IP6Xba gene pair (1052 bp); St, bp - GeneRuler 1kb DNA Ladder standard marker. The arrows on the electrophoregram indicate the corresponding genes]
Также в работах Kojic et al. [17] и Holck et al. [18] обнаружены гены семейства PrtP/PrtM в штаммах Lacticaseibacillus paracasei ssp. paracasei BGHN14 и у Lacticaseibacillus paracasei ssp. paracasei NCDO 151. Были секвенированы гены, кодирующие протеиназы клеточной стенки, обозначенные как prtB, prtH и prtR из Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus NCDO 1489, L. helveticus CNRZ32 и L. rhamnosus BGT10 соответственно, в исследовании Gilbert et al. [19].
Микрокапсулирование. В качестве гелеобразующего компонента для микрокапсулирования использовался природный полисахарид, получаемый преимущественно из бурых водорослей, - альгинат натрия. Микро-
капсулирование осуществлялось диффузионным методом, который подразумевает внесение капель суспензии клеток в растворе альгината натрия в раствор соли кальция. В нашем исследовании использовался 0,1 М раствор хлорида кальция [20]. Концентрация клеток в бактериальной суспензии на основе 0,85%-го раствора хлорида натрия составляла 1*1010 КОЕ/мл (по стандарту мутности МсРаг1апф. Концентрация альгината натрия подбиралась эмпирическим путем. Для сравнения брали растворы альгината натрия в минимальных рабочих концентрациях - 1, 3 и 5%. Соотношение суспензия: альгинатный гель - 1 : 5. Были сформированы альгинатные капсулы диаметром 1-4 мм с включенными в них стартовыми культурами (рис. 2), а также установлена оптимальная концентрация раствора альгината натрия (табл. 3).
f
И*
k¡ érjz - ? V
г.? аГ
а ь с
Рис. 2. Изображение микрокапсул с разными концентрациями альгината натрия: a - капсулы из 1%-го раствора альгината натрия; b - капсулы из 3%-ого раствора альгината натрия; c - капсулы из 5%-ого раствора альгината натрия [Fig. 2. Image of microcapsules with different concentrations of sodium alginate: a - capsules from 1% sodium alginate solution; b - capsules from 3% sodium alginate solution; c - capsules from 5% sodium alginate solution]
Таблица 3 [Table 3] Характеристика капсул с различными концентрациями альгината натрия [Characterization of capsules with different concentrations of sodium alginate]
Концентрация альгината натрия в смеси, % [The concentration of sodium alginate in the mixture, %] Характеристика полученных капсул [Characteristics of the obtained capsules]
1,0 Капсулы формируются плохо; концентрации альгината недостаточно для формирования капсул; капсулы прозрачные
3,0 Капсулы формируются хорошо; диаметр капсул - 2-4 мм; капсулы сферической формы, но поверхность неоднородная; немного приплюснуты; капсулы молочного цвета
5,0 Капсулы формируются хорошо, диаметр капсул - 1-2 мм, капсулы имеют строго сферическую форму; поверхность однородная; капсулы молочного цвета
По результатам визуального сравнительного анализа наиболее предпочтительным является использование 5%-го раствора альгината натрия, так
как при этом образуются прочные сферические капсулы с включенными в них стартовыми культурами.
При этом несмотря на то, что альгинату натрия свойственно образовывать необратимые гели даже при низких температурах (холодный раствор соли кальция), рекомендуется нагревать раствор соли до 35-40 °С, так как при данных температурных режимах процесс гелеобразования протекает интенсивнее. Следует также отметить, что после двукратной отмывки готовых капсул стерильной дистиллированной водой капсулы могут быть лио-филизированы. Срок хранения таких капсул при -20 °С не более 12 мес.
Chandranouli et al. [21] изучали жизнеспособность L. acidophilus, инкапсулированных при различных концентрациях альгината кальция - 0,5; 1,8 и 2% в присутствии желудочного сока (рН 2,0). Наиболее высокие значения выживаемости клеток получены для капсул с 2%-ным раствором альгината кальция — 1х 106 КОЕ/г, что было определено методом аэробного посева на чашках Петри.
В другом исследовании Ozer et al. [22] микрокапсулировали Lactobacil-lus acidophilus в 2% альгинатный гель, использовали при производстве белого сыра методом экструзии и анализировали его в течение 90 дней хранения при температуре 4 °С, получив высокое значение жизнеспособных клеток - 1х106 КОЕ/г методом аэробного посева.
Оценка термостабильности капсул. Выработка вареных колбас. На следующем этапе планировалась выработка вареной колбасы с микрокап-сулированными стартовыми культурами. Известно, что технология производства вареных колбасных изделий на одном из технологических этапов включает термическую обработку колбасных батонов: 90-95 °С для стадии обжарки и 75-85 °С для стадии варки. При достижении температуры 72 °С в центре батона продукт считается готовым. В обычных условиях такая температура губительна для большинства микроорганизмов: происходит коагуляция белковых компонентов микробной клетки и ее обезвоживание. Так, Todorov et al. в своем исследовании отмечали, что при температуре свыше 50 °С рост молочнокислых бактерий значительно снижается ввиду денатурации белковых компонентов клетки [23, 24]. Тем не менее Pérez-Chabela et al. выделили штаммы L. plantarum, L. curvatus, P. pentosaceus и P. acidilactici из вареных колбасных изделий, что подтверждает факт их выживания после тепловой обработки до 70 °С [25]. В их исследовании данные штаммы подвергались нагреванию при температуре 70 °С в течение 60 мин. Жизнеспособность клеток при этом сохранилась.
В результате инкубации чашек с микрокапсулированными штаммами выявлено, что жизнеспособность после термообработки сохранили не все исследуемые штаммы. Так, зафиксировано образование зон просветления в опытных чашках с термообработанными капсулами, содержащими штаммы P. acidilactici 38, P. pentosaceus 28 и L. acidophilus AT-41 (рис. 3). Из 10 инкубируемых в агаре капсул зоны просветления образовались вокруг 8, 9 и 7-х капсул соответственно (в контрольных чашках зоны просветления образовались вокруг всех 10 капсул). Доля выживаемости составила
70-90%. В опытных чашках с микрокапсулированными штаммами Ь. sakei 105, Ь. curvatus 1, Ь. sakei 103, Ь. curvatus 2 и 3. сагпотъ 111-2 возникли зоны просветления вокруг 4, 6, 6, 5 и 3-х капсул соответственно. Доля выживаемости составила 30-60 %.
Рис. 3. Картина зон просветления вокруг микрокапсул на меловом агаре: a - контрольная чашка с меловым агаром; b - чашка с микрокапсулированным штаммом Lactobacillus acidophilus AT-41 до термообработки; c - чашка с микрокапсулированным штаммом Lactobacillus acidophilus AT-41 после термообработки [Fig. 3. Pattern of clearing zones around microcapsules on chalk agar: a - control plate with chalk agar; b - plate with microencapsulated Lactobacillus acidophilus AT-41 strain before heat treatment; c - plate with microencapsulated Lactobacillus acidophilus AT-41 strain after heat treatment]
Так, в исследовании, проведенном Kim et al. [26], получены положительные результаты для L. acidophilus ATCC 43121, инкапсулированных в 2% альгинатный гель капельным методом. При термической обработке и при воздействии в модели желудочно-кишечного тракта in vitro капсулы проявляли устойчивость, а внесенные клетки сохраняли свою жизнеспособность. Так, количество клеток после обработки сохранялось на первоначальном уровне - 1*106 КОЕ/г (метод аэробного посева). В работе Mona et al. [27] выявлено, что жизнеспособность клеток L. plantarum, инкапсулированных в 3%-ных альгинатный гель и прогретых до 65 °С, составляла 1х106 КОЕ/г (метод аэробного посева).
Протеомное исследование. Для выработанных в полупроизводственных условиях ФГБОУ ВО «МГУПП» вареных колбас с внесенными в рецептуру микрокапсулированными стартовыми культурами проведено исследование белкового профиля. Первый образец представлял исходный колбасный фарш (Ф), второй - контрольный образец вареной колбасы без добавления стартовых культур (К), а в остальные шесть добавляли капсулиро-ванные композиции различных стартовых культур: О1 - образец с композицией из L. sakei 105 + P. pentosaceus 28 + S. carnosus 111-2 (1:1:1), О2 -образец с композицией + L. acidilactici (1:1), О3 - образец с культурой L. acidilactici AT-41, О4 - образец с культурой P. pentosaceus 28, О5 - образец с культурой L. sakei 105, О6 - образец с культурой S. carnosus 111-2.
При окрашивании геля красителем СВВ R-250 особых отличий в элек-трофореграмме не выявлено. На рис. 4 представлены ДЭ исходного фарша, контрольного образца вареной колбасы и одного из опытных образцов, обработанного композицией. Отмечается некоторое общее уменьшение
белкового материала по сравнению с исходным фаршем. Часть белков под воздействием микрокапсулированных стартовых культур и термообработки, возможно, переходила в низкомолекулярные компоненты, не детектируемые на 2ДЭ-электро-фореграмме. Результаты идентификации представлены в табл. 4. Согласно полученным данным, фракция № 1 оказалась С-концевым фрагментом мышечной креатинфосфокиназы. В исходном фарше она практически не детектировалась, в контрольной колбасе она явно увеличилась, очевидно, вследствие термических изменений структуры актомиозинового комплекса. В остальных образцах ее количество было сопоставимо с контрольным образцом за исключением образца О4, где количество оказалось минимальным, сопоставимым с исходным фаршем, что могло явиться результатом действия использования соответствующей комбинации стартовых культур именно на креатинфосфокиназу.
Фракции № 2, 18 и 19: № 2 идентифицирована как кофилин 2. Термообработка привела к его уменьшению, но в образцах О3, О5 и О6 его количество сохранилось на уровне исходного фарша. № 18 - фрагменты овотрансферрина куриного яйца и аВ кристаллина. Фрагменты кристал-лина - стандартный продукт автолиза мышечных тканей и результатов термообработки, а во фракции № 19 обнаружен еще один фрагмент, но другой, мышечной креатинфосфокиназы. В образцах О5 и О6 количество выявленных фракций было больше, чем в фарше и контрольном образце, что показывает специфичность действия этих композиций на конкретные белковые структуры.
Рис. 4. 2ДЭ-электрофореграммы образцов вареных колбас: a - 2ДЭ-электрофореграмма исходного фарша; b - 2ДЭ-электрофореграмма контрольного образца; c - 2ДЭ-электрофореграмма опытного образца О2. Окрашивание СВВ R-250
[Fig. 4. 2DE electrophoregrams of boiled sausage samples: a - 2DE electrophoregram of the original minced meat; b - 2DE electropherogram of the control sample; c - 2DE electropherogram of the O2 test sample. Staining SVV R-250]
Для фракции № 3 - легкой цепи миозина медленного типа 6В можно отметить нарастание количества после термообработки и обработки стартовыми культурами, кроме образца О3, что, очевидно, обусловлено воздействием на структуры актимиозинового комплекса.
№ 4 - фрагмент ENO1. В контроле (после термообработки) его количество уменьшается примерно вдвое по сравнению с исходным фаршем, но в образцах О1, О2, О4 оно сопоставимо с исходным фаршем, а в образцах
О3, О5, О6 образование этого фрагмента находится на уровне термообра-ботанного контроля.
Фракции № 6-9 идентифицированы как разные изоформы тропонинов I, в основном быстрого типа. В образцах О2, О5 и О6 их количество начинает существенно снижаться, кроме этого, во фракции № 9 начинает детектироваться и фрагмент белка, включающего PDZ домен.
Фракции № 10-11 оказались фрагментами а.п. 71-184 глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы. Термообработка вела к увеличению количества этих фрагментов, за исключением образцов О5 и О6, где их количество находилось на уровне исходного фарша.
№ 12, 16 - регуляторная легкая цепь миозина 2. Наблюдалось определенное количественное уменьшение при термообработке и особенно выраженное в образце О5. Кроме этого, впервые выявлено фосфорилирова-ние по позиции 16S, ранее документально не доказанное. В образцах О4 и О6 явно увеличилось количество аденилаткиназы 1 (№ 13).
На фоне термообработки также наблюдалось увеличение количества медленного тропонина I (№ 15) и быстрого тропонина Т, которые активно разрушались в образцах О3 и О6.
В целом можно отметить, что культуры, использованные в образцах № О1, О3, О5 и О6, активно взаимодействуют с белками актомиозинового комплекса. А в образце О4 использованная культура в первую очередь затрагивает ферменты энергетического обмена.
Можно предположить, что использование альгинатных микрокапсул несколько замедляет процесс ферментации мясной продукции. Для большего эффекта, очевидно, надо увеличивать вносимую дозу препаратов.
Таблица 4 [Table 4] Результаты масс-спектрометрической идентификации (MALDI-TOF MS и MS / MS) ряда избранных фракций белков из исследованных образцов
вареной колбасы
[Results of mass spectrometric identification (MALDI-TOF MS and MS/MS) of a number of selected protein fractions from the studied samples of boiled sausage]
№ Наименование белка (символ гена) [Name of the protein (gene symbol)] Номера в Protein NCBI или SwissProt [Numbers in Protein NCBI or SwissProt] S / M/ C Мм/pI (эксп.) [Мм/pI (exp.)] Мм/pI (расчет.) [Мм/pI (calc.)]
1 Смесь фрагментов С-концевой части молекулы мышечной креа-тинфосфокиназы; Creatine kinase M-type (CKM) Bos taurus и Sus scrofa KCRM_BOVIN KCRM_PIG 102/9/21 102/9/21 17,0/8,00 43,0/6,63 43,0/6,61
2 Смесь фрагментов кофилина 2; Cofilin-2 (CFL2) + Acetyl (Protein N-term) Bos Taurus и Cofilin-2 (CFL2) + Acetyl (Protein N-term) Sus scrofa COF2_BOVIN COF2_PIG 70/7/36 70/7/36 17,0/6,40 18,7/7,66 18,7/7,66
№ Наименование белка (символ гена) [Name of the protein (gene symbol)] Номера в Protein NCBI или SwissProt [Numbers in Protein NCBI or SwissProt] S / M/ C Мм/pI (эксп.) [Мм/pI (exp.)] Мм/pI (расчет.) [Мм/pI (calc.)]
3 Неохарактеризованный белок; Uncharacterized protein (MYL6B) семейства легких цепей миозина Sus scrofa F1SM01 140/21/72 25,0/5,90 24,0/5,53
4 Фрагмент а.п. 10-434 енолазы 1; Enolase 1 (ENO1) Sus scrofa A0A287B6S5 267/25/64 45,0/6,00 47,4/6,17
5 Легкая цепь миозина 6; Myosin light polypeptide 6 (MYL6B) Sus scrofa F1SM01 233/19/85 25,0/5,90 24,0/5,53
6 Быстрый скелетный тропонин I2; Troponin I2, fast skeletal type (TNNI2) Bos taurus F6QIC1 189/25/56 21,0/9,30 21,0/9,30
7 Быстрый скелетный тропонин I2; Troponin I2, fast skeletal type (TNNI2) Bos taurus F6QIC1 74/8/30 21,5/8,90 21,0/9,30
8 Тропонин I; Troponin I (TNNI2) Sus scrofa Q4JH15 281/37/67 21,5/9,35 21,3/9,02
9 Тропонин I; Troponin I (TNNI2) Sus scrofa с примесью фрагмента белка, включающего PDZ домен; PDZ Q4JH15 128/22/51 21,5/9,05 21,3/9,02
domain-containing protein (PDLIM7) (2) Sus scrofa A0A287AZ96 63/3/15 25,2/9,65
Смесь фрагмента а.п. 71-184 гли-
10 церальдегид-3-фосфат дегидроге-назы; Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (2) Sus scrofa и фрагмента а.п. 71-184 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (2) Bos taurus G3P_PIG G3P_BOVIN 67/4/11 65/4/11 22,5/9,10 35,8.8,51 35,8/8,50
Смесь фрагмента а.п. 71-184
11 глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы; Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (2) Sus scrofa и фрагмента а.п. 71-184 Glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase (GAPDH) (2) Bos Taurus G3P_PIG G3P_BOVIN 70/6/17 67/4/11 22,5/9,30 35,8.8,51 35,8/8,50
12 Смесь регуляторной легкой цепи миозина 2; Myosin regulatory light chain 2, skeletal muscle isoform A0A452DJW7 345/25/89 19,0/4,85 19,0/4,67
(MYLPF) (1) Bos Taurus и Myosin regulatory light chain 2 (MYLPF) (1) + Phospho (16S) Sus scrofa Q5XLD2 386/36/88 19,0/4,90
13 Смесь аденилат киназы; Adenylate kinase isoenzyme 1 (AK1) (1) Sus scrofa и adenylate kinase isoenzyme 1 Bos taurus (AK1) (1) P00571 P00570 464/34/89 292/26/77 22,0/7,60 21,6/8,38 21,6/8,40
№ Наименование белка (символ гена) [Name of the protein (gene symbol)] Номера в Protein NCBI или SwissProt [Numbers in Protein NCBI or SwissProt] S / M/ C Мм/pI (эксп.) [Мм/pI (exp.)] Мм/pI (расчет.) [Мм/pI (calc.)]
14 Смесь аВ кристаллина; Alpha-crystallin B chain (CRYAB)+ Acetyl (Protein N-term) Sus scrofa и Alpha-crystallin B chain (CRYAB) + Acetyl (Protein N-term) Bos taurus CRYAB_PIG CRYAB_BOVIN 162/16/78 141/16/78 20,0/7,70 20,1/6,76 20,0/6,76
15 Смесь тропонина I1; Troponin I1, slow skeletal type (TNNI1) Bos taurus и Troponin I (TNNI1) Sus scrofa G3MYN5 B3VCE8 115/15/58 129/16/60 22,0/9,30 21,7/9,73 21,6/9,61
16 Смесь регуляторной легкой цепи миозина 2; Myosin regulatory light chain 2 (MYLPF) (1) Sus scrofa + Phospho (16S) Sus scrofa и Myosin regulatory light chain 2, skeletal muscle isoform (MYLPF) Bos taurus Q5XLD2 A0A452DJW7 234/43/95 186/34/95 19,0/4,85 19,0/4,90 18,9/4,67
17 Смесь тропонина Т быстрых скелетных мышц; Troponin T, fast skeletal muscle (TNNT3) (2) Sus scrofa и фрагмента Troponin T, fast skeletal muscle (TNNT3) Bos taurus Q75NG7 A0A3S5ZPW3 82/14/36 90/15/33 30,0/8,90 30,7/8,69 40,2/9,34
18 Фрагмент овотрансферрина куриного яйца; Ovotransferrin (TF) (2) Gallus gallus и фрагмент без С-конца аВ кристаллина; Alpha-crystallin B chain (CRYAB)+ Acetyl (Protein N-term) Sus scrofa TRFE_CHICK CRYAB_PIG 188/30/45 154/17/85 19,0/6,50 80,0/6,85 20,0/6,76
19 Смесь фрагментов аВ кристаллина; Alpha-crystallin B chain (cRYAB) Bos Taurus, Alpha-crystallin B chain (CRYAB) Sus scrofa, мышечной креатинфосфокиназы; Creatine kinase M-type (CKM) (1) Bos Taurus и овотрансферрина; Ovotransferrin (TF) (1) Gallus gallus CRYAB_BOVIN CRYAB_PIG KCRM_BOVIN TRFE_CHICK 265/32/95 251/31/94 118/8/32 119/5/12 19,5/6,50 20,0/6,76 20,1/6,76 43,0/6,63 80,0/6,85
Заключение
1. Проведен подбор стартовых культур для микрокапсулирования. В качестве исследуемых культур выбраны L. sakei 105, L. acidophilus AT-41, L. curvatus 1, L. sakei 103, L. curvatus 2, P. acidilactici 38, P. pento-saceus 28, S. carnosus 111-2.
2. Проведено исследование генов протеиназ методом ПЦР. Установлено наличие у штаммов P. acidilactici 38 и P. pentosaceus 28 протеолитиче-ских генов PRTB10/PRTB20 (597 п.н.) и P15C/P06C, а у штамма L. acidophilus AT-45 - генов Jp23 /Jp25 (1034 п.н.) и prti2/IP6Xba (1052 п.н.). У штамма S. carnosus 111-2 также детектируются гены семейства prti2/IP6Xba (1052 п.н.).
3. Осуществлен подбор условий и проведено микрокапсулирование стартовых культур. Микрокапсулирование проводили в растворе 5%-го альгината натрия при 35-40 °С в течение 30 мин.
4. Исследована термостабильность микрокапсул: к нагреву до 72 °С. После тепловой обработки микрокапсулированные штаммы на 30-90 % сохраняли свою активность, что определено по зонам просветления вокруг капсул на меловом агаре за счет нейтрализации кальция молочной кислотой.
5. В полупроизводственных условиях выработаны вареные колбасы с включением в рецептуру микрокапсулированных стартовых культур. Про-теомное исследование образцов вареных колбас показало взаимодействие некоторых микрокапсулированных штаммов с белками актомиозинового комплекса. Микрокапсулированный штамм P. pentosaceus 28 оказывал существенное воздействие на мышечнотканные ферменты энергетического обмена - мышечную креатинфосфаткиназу, енолазу и аденилаткиназу.
Список источников
1. Liebich VOL.J., Avrutina O., Habermann J., Hillscher L.M., Langhans M., Meckel T., Biesalski M., Kolmar H. Toward fabrication of bioactive papers: covalent immobilization of peptides and proteins. Biomacromolecules. 2021. Vol. 22, № 7. PP. 2954-2962. doi: 10.1021/acs.biomac.1c00354
2. Udenigwe C.C. Bioinformatics approaches, prospects and challenges of food bioactive peptide research. Trends of Food Science and Technol. 2014. Vol. 36. PP. 134-143. doi: 10.1016/j.tifs.2014.02.004
3. Venegas-Ortega M., Flores-Gallegos A., Martínez-Hernández J., Aguilar C., Nevárez-Moorillón G. Production of bioactive peptides from lactic acid bacteria: A sustainable approach for healthier foods // Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2019. Vol. 18, № 4. PP. 1039-1051. doi: 10.1111/1541-4337.12455
4. Чернуха И.М., Машенцева Н.Г., Вострикова Н.Л., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Афанасьев Д. А. Образование биологически активных пептидов в мясном сырье под влиянием лизатов стартовых бактериальных культур // Сельскохозяйственная биология. 2020. В. 55, № 6. C. 1182-1203. doi: 10.15389/agrobiology.2020.6.1182rus
5. Vukotic G., Mirkovic N., Jovcic B., Miljkovic M., Strahinic I., Fira D., Radulovic Z., Kojic M. Proteinase PrtP impairs lactococcin LcnB activity in Lactococcus lactis BGMN1-501 // New insights into bacteriocin regulation. Frontiers in Microbiology. 2015. № 6. P. 92. doi: 10.3389/fmicb.2015.00092
6. Agyei D., Danquah M. Industrial-scale manufacturing of pharmaceutical-grade bioactive peptides // Biotechnology Advances. 2011. Vol. 29, № 3. PP. 272-277. doi: 10.1016/j.biotechadVol.2011.01.001
7. Hu B., Ting Y., Yang X., Tang W., Zeng X., Huang Q. Nanochemoprevention by encapsulation of (-)-epigallocatechin-3-gallate with bioactive peptides/chitosan nanoparticles for enhancement of its bioavailability // Chemical Communications. 2012. Vol. 48, № 18. PP. 2421-2423. doi: 10.1039/C2CC17295J
8. Gu Y., Majumder K., Wu J. QSAR-aided in silico approach in evaluation of food proteins as precursors of ACE inhibitory peptides // Food Research International. 2011. Vol. 44, № 8. PP. 2465-2474. doi: 10.1016/j.foodres.2011.01.051
9. Chakrabarti S., Guha S., Majumder K. Food-derived bioactive peptides in human health: challenges and opportunities // Nutrients. 2010. Vol. 10, № 11. P. 1738. doi: 10.3390/nu10111738
10. Mahmoud M., Abdallah N., El-Shafeia K., Tawfika N., El-Sayed H. Survivability of algi-nate-microencapsulated Lactobacillus plantarum during storage, simulated food processing and gastrointestinal c onditions // Heliyon. 2020. Vol. 6, № 3. P. e03541. doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e03541
11. Ji R., Wu J., Zhang J., Wang T., Zhang X., Shao L., Chen D., Wang J. Extending viability of Bifidobacterium longum in chitosan-coated alginate microcapsules using emulsification and internal gelation encapsulation technology // Frontiers in Microbiology. 2019. № 10. PP. 1-10. doi: 10.3389/fmicb.2019.01389
12. De Man J.C., Rogosa M.A., Sharpe E. A medium for the cultivation of Lactobacilli // Journal of Applied Microbiology. 2008. Vol. 23. PP. 130-135. doi: 10.1111/j. 1365-2672.1960.tb00188.x
13. Ковалев Л.И., Шишкин C.C., Ковалева М.А., Иванов А.В., Вострикова Н.Л., Чернуха И.М. Протеомное изучение белков в образцах свинины и выработанных из нее мясных продуктах // Всё о мясе. 2013. № 3. С. 32-34.
14. Афанасьев Д.А., Клабукова Д.Л., Машенцева Н.Г., Ахремко А.Г., Куликовский А. В., Чернуха И. М. Влияние стартовых культур на технологические и биохимические показатели сырокопченых колбас // Мясная индустрия. 2016. № 12. С. 1822
15. Афанасьев Д. А., Машенцева Н.Г., Чернуха И.М. Биологически активные пептиды как продукт микробной ферментации мясного сырья и готовых мясных продуктов // Пищевая промышленность. 2019. № 4. С. 20-22. doi: 10.24411/0235-2486-201910009
16. Strahinic I., Kojic M., Tolinacki M., Fira D., Topisirovic L. The presence of prtP proteinase gene in natural isolate Lactobacillus plantarum BGSJ3-18 // Letters and Applied Microbiology. 2010. № 50. PP. 43-49. doi: 10.1111/j.1472-765X.2009.02748.x
17. Kojic M., Fire D., Banina A., Topisirovic L. Characterization of the cell wall-bound proteinase of Lactobacillus casei HN14 // Applied and Environmental Microbiology. 1991. № 57. PP. 1753-1757. doi: 10.1128/AEM.57.6.1753-1757.1991
18. Holck A., Naes H. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding the cell-envelope-associated proteinase from Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NCDO 151 // Microbial Genomic. 1992. № 38. PP. 1353-1364. doi: 10.1099/00221287-138-71353
19. Gilbert C., Danielle A., Blanc B., Portailer R., Germond J.E., Lapierre L., Mollet B. A new cell surface proteinase - sequencing and analysis of the prtB gene from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus // Journal of Bacteriology. 1996. № 178. PP. 3059-3065. doi: 10.1128/jb.178.11.3059-3065.1996
20. Zhang W.Y., Chen Y.F., Zhao W.J., Kwok L.Y., Zhang H.P. Gene expression of proteo-lytic system of Lactobacillus helveticus H9 during milk fermentation // Annals of Microbiology. 2015. Vol. 65, № 2. PP. 1171-1175. doi: 10.1007/s13213-014-0902-3
21. Chandramouli V., Kailasapathy K., Peiris P., Jones M. An improved method of microen-capsulation and its evaluation to protect Lactobacillus spp. in simulated gastric conditions // Journal of Microbiological Methods. 2004. Vol. 56, № 1. PP. 27-35. doi: 10.1016/J.MIMET.2003.09.002
22. Ozer B., Kirmaci H., §enel E., Atamer M., Hayaloglu A.A. Improving the viability of Bifidobacterium bifidum BB-12 and Lactobacillus acidophilus LA-5 in white-brined cheese by microencapsulation // International Dairy Journal. 2009. Vol. 19, № 1. PP. 2229. doi: 10.1016/j.idairyj.2008.07.001
23. Cebrian G., Condon S. Physiology of the inactivation of vegetative bacteria by thermal treatments: mode of action, influence of environmental factors and inactivation kinetics // Foods. 2017. Vol. 6, № 12. P. 107. doi: 10.3390/foods6120107
24. Todorov S.D., Stojanovski S., Iliev I., Moncheva P., Nero L.A., Ivanova I.V. Technology and safety assessment for lactic acid bacteria isolated from traditional Bulgarian fermented meat product "lukanka" // Brazilian Journal of Microbiology. 2017. Vol. 48, № 3. PP. 576-586. doi: 10.1016/j.bjm.2017.02.005
25. Ramirez-Chavarin N., Wacher C., Carlos E., Pérez-Chabela M.L. Probiotic potential of thermotolerant lactic acid bacteria strains isolated from cooked meat products // International Food Research Journal. 2013. Vol. 20, № 2. PP. 991-1000.
26. Kim S.J., Cho S., Kim S., Song O., Shin I., Cha D., Park H. Effect of microencapsulation on viability and other characteristics in Lactobacillus acidophilus ATCC 43121 // LWT -Food Science and Technology. 2008. Vol. 41, № 3. PP. 493-500. doi: 10.1016/J.LWT.2007.03.025
27. Mahmoud M., Abdallah N., El-Shafei K., Tawfik N.F., El-Sayed H.S. Survivability of alginate-microencapsulated Lactobacillus plantarum during storage, simulated food processing and gastrointestinal conditions // Heliyon. 2020. Vol. 6, № 3. PP. E03541. doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e03541
References
1. Liebich VJ, Avrutina O, Habermann J, Hillscher LM, Langhans M, Meckel T, Biesalski M, Kolmar H. Toward fabrication of bioactive papers: covalent immobilization of peptides and proteins. Biomacromolecules. 2021;22(7):2954-2962. doi: 10.1021/acs.biomac.1c00354
2. Udenigwe CC. Bioinformatics approaches, prospects and challenges of food bioactive peptide research. Trends of Food Science and Technol. 2014;36:134-143. doi: 10.1016/j.tifs.2014.02.004
3. Venegas-Ortega M, Flores-Gallegos A, Martínez-Hernández J, Aguilar C, Nevárez-Moorillón G. Production of bioactive peptides from lactic acid bacteria: A sustainable approach for healthier foods. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2019;18(4):1039-1051. doi: 10.1111/1541-4337.12455
4. Chernukha IM, Mashentseva NG, Vostrykova NL, Kovalev LI, Kovaleva MA, Afanasev DA. Obrazovaniye biologicheski aktivnykh peptidov v myasnom syr'ye pod vliyaniyem lizatov startovykh bakterial'nykh kul'tur. Sel'skokhozyaystvennaya biologiya. 2020;55(6): 1182-1203. doi: 10.15389/agrobiology.2020.6.1182rus. In Russian
5. Vukotic G, Mirkovic N, Jovcic B, Miljkovic M, Strahinic I, Fira D, Radulovic Z, Kojic M. Proteinase PrtP impairs lactococcin LcnB activity in Lactococcus lactis BGMN1-501: New insights into bacteriocin regulation. Frontiers in Microbiology. 2015;6:92. doi: 10.3389/fmicb.2015.00092
6. Agyei D, Danquah M. Industrial-scale manufacturing of pharmaceutical-grade bioactive peptides. Biotechnology Advances. 2011;29(3):272-277. doi: 10.1016/j.biotechadVol.2011.01.001
7. Hu B, Ting Y, Yang X, Tang W, Zeng X, Huang Q. Nanochemoprevention by encapsulation of (-)-epigallocatechin-3-gallate with bioactive peptides/chitosan nanoparticles for enhancement of its bioavailability. Chemical Communications. 2012;48(18):2421-2423. doi: 10.1039/C2CC17295J
8. Gu Y, Majumder K, Wu J. QSAR-aided in silico approach in evaluation of food proteins as precursors of ACE inhibitory peptides. Food Research International. 2011;44(8):2465-2474. doi: 10.1016/j.foodres.2011.01.051
9. Chakrabarti S, Guha S, Majumder K. Food-derived bioactive peptides in human health: challenges and opportunities. Nutrients. 2010;10(11):1738. doi: 10.3390/nu10111738
10. Mahmoud M, Abdallah N, El-Shafeia K, Tawfika N, El-Sayed H. Survivability of alginate-microencapsulated Lactobacillus plantarum during storage, simulated food processing and gastrointestinal conditions. Heliyon. 2020;6(3):e03541. doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e03541.
11. Ji R, Wu J, Zhang J, Wang T, Zhang X, Shao L, Chen D, Wang J. Extending viability of Bifidobacterium longum in chitosan-coated alginate microcapsules using emulsification and internal gelation encapsulation technology. Frontiers in Microbiology. 2019;10:1-10. doi: 10.3389/fmicb.2019.01389
12. De Man JC, Rogosa MA, Sharpe E. A medium for the cultivation of Lactobacilli // Journal of Applied Microbiology. 2008;23:130-135. doi: 10.1111/j.1365-2672.1960.tb00188.x
13. Kovalev LI, Shishkin SS, Kovaleva MA, Ivanov AV, Vostrykova NL, Chernukha IM. Proteomnoye izucheniye belkov v obraztsakh svininy i vyrabotannykh iz neye myasnykh produktakh. Vso o myase. 2013;3:32-34. In Russian
14. Afanasev DA, Klabukova DL, Mashentseva NG, Ahremko AG, Kulikovsky AV, Chernu-kha IM. Vliyaniye startovykh kul'tur na tekhnologicheskiye i biokhimicheskiye pokazateli syro-kopchenykh kolbas. Myasnaya industriya. 2016;12:18-22. In Russian
15. Afanasev DA, Mashentseva IM, Chernukha IM. Biologicheski aktivnyye peptidy kak produkt mikrobnoy fermentatsii myasnogo sy-r'ya i gotovykh myasnykh produktov. Pishchevaya promyshlennost'. 2019;4:20-22. doi: 10.24411/0235-2486-2019-10009. In Russian
16. Strahinic I, Kojic M, Tolinacki M, Fira D, Topisirovic L. The presence of prtP proteinase gene in natural isolate Lactobacillus plantarum BGSJ3-18. Letters and Applied Microbiology. 2010;50:43-49. doi: 10.1111/j.1472-765X.2009.02748.x
17. Kojic M, Fire D, Banina A, Topisirovic L. Characterization of the cell wall-bound proteinase of Lactobacillus casei HN14. Applied and Environmental Microbiology. 1991;57:1753-1757. doi: 10.1128/AEM.57.6.1753-1757.1991
18. Holck A, Naes H. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding the cell-envelope-associated proteinase from Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NCDO 151. Microbial Genomic. 1992;38:1353-1364. doi: 10.1099/00221287-138-7-1353
19. Gilbert C, Danielle A, Blanc B, Portailer R, Germond JE, Lapierre L, Mollet B. A new cell surface proteinase - sequencing and analysis of the prtB gene from Lactobacillus del-brueckii subsp. bulgaricus. Journal of Bacteriology. 1996;178:3059-3065. doi: 10.1128/jb. 178.11.3059-3065.1996
20. Zhang WY, Chen YF, Zhao WJ, Kwok LY, Zhang HP. Gene expression of proteolytic system of Lactobacillus helveticus H9 during milk fermentation. Annals of Microbiology. 2015;65(2): 1171-1175. doi: 10.1007/s13213-014-0902-3
21. Chandramouli V, Kailasapathy K, Peiris P, Jones M. An improved method of microen-capsulation and its evaluation to protect Lactobacillus spp. in simulated gastric conditions. Journal of Microbiological Methods. 2004;56(1):27-35. doi: 10.1016/J.MIMET.2003.09.002
22. Ozer B, Kirmaci H, §enel E, Atamer M, Hayaloglu AA. Improving the viability of Bifidobacterium bifidum BB-12 and Lactobacillus acidophilus LA-5 in white-brined cheese by microencapsulation. International Dairy Journal. 2009;19(1):22-29. doi: 10.1016/j.idairyj.2008.07.001
23. Cebrián G, Condón S. Physiology of the inactivation of vegetative bacteria by thermal treatments: mode of action, influence of environmental factors and inactivation kinetics. Foods. 2017;6(12):107. doi: 10.3390/foods6120107
24. Todorov SD, Stojanovski S, Iliev I, Moncheva P, Nero LA, Ivanova IVOL. Technology and safety assessment for lactic acid bacteria isolated from traditional Bulgarian fermented meat product "lukanka". Brazilian Journal of Microbiology. 2017;48(3):576-586. doi: 10.1016/j.bjm.2017.02.005
25. Ramirez-Chavarin N, Wacher C, Carlos E, Pérez-Chabela ML. Probiotic potential of thermotolerant lactic acid bacteria strains isolated from cooked meat products. International Food Research Journal. 2013;20:991-1000.
26. Kim SJ, Cho S, Kim S, Song O, Shin I, Cha D, Park H. Effect of microencapsulation on viability and other characteristics in Lactobacillus acidophilus ATCC 43121. LWT - Food Science and Technology. 2008;41(3):493-500. doi: 10.1016/J.LWT.2007.03.025
27. Mahmoud M, Abdallah N, El-Shafei K, Tawfik NF, El-Sayed HS. Survivability of alginate-microencapsulated Lactobacillus plantarum during storage, simulated food processing and gastrointestinal conditions. Heliyon. 2020;6(3):E03541. doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e03541
Информация об авторах:
Афанасьев Дмитрий Алексеевич - аспирант Федерального научного центра пищевых
систем им. В.М. Горбатова РАН (Москва, Россия).
E-mail: dmitr. afanasj ew2010@yandex. ru
Чернуха Ирина Михайловна - д-р техн. наук, главный научный сотрудник Федерального научного центра пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН (Москва, Россия). E-mail: imcher@inbox.ru
Ганина Вера Ивановна - д-р техн. наук, ведущий научный сотрудник Проблемной научно-исследовательской лаборатории «Конструирование и внедрение продуктов и рационов персонифицированного питания» Московского государственного университета технологий и управления им. К.Г. Разумовского (ПКУ) (Москва, Россия). E-mail: vigan5428@yandex.ru
Машенцева Наталья Геннадьевна - д-р техн. наук, профессор кафедры «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» Московского государственного университета пищевых производств (Москва, Россия). E-mail: natali-mng@yandex.ru
Ковалев Леонид Иванович - д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник Федерального исследовательского центра биотехнологии, Института биохимии им. А. Н. Баха РАН (Москва, Россия). E-mail: kovalyov@inbi.ras.ru
Коврижных Анна Владиславовна - магистрант кафедры «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» Московского государственного университета пищевых производств (Москва, Россия). E-mail: anya-1998@mail.ru
Ахангаран Махбубех - аспирант кафедры «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» Московского государственного университета пищевых производств (Москва, Россия). E-mail: ahangaran@hotmail.com
Гаравири Махмуд - аспирант кафедры «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» Московского государственного университета пищевых производств (Москва, Россия). E-mail: gharaviri@hotmail.com
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Information about the authors:
Dmitry A. Afanasev, graduate student, Gorbatov Federal Center for Food Systems RAS (Moscow, Russia).
E-mail: dmitr. afanasj ew2010@yandex. ru
Irina M Chernukha, Doct. Sci. (Technology), chief researcher, Gorbatov Federal Center for Food Systems RAS (Moscow, Russia). E-mail: imcher@inbox.ru
Vera I. Ganina, Doct. Sci. (Technology), leading researcher, Razumovsky Moscow State University of Technology and Management (Moscow, Russia). E-mail: vigan5428@yandex.ru
Natalya G. Mashentseva, Doct. Sci. (Technology), associate professor at the Department of Biotechnology and technology of products of bioorganic synthesis, Moscow State University of Food Production (Moscow, Russia). E-mail: natali-mng@yandex.ru
Leonid I. Kovalev, Doct. Sci. (Biology), leading researcher, Federal Research Center for Biotechnology, Bakh Institute of Biochemistry RAS (Moscow, Russia). E-mail: kovalyov@inbi.ras.ru
Anna V. Kovrizhnykh, master, Department of Biotechnology and technology of products of bioorganic synthesis, Moscow State University of Food Production (Moscow, Russia). E-mail: anya-1998@mail.ru
Mahboobeh Ahangaran, graduate student, Department of Biotechnology and technology of products of bioorganic synthesis, Moscow State University of Food Production (Moscow, Russia). E-mail: ahangaran@hotmail.com
Mahmud Gharaviri, graduate student, Department of Biotechnology and technology of products of bioorganic synthesis, Moscow State University of Food Production (Moscow, Russia).
E-mail: gharaviri@hotmail.com
The Authors declare no conflict of interest.
Статья поступила в редакцию 21.06.2022; одобрена после рецензирования 22.12.2022;принята к публикации 29.12.2022.
The article was submitted 21.06.2022; approved after reviewing 22.12.2022; accepted for publication 29.12.2022.
