CC BY
90
УДК 574(063)
ВЛИЯНИЕ МЕТАЛЛУРГИЧЕСКОГО ШЛАМА НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РАСТЕНИЙ РЖИ ПОСЕВНОЙ (SECALE CEREALE)
© А.А. Гусев, С.Е. Синютина, А.Г. Шубина, О.В. Захарова, О.А. Акимова, Д.В. Кузнецов
Ключевые слова: металлургический шлам; антиоксидантная система; каталаза; пероксидаза; полифенолоксида-за; хлорофилл; каротиноиды.
Исследовано влияние различных концентраций металлургического шлама на состояние антиоксидантной системы растений ржи. Установлено, что растения ржи удовлетворительно переносят внесение в субстрат шлама металлургического производства в узком диапазоне концентраций (0,1 %).
Антропогенная нагрузка - попадание или внесение в почву различных веществ, соединений и их смесей, включая высокодисперсные металлургические отходы, и т. д. - может оказать как негативное, так и положительное воздействие на растения. Биоответом растительного организма, среди прочих откликов, обязательно является изменение содержания фотосинтети-ческих пигментов [1-4]. В случае если имеет место отрицательный стресс, наблюдается снижение содержания хлорофилла, приводящее к сдвигам в структуре мембран хлоропластов, и, как следствие, снижение интенсивности фотосинтеза [5, 6]. Поскольку соотношение хлорофиллы а+Ь/каротиноиды (Са+ь1Ск) обычно в норме стабильно и быстро реагирует на экстремальные факторы среды [7-10], то одним из маркеров уровня антропогенной нагрузки, в т. ч. внесение шлама в почву и его влияние на исследуемые виды, по нашему мнению, может служить пигментный состав листьев травянистых растений.
Реакция растений на стресс проявляется также в изменении активности антиоксидантной системы, включающей ряд ферментов, в т. ч. каталазу (КФ 1.11.1.6), пероксидазу (КФ 1.11.1.7) [11]. В условиях стрессовой нагрузки, в частности, при загрязнении среды тяжелыми металлами, происходит активация образования активных форм кислорода [12]. В клетках существует динамическое равновесие между образованием АФК и их ликвидацией, которое осуществляется с помощью многокомпонентной системы антиокси-дантной защиты (АОС), состоящей из низко- и высокомолекулярных компонентов [12]. Оценка активности компонентов антиоксидантной системы широко используется рядом исследователей для оценки адаптации растений к стрессу [ 13-20].
Важная роль в регуляции окислительных процессов отводится ферменту полифенолоксидазе (КФ 1.10.3.1), хотя этот фермент и не входит в состав антиоксидант-ной системы растений [21-23]. В стрессовых условиях (при облучении, механическом повреждении, изменении химического состава окружающей среды) активность фенолоксидаз возрастает, что проявляется в образовании химических барьеров, препятствующих дальнейшему распространению активных форм кислорода.
При окислительном стрессе ферменты антиокси-дантной системы могут не справляться со своими функциями. В этих условиях повышается значение низкомолекулярных антиоксидантов - витамин А, ка-ротиноиды, витамин С, фенолы, глутатион и др. [24]. Взаимодействуя со свободными радикалами, они прерывают цепную реакцию и предотвращают окисление компонентов клетки.
Пероксидаза, по-видимому, участвует в регуляции метаболизма растений и играет важную роль в их быстром приспособлении к изменяющимся условиям среды. По данным разных исследователей, повышение активности происходит параллельно с увеличением степени техногенной нагрузки на растения [12, 22, 25]. При повышенном содержании в окружающей среде загрязнителей физиолого-биохимические компоненты антиоксидантной защиты функционируют взаимосвязано, и снижение активности одного из них может компенсироваться повышением активности других [20].
Активность каталазы у большинства растений снижается на загрязненных участках произрастания. Чем выше устойчивость вида к загрязняющим веществам, тем более высокая стабильность действия этого фермента [27]. Отсутствие повышения активности катала-зы может быть следствием следствие ее ингибирования перекисью [17]. В этом случае пероксидазы становятся главными ферментами, катализирующими разложение H2O2.
В работе было исследовано влияние различных концентраций распространенного высокодисперсного отхода - металлургического шлама на состояние анти-оксидантной системы растений ржи.
Для проведения исследования использовались образцы шлама ОАО «Северсталь» отобранные из зо-лошламонакопителя № ДП ЗШН-2, к-2 в марте 2013 г. Шлам представляет собой отход аглодоменного производства. По данным проведенного рентгеновского анализа были определены четыре основные фазы, присутствующие в шламе (табл. 1).
Надо отметить, что метод рентгеновской дифракции не обнаружил присутствие соединений достаточно тяжелого металла - цинка, что указывает на то, что они находятся в высокодисперсном состоянии.
Таблица 1
Результаты количественного рентгеновского фазового анализа образца металлургического шлама
Кристаллическая фаза Объемная доля, %
Оксид железа (III) 58,0
Оксид железа (II) 13,7
Карбонат кальция 8,7
Оксид кремния 19,6
В связи с этим для анализа шламов целесообразно использовать также и элементный анализ. Наиболее рациональным с точки зрения эффективности и экс-прессности является метод рентгенофлуоресцентной спектроскопии.
Еще одним методом исследования структуры частиц шлама является метод электронной сканирующей микроскопии. Исследование микроструктуры проводилось на электронном сканирующем микроскопе высокого разрешения Merlin (Carl Zeiss, Г ермания) со спектрометрами и сканирующем электронно-ионный микроскопе Neon 40 (Carl Zeiss, Германия).
Проведенные исследования позволили выявить существенные различия в химическом составе крупных и мелких частиц шлама. В частности, при интегральном анализе большого количества частиц шлама концентрация железа достигает 62 мас. %. Очевидно, что все железо находится в окисленной форме, что указывает на хорошее совпадение с данными рентгеновской ди-фрактометрии. Содержание цинка находится на уровне 9,7 мас. %
Напротив, крупные частицы содержат мало соединений цинка, его концентрация на локальных участках снижается до 1,7 мас. %. При этом концентрация железа и кислорода остается на близком уровне.
Таким образом, использование совмещенного электронномикроскопического и элементного анализа позволило определить химический состав шлама (табл. 2).
Исследуемый образец шлама содержит ряд металлов, которые могут быть как потенциально опасными для растений, так и проявлять фитостимулирующие свойства, являясь компонентами многих витаминов и ферментов.
Экспериментальная рожь выращивалась на протяжении 14 недель в грунте, содержащем растворы шлама следующих концентраций: 0,001, 0,01, 0,1, 1 и 10 %. В качестве контрольного использовался грунт без добавления шлама. Субстратом для проращивания стала искусственно приготовленная почва, состоящая из смеси песка (69 %), каолиновой глины (20 %), нейтрального торфа (10 %) и карбоната кальция (около 1 %) (согласно ГОСТ Р ИСО 22030-2009). За 7 дней до посадки растений шлам в указанных концентрациях перемешивался с песком, после чего в смесь добавлялись остальные компоненты искусственной почвы и тщательно перемешивались в большом лабораторном миксере. Перед посевом полученный субстрат выкладывался в емкости объемом 5 л (длина - 0,5 м, ширина - 0,2 м). Всего было 18 емкостей по 30 растений в каждой. Площадь корневого питания для каждого растения составляла 0,003 м2.
В ходе проведенного исследования установлено, что активность полифенолоксидазы ржи в присутствии добавок шлама несколько снижается (рис. 1). Активность фермента незначительно зависит от концентраций добавок шлама, однако, судя по полученным данным, концентрации 0,001-0,1 % являются оптимальными. При концентрации шлама 10 %, скорее всего, можно говорить об ингибировании фермента.
Напротив, активность каталазы ржи несколько увеличивается при введении в среду шлама металлургического производства по сравнению с контрольной группой растений. Активность каталазы закономерно растет с повышением концентрации добавки. Однако, как и для полифенолоксидазы, высокая (10 %) концентрация шлама приводит к подавлению работы фермента (рис. 2).
Таблица2
Результаты элементного анализа образца металлургического шлама
Элемент Весовой % Атомный %
Al 4,54 7,79
Si 11,24 18,52
S 4,40 6,35
K 0,67 0,79
Ca 6,49 7,49
Ti 0,22 0,21
Cr 0,08 0,08
Fe 62,17 51,52
Ni 0,48 0,38
Zn 9,71 6,88
Итого 100,00 100,00
Рис. 1. Влияние шлама металлургического производства на активность полифенолоксидазы ржи. Концентрации шлама, %: 1 - 0; 2 - 0,001; 3 - 0,01; 4 - 0,1; 5 - 1; 6 - 10
Рис. 2. Влияние шлама металлургического производства на активность каталазы ржи. Концентрации шлама, %: 1 - 0; 2 -0,001; 3 - 0,01; 4 - 0,1; 5 - 1; 6 - 10
Зависимость активности пероксидазы ржи от концентрации металлургического шлама приведена на рис. 3. Активность фермента в целом выше, чем для растений кукурузы и рапса. Минимальная концентрация шлама не влияет на активность пероксидазы ржи. Рост концентрации добавки приводит к закономерному снижению активности пероксидазы.
Содержание хлорофилла в растениях ржи достигает максимума (5,5309 мг/л) при 0,01 % доли шлама в субстрате, а затем, по мере увеличения количества шлама, концентрация этого пигмента меняется от 5,3284 до 4,4708 мг/л, но остается выше, чем у контрольных растений (рис. 4). Концентрация хлорофилла Ь так же больше, чем у контрольных образцов; при 10 % содержании шлама в питательной среде она падает практически до исходной величины, наблюдаемой в отсутствии шлама. Концентрация каротиноидов при 0,001-1 % содержании шлама в культивационной среде крайне низкая, дальнейшее увеличение доли шлама в субстрате ведет к активации синтеза каротиноидов вплоть до превышения таковой над растениями контрольной группы (рис. 4). По-видимому, исследуемый шлам при содержании в питательной среде 0,001-1 % вызывает отрицательный стресс у растений ржи, подавляя в них синтез пигментов.
Подобный тип реакции растений на стресс (снижение активности пероксидазы, изменение количества пигментов и отношения суммы хлорофилла а и Ь к каротиноидам) описан в [20].
Действие токсичных элементов на растения основано на следующих процессах:
- вмешательство в функционирование ферментных систем: тяжелые металлы за счет своего химического подобия могут замещать некоторые необходимые растениям элементы в составе ферментов, нарушая их работу (так, кадмий способен замещать цинк в составе цинксодержащих ферментов;
- нарушение баланса элементов питания в растении: тяжелые металлы могут реагировать с некоторыми жизненно важными элементами (например, с фосфат-ионами), переводя их в нерастворимое состояние;
- конкуренция между ионами тяжелых металлов и необходимыми элементами за поступление в растение;
- изменение мембран, приводящее к нарушению ближнего и дальнего транспорта.
Так, двухвалентные ионы тяжелых металлов, например, свинца, в высоких концентрациях способны частично или полностью вытеснять металлы из активного центра ферментов, в результате чего теряется их активность [26, 27]. Возможно вытеснение кальция из молекул фермента пероксидазы ионами свинца, что приводит к значительному ингибированию перокси-дазной активности. Такой эффект предположительно связан с накоплением свинца в митохондриях и пластидах, где сконцентрирован большой пул фермента пероксидазы [16, 28, 29].
Таким образом, на основании анализа результатов эксперимента следует, что растения ржи удовлетворительно переносят внесения в субстрат шлама металлургического производства в узком диапазоне концентраций (0,1 %).
ЛИТЕРАТУРА
Рис. 3. Влияние шлама металлургического производства на активность пероксидазы ржи. Концентрации шлама, %: 1 -0; 2 - 0,001; 3 - 0,01; 4 - 0,1; 5 - 1; 6 - 10
С, мг/л 6 П
5 -4 -3 -2 -1 -0
1
шш
отсутствует 0,001 0,01 0,1 1 10
содержание шлама в субстрате, %
Рис. 4. Содержание хлорофилла а (1), Ь (2), каротиноидов (3) в растениях ржи
1. Федулов Ю.П. Содержание и соотношение хлорофиллов в листьях озимой пшеницы в зависимости от агротехнических приемов ее выращивания // Научный журнал КубГАУ. 2009. № 51 (7). С. 13.
2. Ерофеева Е.А., Наумова М.М. Взаимосвязь физиологоморфологических показателей листовой пластинки березы повислой с содержанием в ней тяжелых металлов // Вестник Нижегородского университета. Серия: Биология. 2010. № 1. С. 140-143.
3. Соболева О.М. Эколого-физиологическая адаптация сосны обыкновенной на урбанизированных территориях Кемеровской области: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Барнаул, 2009. 21 с.
4. Косицына А.А., Макурина О.Н., Нестеров В.Н., Розенцвет О.А. Влияние ионов меди и кадмия на пигментный комплекс водных растений семейства HYDROCHARITACEAE // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2010. Т. 12. № 1. С. 156-161.
5. Артамонов В.И. Растения и чистота природной среды. М.: Наука, 1986. 172 с.
6. Lichtenthaler N.K. Chlorophylls and carotenoids - pigments of photosynthetic biomembranes // Methods in еnzymology. V. 148 / еds. S.P. Colowick, N.O. Kaplan. San Diego: Acad. Press, 1987. P. 350382.
7. Бендер О.Г., Зотикова А.П., Велисевич С.Н. Особенности водного обмена и состояния пигментного комплекса хвои кедра сибирского (PINUS SIBIRICA DU TOUR) в горах Северо-Восточного Алтая // Вестник Томского государственного университета. Серия: Биология. 2009. № 3 (7). С. 63-72.
8. Карнаухов В.Н. Биологические функции каротиноидов. М.: Наука, 1988. 240 с.
9. Титова М.С. Содержание фотосинтетических пигментов в хвое PICEA ABIES и PICEA KORAIENSIS // Вестник Оренбургского государственного университета. 2010. № 12 (118). С. 9-12.
10. Сахнов В.В. Особенности развития сеянцев сосны обыкновенной (.Pinus sylvestris L.) и лиственницы Сукачева (Larix sukaczewii Dyl.) при использовании препарата «Гумирал» в лесных питомниках Среднего Поволжья: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Уфа, 2007.
11. Рачковская М.М., Ким Л.О. Изменение активности некоторых оксидаз как показатель адаптации растений к условиям промышленного загрязнения // Газоустойчивость растений / под ред.
В.С. Николаевского. Новосибирск: Наука, 1980. С. 117-126.
12. Bolwell G.P. Mechanisms for the Generation of Reactive Oxygen Species in Plant a Broad Perspective // Physiol. Mol. Plant Pathol.
1997. V. 51 (6). P. 347-366.
1
1
2
3
13. Половникова М.Г., Воскресенская О.Л. Активность компонентов антиоксидантной защиты и полифенолоксидазы у газонных растений в онтогенезе в условиях городской среды // Физиология растений. 2008. Т. 55. № 5. С. 777-785.
14. Малеева М.Г., Некрасова Г.Ф., Борисова Г.Г., Чукина Н.В., Ушакова О.С. Влияние тяжелых металлов на фотосинтетический аппарат и антиоксидантный статус элодеи // Физиология растений. 2012. Т. 59. № 2. С. 216.
15. Фазлиева Э.Р., Киселева И.С., Жуйкова Т.В. Антиоксидантная активность листьев MELILOTUS ALBUS и TRIFOLIUM MEDIUM из техногенно нарушенных местообитаний Среднего Урала при действии меди // Физиология растений. 2012. Т. 59. № 3. С. 369.
16. Макурина О.Н., Розина С.А. Влияние ксенобиотиков на ферментативную активность в тканях водного погруженного растения CERATOPHYLLUM DEMERSUM // Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. 2012. № 9 (100). С. 200-210.
17. Гарифзянов А.Р., Иванищев В.В. Физиологические реакции ASER PLATANOIDES L. на стресс, вызванный загрязнением среды тяжелыми металлами // Фундаментальные исследования. 2011. № 9.
С. 331 -334.
18. Ху Ю.Ф., Лиу Ж.П. Ферменты антиоксидантной защиты и физиологические характеристики двух сортов топинамбура при солевом стрессе // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 863-868.
19. Горелова С.В., Колобаева Н.А. Воздействие транспортной эмиссии на компоненты АОС кустарников санитарно-защитной полосы // Растение и стресс: Всероссийский симпозиум. 9-12 ноября 2010 г. / Учреждение Российской академии наук «Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН». М., 2010.
20. Гарифзянов А.Р. Исследование антиоксидантной системы древесных растений в условиях промышленного загрязнения: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Тула, 2011. 186 с.
21. Воскресенская О.Л. Некоторые эколого-физиологические механизмы адаптации в онтогенезе однолетних растений // Поливариантность развития организмов, популяций и сообществ / под ред. О.Л. Воскресенской. Йошкар-Ола: Изд-во МарГУ, 2006. С. 77-86.
22. Рачковская М.М., Ким Л.О. Изменение активности некоторых оксидаз как показатель адаптации растений к условиям промышленного загрязнения // Газоустойчивость растений / под ред. В.С. Николаевского. Новосибирск: Наука, 1980. С. 117-126.
23. Жукова Л.А., Воскресенская О.Л., Грошева Н.П. Морфологические и физиологические особенности онтогенеза календулы лекарст-
венной (Calendula offizinalis L.) в посевах разной плотности // Экология. 1996. Т. 2. С. 104-110.
24. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе // Успехи соврем. биологии. 1993. Т. 113. С. 456-470.
25. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука, 2002. 294 с.
26. Прохорова Н.В., Матвеев НМ., Павловский В.А. Аккумуляция тяжелых металлов дикорастущими и культурными растениями в лесостепном и степном Поволжье. Самара: Изд-во Самар. ун-та,
1998. 131 с.
27. Sch 'utzend 'ubel A., Polle A. Plant responses to abiotic stresses: Heavy metalinduced oxidative stress and protection by mycorrhization // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. № 372. P. 1351-1365.
28. Воронков Л.А., Живописцева И.В. Изучение каталитических свойств пероксидазы хлоропластов // Физиология и биохимия здорового и больного растения. М.: Изд-во МГУ, 1970. С. 305-311.
29. Plesnicar M., Bonner W.D., Storey B.T. Peroxidase associated with higher plant mitochondria // Plant Physiol. 1967. V. 42. № 3. P. 366370.
БЛАГОДАРНОСТИ: Работа выполнена при поддержке ГК № 14.512.12.0002 от 22.02.2013 г.
Поступила в редакцию 20 ноября 2013 г.
Gusev A.A., Sinyutina S.E., Shubina A.G., Zakharova O.V., Akimova O.A., Kuznetsov D.V. INFLUENCE OF METALLURGICAL SLUDGE ON BIOCHEMICAL PARAMETERS OF PLANTS OF RYE (Secale cereale)
The effect of different concentrations of metallurgical sludge on the antioxidant system of rye plants was investigated. It was stated that rye plants satisfactorily sustain the application of metallurgical sludge in the substrate in a narrow range of concentrations (0.1 %).
Key words: metallurgical sludge; antioxidant system; cata-lase; peroxidase; polyphenol oxidase; chlorophyll; carotenoids.
Гусев Александр Анатольевич, Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, г. Тамбов, Российская Федерация, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, доцент кафедры физиологии, зав. лабораторией медицинской экологии и нанотоксикологии НОЦ «Нанотехнологии и наноматериалы», e-mail: nanosecurity@mail.ru Gusev Aleksander Anatolyevich, Tambov State University named after G.R. Derzhavin, Tambov, Russian Federation, Candidate of Agriculture, Associate Professor, Associate Professor of Physiology Department, Head of Medical Ecology and Nano-toxicology Laboratory SEC “Nanotechnologies and Nanomaterials”, e-mail: nanosecurity@mail.ru
Синютина Светлана Евгеньевна, Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, г. Тамбов, Российская Федерация, кандидат химических наук, доцент, доцент кафедры биохимии и фармакологии, e-mail: sinjutina_s_e@mail.ru Sinyutina Svetlana Evgenyevna, Tambov State University named after G.R. Derzhavin, Tambov, Russian Federation, Candidate of Chemistry, Associate Professor, Associate Professor of Biochemistry and Pharmacology Department, e-mail: sinjutina_s_e@mail.ru
Шубина Анна Геннадиевна, Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, г. Тамбов, Российская Федерация, кандидат химических наук, доцент кафедры биохимии и фармакологии, e-mail: shubinaann@rambler.ru
Shubina Anna Gennadyevna, Tambov State University named after G.R. Derzhavin, Tambov, Russian Federation, Candidate of Chemistry, Associate Professor of Biochemistry and Pharmacology Department, e-mail: shubinaann@rambler.ru
Захарова Ольга Владимировна, Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, г. Тамбов, Российская Федерация, студентка института естествознания, e-mail: olgazakharova1@mail.ru
Zakharova Olga Vladimirovna, Tambov State University named after G.R. Derzhavin, Tambov, Russian Federation, Student of Natural Science Institute, e-mail: olgazakharova1@mail.ru
Акимова Ольга Александровна, Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, г. Тамбов, Российская Федерация, г. Тамбов, Российская Федерация, аспирант, кафедра биологии, e-mail: yalo5304@yandex.ru
Akimova Olga Aleksandrovna, Tambov State University named after G.R. Derzhavin, Tambov, Russian Federation, Post-graduate Student, Biology Department, e-mail: yalo5304@yandex.ru
Кузнецов Денис Валерьевич, Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС», г. Москва, Российская Федерация, кандидат технических наук, доцент, зав. кафедрой функциональных наносистем и высокотемпературных материалов, e-mail: dk@misis.ru
Kuznetsov Denis Valeryevich, National Research Technological University “MtSIS”, Moscow, Russian Federation, Candidate of Technics, Associate Professor, Head Functional Nanosystems and High-temperature Materials Department, e-mail: dk@misis.ru
