CC BY
7doi: 10.17116/terarkh2015871072-79 © Коллектив авторов, 2015
Влияние местного применения коллагена на активность репаративных процессов в мягких тканях нижних конечностей у больных с синдромом диабетической стопы
А.Ю. ТОКМАКОВА, Е.Л. ЗАЙЦЕВА, Л.П. ДОРОНИНА, Р.В. МОЛЧКОВ, И.А. ВОРОНКОВА
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва, Россия
Impact of the local application of collagen on the activity of reparative processes in the lower extremity soft tissue of patients with diabetic foot syndrome
A.Yu. TOKMAKOVA, E.L. ZAYTSEVA, L.P. DORONINA, R.V. MOLCHKOV, I.A. VORONKOVA Endocrinology Research Centre, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russia
Резюме
Цель исследования. Оценить интенсивность репаративных процессов в мягких тканях нижних конечностей (НК) у пациентов с синдромом диабетической стопы (ДС) на фоне местного применения содержащих коллаген повязок (СКП) по сравнению со стандартной консервативной терапией.
Материалы и методы. Проанализированы клинические (размеры, оксигенация тканей), гистологические и иммуногисто-химические маркеры репаративных процессов в мягких тканях НК у пациентов с сахарным диабетом на фоне местного применения раневых покрытий на основе коллагена по сравнению со стандартным лечением. Обследованы 42 пациента с нейропатической и нейроишемической (после реваскуляризации) формами синдрома ДС после стандартной хирургической обработки ран. В периоперационном периоде 21 пациент получал местное лечение с применением СКП, 21 — стандартное лечение.
Результаты. На фоне применения СКП у пациентов удалось достигнуть уменьшения площади и глубины раневых дефектов на 26,4±17,2 и 30,4±25,6% (p=0,002) соответственно по сравнению с исходными данными. В группе контроля аналогичные показатели составляли 17,0±19,4 и 16,6±21,6% (p=0,002). Отмечено достоверное усиление локальной микрогемодинамики по данным чрескожной оксиметрии в группе, получавшей местное лечение коллагеном (p<0,05). По данным гистологического исследования тканей раневых дефектов через 10 дней лечения в 1-й группе отмечались уменьшение отека на 80% (p<0,05), исчезновение воспалительного инфильтрата на 90% (p<0,05) и формирование зрелой грануляционной ткани (p<0,05). По данным иммуногистохимического исследования выявлено более выраженное увеличение количества макрофагов в дерме (p<0,05). На фоне применения СКП зафиксирована тенденция к более выраженному снижению уровня матриксной металлопротеиназы-9 по сравнению с таковым в контрольной группе.
Заключение. Полученные данные свидетельствуют о повышении активности репаративных процессов в мягких тканях НК у больных сахарным диабетом на фоне местной терапии коллагеном по сравнению со стандартным лечением. Это выражается в более быстром сокращении как площади, так и глубины ран, усилении локальной перфузии тканей, уменьшении воспаления и более быстром переходе раны из фазы пролиферации в фазу эпителизации, что подтверждается результатами гистологического и иммуногистохимического исследований.
Ключевые слова: сахарный диабет, хронические раны, местное лечение, коллаген, репарация, иммуногистохимические маркеры, гистология.
Aim. To estimate of the rate of reparative processes in the lower extremity (LE) soft tissues of patients with diabetic foot (DF) syndrome in the local application of collagen-containing dressings (CCD) versus standard medical therapy.
Subjects and methods. The clinical (sizes, tissue oxygenation), histological, and immunohistochemical markers of reparative processes in LE soft tissues were analyzed in patients with diabetes mellitus during the local application of collagen-containing wound dressings versus standard treatment. Forty-two patients with postrevascularization neuropathic and neuroischemic DF syndrome were examined after standard surgical wound treatment. In the perioperative period, 21 patients received local treatment using CCD and 21 patients had standard treatment.
Results. In the patients using CCD, the area and depth of wound defects could be decreased by 26.4±17.2 and 30.4±25.6%, respectively (p=0.002 vs baseline). In the control group, those were 17.0±19.4 and 16.6±21.6%, respectively (p=0.002). Percutaneous oximetry assessment indicated significantly higher local microhemodynamics in the local collagen treatment group (p<0.05). According to the data of histological examination of wound defect tissues, after 10-day treatment, Group 1 showed a 80% reduction in edema (p<0.05), a 90% disappearance of inflammatory infiltrates (p<0.05), and formation of mature granulation tissue (p<0.05). Immunohistochemical examination revealed a more pronounced rise in the count of macrophages in the derma (p<0.05). When CCD was applied, the level of matrix metalloproteinase tended to more markedly decrease as compared to that in the control group.
Conclusion. The findings suggest that the activity of reparative processes in LE soft tissues is enhanced in diabetic patients receiving local collagen therapy versus those having standard treatment. This manifests itself as a decrease in both the area and depth of wounds, enhancement of local tissue perfusion, a reduction of inflammation and a rapider wound transfer from proliferation to the epithelialization phase, as supported by histological and immunohistochemical findings.
Key words: diabetes mellitus, chronic wounds, local treatment, collagen, repair, immunohistochemical markers, histology.
Репарация тканей при местном лечении у лиц с СД
ВКМ — внеклеточный матрикс
ДС — диабетическая стопа
ИГХИ — иммуногистохимические исследования
ММП — матриксные металлопротеиназы
НК — нижние конечности
СД — сахарный диабет
СД-2 — СД 2-го типа
СКП — содержащие коллаген повязки
TIMP-1 — тканевый ингибитор металлопротеазы-1
Лечение длительно незаживающих раневых дефектов является серьезной медицинской проблемой. По данным литературы, распространенность в общей популяции хронических ран (трофических язв) различной природы составляет от 1 до 4% [1]. Значительный вклад в эту проблему вносят поражения мягких тканей нижних конечностей (НК) на фоне сахарного диабета (СД), в первую очередь синдром диабетической стопы (ДС), который регистрируется у 10—12% больных СД [2]. Данное осложнение служит причиной более 1,2 млн ампутаций в год [3]. Все перечисленное определяет актуальность разработки новых методов стимулирования репаративной активности у лиц с нарушенным углеводным обменом.
Большинство закономерностей течения раневого процесса установлено в ходе исследований острых травматических или хирургических ран. Травма служит пусковым механизмом процесса заживления, включающего 4 основные стадии [4]: коагуляция, воспаление, клеточная пролиферация и восстановление матрикса, эпителизация и ремоделирование рубцовой ткани. Эти стадии в отдельности и весь процесс в целом при остром повреждении могут длиться от 10 дней до нескольких месяцев.
Хронические или незаживающие раны (трофические язвы) характеризуются дефектным ремоделированием внеклеточного матрикса (ВКМ), нарушением реэпители-зации и длительной воспалительной фазой. Эпидермис не может мигрировать в раневую зону, развивается гиперпролиферация на краях дефекта, которая мешает нормальной клеточной миграции по раневому ложу. Возможная причина этого — ингибирование апоптоза среди популяций фибробластов и кератиноцитов. Язвы стоп при СД считаются «замершими» на фазе пролиферации [5]. В подобных случаях происходит чрезмерная экспрессия фибронектина и тромбоспондина, что приводит к клеточной дисфункции и дисрегуляции. Кроме того, установлено, что процесс тормозят протеиноподобные молекулы, поступающие из кровеносного русла [4].
Исследования продемонстрировали и такое различие между острой и хронической раной, как уровень воспалительных цитокинов и протеаз [6]. Как только хроническая рана начинает заживать, концентрация этих веществ снижается. Протеазы могут разрушать факторы роста и цито-кины, необходимые для заживления [7]. Матриксные ме-таллопротеиназы (ММП) относятся к семейству зависи-
Сведения об авторах:
Зайцева Екатерина Леонидовна — клин. асп. отд-ния диабетической стопы
Доронина Людмила Петровна — к.м.н., врач-хирург отд-ния диабетической стопы
Молчков Роман Вахтангович — врач лаб. гистологии и иммуноги-стохимии с группой биобанкинга
Воронкова Ия Александровна — к.м.н., врач лаб. гистологии и им-муногистохимии с группой биобанкинга
мых от цинка эндопептидаз, которые обеспечивают деградацию белковых компонентов межклеточного матрик-са и базальных мембран. На основании данных о первичной структуре, субстратной специфичности и клеточной локализации эти ферменты делят на 4 основных подсемейства: коллагеназы, желатиназы, стромелизины, мем-браносвязанные ММП. К подсемейству желатиназ относят желатиназу А (ММП-2) и желатиназу В (ММП-9). Они способны расщеплять коллаген IV и V типов, эластин, входящий в состав базальных мембран, и денатурированный коллаген, что дает ММП-2 и ММП-9 способность участвовать в деградации фибриллярных коллагенов совместно с коллагеназами [8]. Желатиназы также способны гидролизировать коллагены других типов и ряд белков соединительнотканного матрикса [9].
Известно, что на первой стадии раневого процесса (воспаления) основными клетками, участвующими в репарации, являются макрофаги, которые активно продуцируют факторы роста [10]. Последние способствуют переходу раны в следующую стадию (пролиферации) за счет организации ВКМ и коллагеновой сети. На этом этапе происходят снижение уровня макрофагов и миграция ке-ратиноцитов в раневое ложе, взаимодействие между раневыми протеолитическими ферментами — ММП, интегри-нами, цитокинами, в результате которого происходит продукция ВКМ [11, 12].
Уровень ММП существенно влияет на заживление раневых дефектов за счет замедления перестройки ВКМ и формирования коллагена. Доказано, что высокий уровень ММП-9 в раневом экссудате является маркером воспаления и нарушенного заживления ран при сахарном диабете [13, 14].
Установлено, что отношение ММП-9 к тканевому ингибитору металлопротеазы-1 (Т1МР-1) в экссудате снижалось в ходе эффективного лечения раневых дефектов у пациентов с СД 2-го типа (СД-2) в отличие от группы лиц с плохо заживающими язвенными дефектами и нормальным углеводным обменом, у которых этот показатель остается повышенным [15].
Имеются данные о влиянии некоторых фармакологических препаратов на уровень ММП. N. Тгепяоуе и соавт. [16] продемонстрировали снижение уровня ММП на 90% при использовании тканевого ингибитора, а также значительное снижение исходно повышенного уровня ММП при заживлении хронической раны. Теми же исследователями доказано, что применение факторов роста в лечении пациентов с варикозной болезнью ведет к увеличению содержания тканевых ингибиторов ММП.
Проблема местного лечения раневых дефектов у больных с синдромом ДС широко обсуждается различны-
Контактная информация:
Токмакова Алла Юрьевна — д.м.н., г.н.с. отд-ния диабетической стопы; e-mail: aHa-tokmakova@yandex.ru
Характеристика групп пациентов, включенных в исследование
Показатель 1-я группа («=21) 2-я группа («=21) Р
Возраст, годы 55 (50; 66) 60 (57; 72) 0,16
М/Ж 14/7 14/7 1,0
Длительность течения СД, годы 15 (13; 16) 12 (9; 16) 0,19
Тип СД (1-Й/2-Й) 5/16 1/20 0,18
HbAlc, % 8,3 (7,8; 9,5) 8,8 (7,6; 9,7) 0,63
Лейкоциты, -109/л 6,89 (5,80; 8,55) 8,23 (7,00; 10,74) 0,10
Гемоглобин, г/л 124 (116; 134) 120 (110; 126) 0,13
СОЭ, мм/ч 53 (40; 67) 71 (37; 87) 0,10
Белок общий, г/л 73 (70; 75) 69,6 (61,5; 74,5) 0,09
СКФ (MDRD), мл/мин/1,73 м2 84 (55; 98) 94 (75; 106) 0,17
Форма синдрома ДС:
неЙропатическая нейроишемическая 13 8 6 15 0,06
Стадия Wagner 2 (2; 3) 3 (2; 3) 0,29
Площадь раны до лечения, см2 18,6 (15,3; 22,8) 23,5 (12,3; 55,3) 0,22
Глубина раны до лечения, см 2,8 (2,2; 3,2) 3,2 (2,4; 5,2) 0,19
ТсрО2 до лечения, мм рт.ст. 48 (45; 53) 39 (32; 47) 0,19
Примечание. СОЭ — скорость оседания эритроцитов; СКФ — скорость клубочковой фильтрации; ТсрО2 кислорода в поверхностных мягких тканях.
чрескожное напряжение
ми специалистами, работающими в этой области. Ежегодно появляются новые средства закрытия ран, разработчики которых предлагают препараты, воздействующие на различные патогенетические звенья раневого процесса. Препараты на основе коллагена — группа современных средств местного лечения трофических язв, в том числе у больных СД. Коллаген является основным структурным белком в тканях животных и человека. На его долю приходится почти 25% всех белковых структур организма, он содержится в коже, костях, связках, мышцах и сухожилиях [17, 18]. При производстве раневых покрытий наиболее часто используется коллаген типа I, выделенный из кожи или сухожилий животных. Он обеспечивает гемостаз, обладает низкой провоспалительной и антигенной активностью, позволяет формироваться новому коллагену, тем самым вызывая сокращение размеров раны, снижает активность ММП и способствует заживлению, уменьшает воспаление, стимулирует выработку факторов роста и пролиферацию клеток в области раны.
В исследованиях in vitro и клинических испытаниях доказано, что на фоне применения содержащих коллаген повязок (СКП) снижается уровень провоспалительных цитокинов и протеаз [19—25]. Этот вид раневых покрытий способен связывать свободные радикалы, конечные продукты воспаления, эндотоксины и избыточные ионы железа и цинка, что косвенно обеспечивает уменьшение воспалительного процесса [26].
В различных исследованиях доказано положительное влияние коллагена на заживление хронических ран у пациентов с синдромом ДС. Так, в исследовании А. Veves и соавт. [27] продемонстрировано полное закрытие раневых дефектов в течение 6 мес на фоне местного применения повязки Промогран. В исследовании R. Lobmann и соавт. [28] отмечено сокращение размеров раневых дефектов НК на 16% по сравнению с группой контроля, в которой данный показатель составил 1,65% за 8 дней у лиц с СД, а также снижение уровня экспрессии ММП-9/Т1МР-2 по данным лабораторных исследований крови.
Несмотря на достаточное количество данных литературы, свидетельствующих об эффективности местного применения СКП при лечении хронических ран у больных СД, однозначной оценки молекулярных механизмов действия данного средства местного лечения пока нет.
Цель данной работы: оценить интенсивность репара-тивных процессов в мягких тканях НК у пациентов с синдромом ДС на фоне местного применения СКП по сравнению со стандартной консервативной терапией.
Материалы и методы
В исследование включили 42 пациента с нейропатической и нейроишемической (после реваскуляризации) формами синдрома ДС, которым проведена хирургическая обработка раневого дефекта, после чего в течение 9±2 дня у 21 больного (1-я группа) проводилось местное лечение СКП Промогран (Systagenix, Великобритания). У 21 больного из контрольной группы проводилась стандартная терапия атравматичными повязками и жидкими антисептиками.
При каждой смене повязки оценивали состояние пациента, диаметр и глубину раневого дефекта, наличие и качество грануляций, а также чрескожное напряжение кислорода до начала и после окончания местного лечения.
До и после местного лечения выполняли биопсию тканей раневого ложа с последующим гистологическим и иммуногистохими-ческим исследованиями (ИГХИ). Пациенты обеих групп сопоставимы по возрасту, уровню контроля углеводного обмена, выраженности микрососудистых осложнений, состоянию артериального кровотока НК, площади и глубине раневых дефектов (см. таблицу).
Площадь раны определяли методом очерчивания ее контуров через прозрачную масштабную пленку с последующим подсчетом площади внутри контура по специальным формулам (Opsite Flexgrid, Smith & Nephew, Великобритания).
Чрескожная оксиметрия выполнена на аппарате Radiometer (Дания). Датчики накладывали на расстоянии 0,5—1 см от краев раны.
Морфологический анализ биопсийного материала включал гистологический метод и ИГХИ до и после лечения. Материал фиксировали в 10% растворе формалина, затем заливали в парафин по стандартной методике. Серийные срезы толщиной 3—5 мкм депарафинировали по стандартной схеме и окрашивали гематоксилином и эозином.
Рис. 1. Разница площади (а) и глубины (б) раневых дефектов на фоне лечения у больных с ДС.
Гистологические критерии воспаления, регенерации и состояния грануляционной ткани оценены количественным методом (по балльной системе) согласно общепринятым принципам. Фазы раневого процесса оценены по классификации М.И. Кузина (1990 г.).
ИГХИ выполнили на иммуностейнере Leica BOND-MAX. Использовали антитела фирмы «Dako» в стандартных разведениях с положительным контролем. Применяли антитела к TIMP-1, ММП-9, маркеру макрофагов CD68.
Оценку экспрессии цитоплазматических маркеров (TIMP-1, ММП-9, CD68) проводили полуколичественным методом: 1«+» окрашивание единичных клеток (менее 30% клеток), 2«+» — 30— 60% клеток, 3«+» — 60—90% , 4 «+» — более 90% клеток.
Исследование проведено как сравнительное в параллельных группах. Протокол исследования одобрен на заседании этического комитета ФГБУ ЭНЦ от 28 ноября 2012 г. (протокол №18).
Статистическая обработка полученных данных выполнена с использованием пакета прикладных программ Statistica («StatSoft Inc.», США, версия 6.0). Для анализа вида распределений применяли критерии Шапиро—Уилка и Лиллиефорса, дисперсии распределений признаков оценивали с помощью критерия F в процедуре дисперсионного анализа ANOVA. Учитывая небольшие объемы выборок и распределения, отличающиеся от нор-
мального, использовали непараметрические методы анализа данных. Сравнение независимых групп по количественным признакам осуществляли непараметрическим методом с использованием критерия U Манна—Уитни. Сравнение зависимых групп по количественным признакам осуществляли непараметрическим методом с использованием критерия Вилкоксона. Сравнение независимых групп по качественным признакам выполняли непараметрическим методом путем анализа таблиц сопряженности с использованием двустороннего точного критерия Фишера для несвязанных групп. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Анализ связи (корреляции) двух количественных признаков осуществляли непараметрическим методом ранговой корреляции Спирмена.
Результаты
На фоне терапии в обеих группах удалось достичь сокращения размеров ран, однако в 1-й группе отмечалось более выраженное уменьшение площади и глубины раневых дефектов по сравнению с таковыми во 2-й группе ^=0,02; рис. 1). На фоне местной терапии коллагеном разница площади составила 26,4 (11,7; 32,4) % в отличие
Рис. 2. Разница ТcpО2 (а) и уровней маркера макрофагов CD68 (б) на фоне лечения у больных с ДС.
от стандартной терапии, при которой разница площади на фоне лечения составила 17 (13,3; 26,7)%; p=0,002. В 1-й группе глубина раневых дефектов сократилась на 30,4 (20,0; 41,1) % по сравнению с исходными данными, в то время как во 2-й группе данный показатель равнялся 16,6 (12,5; 32,2)%; p=0,002.
По данным чрескожной оксиметрии отмечено более выраженное усиление локальной микрогемодинамики в 1-й группе по сравнению со 2-й после 9±2 дня терапии ^=0,02; рис. 2, а).
При анализе результатов гистологического исследования и ИГХИ биоптатов тканей раневых дефектов, полученных после хирургической обработки и до начала местного лечения, установлено, что обе группы сопоставимы по интенсивности репаративных процессов в мягких тканях. В ранах обеих групп отмечались выраженный отек, плохо организованный ВКМ, низкое содержание фибро-
бластоподобных клеток и выраженная воспалительная инфильтрация.
По данным гистологического исследования тканей раневых дефектов на фоне лечения в обеих группах выявлено уменьшение отека как в 1-й группе до лечения — 3 (3; 4), после лечения — 2 (2; 2; p<0,001), так и во 2-й группе до лечения — 4 (3;4), после лечения — 2 (2;3; p=0,002). Однако различия между группами статистически незначимы ^=0,79).
Достоверных данных об изменениях организации ВКМ не получено ни в одной из групп после терапии, в чем группы оказались сопоставимы ^=0,77).
В ходе лечения в обеих группах отмечен достоверный переход ран из фазы воспаления в фазу эпителизации (в 1-й группе p<0,001, во 2-й группе p=0,02). Однако статистически значимых различий между группами не выявлено ^=0,6).
По данным световой микроскопии в 1-й группе выявлен процесс перехода от молодой грануляционной ткани к зрелой ^<0,001) в отличие от контрольной группы, в которой отмечено появление созревающей грануляционной ткани на фоне терапии ^<0,001). Однако, несмотря на это, показатели между группами статистически значимо не различались.
По результатам ИГХИ в обеих группах исходно отмечалось окрашивание средней интенсивности маркера макрофагов (СБ68) и ММП-9, слабое окрашивание Т1МР-1 (р>0,05).
На фоне лечения по данным ИГХИ с антителами к маркеру макрофагов СБ68 отмечено статистически значимое увеличение количества макрофагов в 1-й группе ^=0,018), во 2-й группе увеличение количества макрофагов статистически незначимо ^=0,19; рис. 2, б).
В обеих группах выявлено снижение экспрессии ММР-9 после лечения, в 1-й группе отмечалась тенденция к более выраженному снижению активности данной коллагеназы, но различия между группами статистически незначимы ^=0,38). Динамика прироста Т1МР-1 на фоне терапии в обеих группах также статистически незначима (в 1-й группе p=0,64, во 2-й группе р=0,09).
Обсуждение
Изучены особенности репаративных процессов в мягких тканях НК у 42 пациентов с нейропатической и нейроишемической формами (после восстановления кровотока) синдрома ДС, получавших в периоперационном периоде местную терапию с применением СКП или стандартное лечение. Больные были сопоставимы по возрасту, длительности СД, выраженности микрососудистых осложнений СД, размерам и состоянию раневых дефектов, оксигенации мягких тканей.
По данным морфологического исследования биопта-тов тканей раневых дефектов до лечения отмечено замедление репаративных процессов у больных с синдромом ДС, что проявлялось выраженным межклеточным отеком, дезорганизацией ВКМ и воспалительными проявлениями, у большинства больных отмечено наличие воспалительной фазы раневого процесса по данным световой микроскопии. Полученные данные совпадают с результатами опубликованных ранее исследований, свидетельствующих о замедлении процессов заживления у лиц с СД [30—32].
Известно, что раны при нарушениях углеводного обмена характеризуются более продолжительной фазой воспаления, снижением активности воспалительных клеток и замедлением перестройки ВКМ. Эти нарушения способствуют хронизации раневого процесса [33].
Отмечено, что у лиц с нарушенным углеводным обменом снижено количество продуцируемого коллагена, а это ведет к замедлению сокращения размеров раны. Когда фаза воспаления сменяется фазой пролиферации, происходят снижение уровня провоспалительных макрофагов, миграция кератиноцитов в раневое ложе, взаимодействие между ММП, интегринами и цитокинами, в результате чего осуществляется продукция ВКМ [31]. При ИГХИ мягких тканей ран до лечения отмечено усиление экспрессии ММП-9 и снижение уровня Т1МР-1.
Таким образом, полученные клинические, гистологические и иммуногистохимические данные свидетель-
ствуют о хронизации раневого процесса у больных СД уже в 1-е сутки после первичной хирургической обработки дефекта. Наиболее вероятной причиной замедления заживления является «застревание» ран в фазе воспаления, что подтверждается результатами морфологических исследований.
В ходе лечения в 1-й группе отмечались более выраженные репаративные процессы, что подтверждается как клинически (более интенсивное сокращение площади и глубины раневых дефектов), так и морфологически (см. рис. 3, а и далее на цв. вклейке). Кроме того, на фоне лечения в 1-й группе зафиксировано усиление локальной микрогемодинамики по данным чрескожной оксиметрии, что также подтверждается данными гистологического исследований: грануляционная ткань в большинстве случаев была зрелой, после чего формировалась здоровая соединительная ткань.
У пациентов 2-й группы показатели чрескожного напряжения кислорода существенно не отличались от исходных. По данным гистологического исследования (см. рис. 3, б), грануляционная ткань была созревающей, определялись клетки воспалительного инфильтрата. Неудовлетворительное состояние раневых дефектов на фоне стандартного лечения потребовало повторной хирургической обработки и увеличило сроки пребывания больных в стационаре.
Как известно, неоваскуляризация и усиление локальной гемодинамики являются важнейшими факторами, способствующими заживлению раневых дефектов. Так, исследование Т. БтИ и соавт. [34] продемонстрировало, что количество сосудов в дерме (по данным световой микроскопии) больше у пациентов, чьи язвенные дефекты при ДС быстрее эпителизировались.
Следствием улучшения микрогемодинамики можно считать существенное уменьшение отека, тенденцию к организацию ВКМ, практически полное исчезновение воспалительного инфильтрата и формирование здоровой состоятельной грануляционной ткани, достоверно более выраженные в 1-й группе, что подтверждается результатами гистологического исследования и ИГХИ.
По результатам ИГХИ в 1-й группе зафиксировано более выраженное увеличение количества макрофагов, что свидетельствует о более интенсивном переходе раневого процесса из фазы воспаления в фазу пролиферации, а затем в фазу эпителизации (рис. 4).
Известно, что ММП-9 и Т1МР-1 непосредственно участвуют в формировании ВКМ. У лиц с раневыми дефектами НК и СД соотношение ММП-9/Т1МР-1 повышено и является одной из причин замедленного заживления ран [13]. В настоящем исследовании в 1-й группе зафиксировано уменьшение экспрессии ММП-9 на фоне лечения ^=0,007) (рис. 5). Отмечена тенденция к повышению уровня Т1МР-1 на фоне терапии в обеих группах ^=0,34) (рис. 6). Таким образом, можно констатировать, что СКП снижают протеолитическую активность, способствуют более выраженной организации ВКМ и как следствие лучшему заживлению язвенных дефектов.
В исследовании Т. БтИ и соавт. [34] получены аналогичные результаты: уровень ММП-9 статистически значимо повышен у пациентов с плохим заживлением раневых дефектов при синдроме ДС по сравнению с группой без такового и группой, в которой язвенные дефекты хорошо поддавались консервативному лечению.
Несмотря на небольшой объем выборки больных, на основании полученных данных можно сделать вывод, что местное применение СКП положительно влияет на репа-ративные процессы в мягких тканях НК у лиц с нарушенным углеводным обменом и может служить методом выбора для достижения заживления раны вторичным натяжением после хирургической обработки.
Заключение
Местное лечение с применением СКП ведет к более быстрому сокращению площади и глубины раневых дефектов у лиц с различными клиническими формами синдрома ДС. Применение коллагенового раневого покрытия достоверно повышает количество новообразованных сосудов, что способствует ускорению процессов заживления раневых дефектов у лиц с нейропатической и нейрои-шемической формами синдрома ДС.
Использование СКП у лиц с СД сокращает сроки перехода раневого процесса из фазы воспаления в фазу про-
лиферации, позволяет быстрее достичь эпителизации раневого дефекта, что выражается в уменьшении количества клеток воспалительного инфильтрата, уменьшении отека и организации ВКМ, появлении зрелой грануляционной ткани по результатам световой микроскопии и в снижении экспрессии маркера макрофагов СБ68 по данным ИГХИ.
Отмечены достоверное (р<0,05) снижение уровня экспрессии ММП-9 и тенденция к повышению синтеза Т1МР-1 на фоне применения СКП, что способствует ускорению организации ВКМ и формированию качественной грануляционной ткани. Выявлено достоверное увеличение количества новообразованных сосудов по данным ИГХИ при окрашивании маркера СБ31 при использовании раневых покрытий на основе коллагена.
Исследование проведено при спонсорской поддержке ФГБУ ЭНЦ в рамках утвержденной темы научно-исследовательской работы.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанных с рукописью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Винник Ю.С., Салмина А.Б., Дробушевская А.И., Тепляко-ва О.В., Пожиленкова Е.А., Зыкова Л.Д. Клеточные технологии и тканевая инженерия в лечении длительно незаживающих ран. Вестник экспериментальной и клинической хирургии. 2011;4(2):392-397.
2. International Consensus on the Diabetic Foot International Working Group on the Diabetic Foot, 2011.
3. IDF Atlas. 6th ed. 2013.
4. Schultz GS, Sibbald RG, Falanga V, Ayello EA. Wound bed preparation: a systemic approach to wound management. Wound Rep Reg. 2003;11(2):1-28.
5. Fedele D, Comi G, Coscelli C, Cuccinota D. Italian diabetic neuropathy Commetec. A multicentre study on the prevalence of diabetic neuropathy in Italy. Diabetes Care. 1997;620:836-843
6. Sytze Van Dam P, Sweder Van Asbeck B, Willem Erkelens D. The role of oxidative stress in neuropathy and other diabetic complications. Diabet Metabol Rev. 1995;11(3):181-192.
7. Sytze Van Dam P, Sweder Van Asbeck B, Willem Erkelens D. The role of oxidative stress in neuropathy and other diabetic complications. Diabet Metabol Rev. 1995;11(3):181-192.
8. Gillard J, Reed MWR, Buttle D, Cross SS. Matrix metallopro-teinase activity and immunuhistichemical profile of matrix metal-loproteinase-2 and -9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 during human dermal wound healing. Wound Rep Reg. 2004;12(3):295-304.
9. Baker EA, Leaper DJ. Profiles of matrix metalloproteinase and their tissue inhibitors in intraperitoneal drainage fluid: relationship to healing. Wound Rep Reg. 2003;11(4):268-274.
10. Werner S, Grose R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiol Rev. 2003;83:835-870.
11. Vincent Falanga. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. Lancet. 2005;366:1736-1743.
12. Galkowska H, Wojewodzka U, Olszewski WL. Chemokines, cytokines, and growth factors in keratinocytes and dermal endothelial cells in margin of chronic diabetic foot ulcers. Wound Repair Regen. 2006;14:558-565.
13. Liu Y, Min D. Increased matrix metalloproteinase-9 predicts poor wound healing in diabetic foot ulcers. Diabetes Care. 2009;32(1): 17-119.
14. Muller M, Trocme C. Matrix metalloproteinases and diabetic foot ulcers: The ratio of MMP-1 to TIMP-1 is a predictor of wound healing. Diabetic Med. 2008;25(4):419-426.
15. Guo S, Yao F, Zhang Y, Li T. Increased ratio of serum matrix me-talloproteinase-9 against TIMP-1 predicts poor wound healing in diabetic foot ulcers. J Diabet Complicat. 2013;27:380-382.
16. Trengove NJ, Stacey MC, MacAuley S, Bennett N. Analysis of acute and chronic wound environments: the role of proteases and their inhibitors. Wound Rep Reg. 1999;7:442-457.
17. Cullen B, Ivins N. Promogran &Promogran Prisma Made easy. Wounds Intern. 2010;1(3):1-6.
18. Di Lullo GA, Sweeney SM, Korkko J. Mapping the ligand-bind-ing sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J Biol Chem. 2002;277(6):4223-4231.
19. Cullen B, Smith R, McCulloch E. Mechanism of action of PROMOGRAN, a protease modulating matrix, for treatment of diabetic foot ulcers. Wound Repair Regen. 2002;10(1):16-25.
20. Smeets R, Ulrich D, Unglaub F. Effect of oxidized regenerated cellulose/collagen matrix on proteases in wound exudate of patients with chronic venous ulceration. Int Wound J. 2008;5: 195-203.
21. Lobmann R, Zemlin C, Motzkau M. Expression of metallopro-teinases and growth factors in diabetic wounds treated with a protease absorbent dressing. J Diabetes Complications. 2006;20(5): 329-335.
22. Nwomeh BC, Liang H-X, Cohen IK, Yager DR. MMP-8 is the predominate collagenase in healing wounds and non-healing ulcers. J Surg Res. 1999;81(2):189-195.
23. Rayment EA, Upton Z, Shooter GK. Increased matrix metallo-proteinase-9 (MMP-9) activity observed in chronic wound fluid is related to the clinical severity of the ulcer. Br J Dermatol. 2008;158(5):951-961.
24. Cullen B, Boyle C, Webb Y. Modulation of the chronic wound environment; an in vitro evaluation of advanced wound therapies. Presented at Symposium of Advanced Wound Care (SAWC) Tampa FL; 2007.
25. Cullen B, Kemp L, Essler L, Wallenfang-Sohle K, Stadler R. Rebalancing wound biochemistry improves healing: a clinical study examining effect of PROMOGRAN. Wound Rep Regen. 2004;12(2):A4.
26. Cullen B, Watt PW, Lundqvist C. The role of oxidized regenerated cellulose/collagen in chronic wound repair and its potential mechanism of action. Int JBiochem Cell Biol. 2002;34(12):1544-1556.
27. Veves A, Sheenan P, Pham HT. A randomized, controlled trial of Promogran (a collagen/oxidised regenerated cellulose dressing) vs standard treatment in the management of diabetic foot ulcers. Arch Surg. 2002;137(7):822-827.
28. Lobmann R, Zemlin C, Motzkau M. Expression of metallopro-teinases and growth factors in diabetic wounds treated with a protease absorbent dressing. J Diabetes Complications. 2006;20(5): 329-335.
29. Kakagia DD, Kazakos KJ, Xarchas KC. Synergistic action of pro-tease-modulating matrix and autologous growth factors in healing
of diabetic foot ulcers. A prospective randomized trial. J Diabetes Complications. 2007;21(6):387-391.
30. Зайцева Е.Л., Токмакова А.Ю. Роль факторов роста и цито-кинов в репаративных процессах в мягких тканях у больных сахарным диабетом. Сахарный диабет. 2014;1:57-62.
31. Galkowska H, Wojewodzka U, Olszewski WL. Chemokines, cytokines, and growth factors in keratinocytes and dermal endothelial cells in margin of chronic diabetic foot ulcers. Wound Repair Regen. 2006;14:558-565.
32. Maruyama K, Asai J, Ii M, Thorne T, Losordo DW, D'Amore PA. Decreased macrophage number and activation lead to reduced lymphatic vessel formation and contribute to impaired diabetic would healing. Am J Pathol. 2007;170:1178-1191.
33. Boulton A, Cavanagh P, Raymann G. New and alternative treatments for diabetic foot ulcers: hormones and growth factors. The foot in diabetes. 4th ed. John Willey& Sons, Ltd; 2006:214-221.
34. Dinh T, Tecilazich F, Kafanas A, Doupis J, Gnardellis C, Leal E, Tellechea A, Pradhan L, Lyons T, Giurini J, Veves A. Mechanisms Involved in the Development and Healing of Diabetic Foot Ulceration. Diabetes. 2012;61:2937-2947.
Поступила 06.04.2015
