CC BY
10МИКРОЭКОЛОГИЯ И ТЕРАПИЯ
© О.В.БУХАРИН, А.В.СГИБНЕВ, 2013 О.В.Бухарин, А.В.Сгибнев
ВЛИЯНИЕ МЕТАБОЛИТОВ Н2О2-ПРОДУЦИРУЮЩИХ ЛАКТОБАЦИЛЛ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИЗОЦИМА
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург
Цель. Изучение влияния метаболитов Н2О2-продуцирующих лактобацилл на ферментативную и бактерицидную активность лизоцима. Материалы и методы. Использованы 9 Н2О2-продуцирующих вагинальных лактобацилл, Micrococcus luteus NCTC 2665, Escherichia coli ГИСК № 240367, Lactobacillus acidophilus ИКВС № 37. Способность лак-тобацилл продуцировать Н2О2 оценивали по окислению тетраметилбензидина перокси-дазой. Лизоцим модифицировали путем смешивания с равными объемами метаболитов лактобацилл, в контроле использовали метаболиты Н2О2-продуцирующих вагинальных лактобацилл, предварительно обработанные каталазой. Ферментативную активность лизоцима определяли по скорости лизиса M.luteus, бактерицидную — по выживаемости E.coli на среде Эндо и L. acidophilus — на среде MRS. Результаты. Выявлено снижение ферментативной активности лизоцима вследствие его контакта с метаболитами Н2О2-продуцирующих лактобацилл. Этот эффект сопровождался ростом бактерицидной активности лизоцима в отношении E. coli и уменьшением в отношении L. acidophilus. Степень изменения ферментативной и бактерицидной активности лизоцима метаболитами лактобацилл зависела от концентрации в них пероксида водорода. Заключение. Модификация лизоцима метаболитами Н2О2-продуцирующих лактобацилл, приводящая к оппозитному изменению его активности в отношении автохтонных и аллохтонных бактерий, является одним из механизмов формирования стабильного микробного биоценоза в организме человека.
Журн. микробиол., 2013, № 4, С. 60—64
Ключевые слова: активные формы кислорода, лактобациллы, лизоцим, пероксид водорода, Esherichia coli
O.V.Bukharin, A.V.Sgibnev
EFFECT OF METABOLITES OF H2O2-PRODUCING LACTOBACILLI ON FUNCTIONAL ACTIVITY OF LYSOZYME
Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. Study the effect of metabolites of H2O2-producing lactobacilli on enzymatic and bactericidal activity of lysozyme. Materials and methods. 9 H2O2-producing vaginal lactobacilli, Micrococcus luteus NCTC 2665, Escherichia coli State Institute of Standardization and Control № 240367, Lactobacillus acidophilus Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis № 37 were used. Ability of lactobacilli to produce H2O2 was evaluated by oxidation of tetramethylbenzidine by peroxidase. Lysozyme was modified by mixing with equal volumes of lactobacilli metabolites, metabolites of H2O2-producing vaginal lactobacilli previously treated with catalase were used in control. Lysozyme enzymatic activity was determined by speed ofM. luteus lysis, bactericidal — by survivability of E. coli in Endo medium and L. acidophilus — in MRS medium. Results. Decrease of enzymatic activity of lysozyme due to its contact with H2O2-producing lactobacilli metabolites was detected. This effect is accompanied by growth of bactericidal activity of lysozyme against E. coli and decrease against L. acidophilus. The degree of changes of enzymatic and bactericidal
activity of lysozyme by lactobacilli metabolites depended on concentration of hydrogen peroxide in them. Conclusion. Modification of lysozyme by H2O2-producing lactobacilli metabolites resulting in opposite changes of its activity against autochthonous and allchthonous bacteria is one of the mechanisms of formation of stable microbial biocenosis in human organism.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 4, P. 60-64
Key words: active oxygen forms, lactobacilli, lysozyme, hydrogen peroxide, Esherichia coli ВВЕДЕНИЕ
Известно, что устойчивость микробного симбиоза биотопов человека определяется способностью организма и доминантных микросимбионтов продуцировать вещества с регуляторными и антимикробными свойствами, что было продемонстрировано в условиях женского репродуктивного тракта [3]. Оказалось, что в защите слизистых оболочек вагинального биотопа от заселения патогенными микроорганизмами значительно участие катионных антимикробных пептидов, содержащихся в вагинальном секрете в большом разнообразии и высоких концентрациях и потенцирующих бактерицидный эффект друг друга [5].
Другим фактором защиты вагинального биотопа являются доминирующие в нем бактерии рода Lactobacillus, способные продуцировать широкий спектр антимикробных веществ, регулирующих численность бактериальных популяций в этом биотопе [2]. Предполагаемой основой антимикробной активности лактоба-цилл является продукция Н2О2 [7], но, в то же время, считают, что антагонистическая активность лактобацилл — результат сложения эффектов всего спектра продуцируемых ими антимикробных веществ [11].
Таким образом, стабильность вагинального симбиоза, проявляющаяся в относительном постоянстве численности и видового состава бактерий, предполагает наличие механизмов защиты биотопа, связанных со взаимодействием факторов местного иммунитета и антимикробных метаболитов представителей нормофлоры [12].
В связи с этим, целью нашего исследования явилось изучение влияния метаболитов Н2О2-продуцирующих лактобацилл на функциональную активность лизоцима как фактора врожденного иммунитета.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы 9 клинических изолятов лактобацилл, выделенных из репродуктивного тракта здоровых женщин и идентифицированных до рода по совокупности фенотипических признаков согласно рекомендациям [10], Micrococcus luteus NCTC 2665, лактозопозитивная, негемолитическая Escherichia coli ГИСК № 240367, Lactobacillus acidophilus ИКВС № 37.
Для получения Н2О2-содержащих внеклеточных метаболитов из биомассы лактобацилл, выращенной в среде MRS и отмытой в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ, рН=6,2), готовили взвесь (107 КОЕ/мл) в стерильной среде, содержащей: КН2РО4 — 2,5 г/л, MnSO4 х 4H2O — 0,05 г/л, MgSO4 х 7H2O — 0,2 г/л, глюкозы — 20 г/л. Взвесь инкубировали 2 часа при 37°С при постоянном перемешивании, после чего клетки бактерий осаждали центрифугированием (3000 g, 15 минут), а супернатант стерилизовали фильтрованием через мембранные фильтры (0,22 ^м, Millipore).
Для оценки способности лактобацилл продуцировать Н2О2 по 50 мкл их су-пернатантов вносили в лунки 96-луночного полистиролового планшета, затем добавляли 50 мкл 5мМ раствора тетраметилбензидина и пероксидазы (0,5 U/мл, Е.С. 1.11.1.7, Sigma-Aldrich) в цитратнофосфатном буфере (рН=4,5). Калибро-
вочные пробы, содержащие раствор Н2О2 в концентрации 0 — 2 мМ, были приготовлены на основе вышеописанной среды. Реакцию останавливали через 5 минут инкубации при комнатной температуре добавлением 50 мкл 5% раствора серной кислоты и замеряли светопоглощение (À=450 нМ).
Для оценки влияния метаболитов лактобацилл на ферментативную и бактерицидную активности яичного лизоцима (Е.С. 3.2.1.17, Sigma-Aldrich, М=14,7 кДа) смешивали их с равным объемом раствора лизоцима разных концентраций в 0,1 М ФСБ (рН=6,2), в контроле использовали метаболиты лактобацилл, предварительно обработанные каталазой (8 U/мл) (Е.С. 1.11.1.6, Sigma-Aldrich) для удаления из них Н2О2.
Ферментативную активность лизоцима определяли по скорости лизиса M. luteus [1]: для этого в 96-луночной планшете к суспензии клеток в 0,1 М ФСБ (рН=6,2) объемом 180 мкл добавляли 20 мкл раствора лизоцима и определяли значение оптической плотности (À=540 нм) в течение 3 минут с интервалом 15 секунд при 25°С и постоянном встряхивании. Активность лизоцима выражали в у.е./мг белка в минуту, за единицу активности фермента принимали уменьшение оптической плотности взвеси M.luteus на 0,01.
Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) натив-ного и модифицированного метаболитами лактобацилл лизоцима к взвеси бактерий в 0,1 М ФСБ (рН=6,2), содержащей ~105 КОЕ/мл, добавляли равный объем раствора лизоцима в различных концентрациях, инкубировали в течение часа при 37°C и высевали E.coli на среду Эндо, L. acidophilus — на среду MRS. Результаты высева учитывали через сутки культивирования в термостате в микро-аэрофильных условиях. Значения МБК лизоцима выражали в мкг/мл.
Концентрацию белка в препаратах лизоцима до и после контакта с метаболитами лактобацилл определяли по Лоури [8].
При статистической обработке полученных результатов проверка нормальности распределения данных проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, для оценки достоверности различий между опытными и контрольными группами использовался критерий Манна-Уитни, исследование взаимосвязи между признаками осуществляли при помощи парного коэффициента линейной корреляции Спирмена (r) [4]. Таблицы содержат данные в виде средних арифметических (М) и стандартных ошибок средних (m). Во всех процедурах статистического анализа уровень значимости p принимался равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате проведенных исследований было установлено, что ферментативная активность лизоцима снижалась после его контакта с метаболитами лактоба-цилл (табл. 1). Этот эффект определялся наличием в метаболитах лактобацилл Н2О2, так как после обработки супернатантов Н2О2-продуцирующих лактобацилл каталазой значения активности фермента не отличались от контрольных (табл. 1). Следует отметить, что выраженность подавления ферментативной активности лизоцима метаболитами лактобацилл находилась в прямой зависимости от содержания в них Н2О2 (r=0,89, р<0,01).
Снижение ферментативной активности лизоцима метаболитами лактобацилл сопровождалось уменьшением его бактерицидности в отношении L. acidophilus (табл. 2), что проявлялось в 2 — 3-кратном увеличении МБК. Однако в отношении E. coli бактерицидная активность лизоцима возрастала после контакта фермента с метаболитами Н2О2-продуцирующих лактобацилл, что выражалось в снижении МБК лизоцима (табл. 2). Метаболиты лактобацилл, обработанные каталазой для удаления Н2О2, не изменяли бактерицидность лизоцима. Степень бактерицид-ности лизоцима, модифицированного метаболитами лактобацилл, зависела от
Таблица 1. Влияние внеклеточных метаболитов лактобацилл на ферментативную активность лизоцима
Количество Н2О2 в метаболитах лактобацилл, мМ Активность лизоцима, у.е./мг белкахмин р
Без каталазы С каталазой
0 27+1,98 26,8+1,65 0,92
0,18+0,015 24,2+1,57 26,6+1,48 0,15
0,43+0,034 18,9+1,26 27,2+1,92 <0,001
0,57+0,043 14,14+1,24 26,5+1,49 <0,001
0,84+0,048 11,1+0,88 26,5+1,37 <0,001
1,12+0,046 10,4+0,83 26,3+1,86 <0,001
1,27+0,072 10,0+0,81 27,5+1,74 <0,001
1,35+0,101 10,1+0,81 26,7+1,42 <0,001
1,78+0,086 8,9+0,74 26,1+1,58 <0,001
1,90+0,124 8,5+0,71 26,7+1,62 <0,001
Таблица 2. Влияние внеклеточных метаболитов лактобацилл на МБК лизоцима по отношению к E. coli и L. acidophilus
Количество Н2О2 в метаболитах лактобацилл, мМ МБК лизоцима, мг/мл
E.coli L.acidophilus
Без каталазы С каталазой р Без каталазы С каталазой р
0 107,0+21,6 107,0+19,6 1 7,8+1,13 7,1+0,97 0,51
0,18+0,015 104,0+18,5 98,0+14,8 0,35 7,5+1,08 8,2+1,12 0,5
0,43+0,034 94,5+22,3 107,4+17,6 0,16 7,2+1,05 7,0+1,26 0,83
0,57+0,043 86,8+10,8 105,1+16,5 0,02 11,7+1,79 8,0+1,10 0,03
0,84+0,048 78,3+18,7 106,0+15,5 0 12,2+1,77 8,1+1,10 0,02
1,12+0,046 72,0+13,4 107,0+14,8 <0,001 16,9+2,45 8,1+1,22 0
1,27+0,072 69,2+14,9 102,1+14,2 <0,001 22,1+2,95 8,5+1,16 <0,001
1,35+0,101 61,2+11,6 102,8+13,6 <0,001 23,7+3,40 8,7+1,19 <0,001
1,78+0,086 57,7+6,3 96,0+13,8 <0,001 24,6+3,22 7,3+0,99 <0,001
1,90+0,124 56,9+7,1 101,6+20,4 <0,001 25,2+2,68 8,7+1,35 <0,001
количества продуцируемого этими бактериями Н2О2 (г=0,93, р<0,01 в случае с E. coli и г=-0,96, р<0,01 для L. acidophilus).
ОБСУЖДЕНИЕ
С учетом имеющихся данных о способности активных форм кислорода изменять вторичную и третичную структуры протеинов [6] не исключено, что окисление лизоцима пероксидом, содержащимся в метаболитах лактобацилл, определяет снижение ферментативной активности и, как следствие, увеличение МБК в отношении грамположительной L. acidophilus. Ранее было показано, что ферментативная активность лизоцима не является необходимым условием для проявления им бактерицидных свойств в отношении грамотрицательных бактерий [9], поэтому выявленное нами уменьшение МБК лизоцима в отношении чужеродной
для вагинального биотопа E. coli можно объяснить ростом гидрофобности белка в результате окислительного повреждения [6].
Выявленная в работе модификация лизоцима метаболитами Н2О2-про-дуцирующих лактобацилл, проявляющаяся в увеличении его бактерицидности в отношении грамотрицательных и уменьшении в отношении грамположительных бактерий, вероятно, является механизмом, регулирующим видовой состав нор-мофлоры вагинального биотопа с преобладанием грамположительных бактерий [2].
Таким образом, выявленное влияние метаболитов Н2О2-продуцирующих лактобацилл на функциональную активность лизоцима можно рассматривать в качестве механизма поддержания стабильности микробных биоценозов, основанного на синергизме эффектов факторов естественной резистентности хозяина и активных форм кислорода, продуцируемых нормофлорой.
Работа выполнена при поддержке грантов программы инициативных фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-У-4-1023 и программы Президиума РАН№5 «Фундаментальные науки — медицине», проект № 12-П-4-1015.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М., 1999.
2. Бухарин О.В., Валышев А.В., Гильмутдинова Ф.Г. и др. Экология микроорганизмов человека. Екатеринбург, УрО РАН, 2006.
3. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Немцева Н.В., Черкасов С.В. Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург, УрО РАН, 2007.
4. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1998.
5. Cole A.M. Innate host defense of human vaginal and cervical mucosae. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006, 306: 199-230.
6. Davies K.J., Delsignore M.E. Protein damage and degradation by oxygen radicals. III. Modification of secondary and tertiary structure. J. Biol. Chem. 1987, 262: 9908-9913.
7. Klebanoff S.J., Hillier S.L., Eschenbach D.A., Waltersdorph A.M. Control of the microbial flora of the vagina by H2O2-generating lactobacilli. J. Infect. Dis. 1991, 164: 94-100.
8. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951, 193 (1): 265-275.
9. Nash J.A., Ballard T.N., Weaver T.E., Akinbi H.T. The peptidoglycan-degrading property of lysozyme is not required for bactericidal activity in vivo. J. Immunol. 2006, 177 (1): 519-526.
10. Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Hoh J.G. (ed.). Bergey's manual systematic bacteriology. Williams and Wilkins, Baltimore, 1986.
11. Strus M., Brzychczy-Wloch M., Gosiewski T. et al. The in vitro effect of hydrogen peroxide on vaginal microbial communities. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2006, 48 (1): 56-63.
12. Wilson B. A., Thomas S. M., Ho M. The human vaginal microbiome. Metagenomics of the human body. Nelson K. E. (ed.). New York, Springer, 2011.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Сгибнев А.В.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т.(3532)77-54-17
