CC BY
26
УДК 631.461:504
DOI: 10.24412/1728-323X-2020-6-14-19
ВЛИЯНИЕ МЕЛИОРАНТОВ НА ДИНАМИКУ ЧИСЛЕННОСТИ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ МИКРОФЛОРЫ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ
А. С. Никифоров, старший преподаватель, Тюменский индустриальный университет, nikiforovas@tyuiu.ru, Тюмень, Россия, Ю. В. Сивков, кандидат биологических наук, доцент, Тюменский индустриальный университет, sivkovjv@tyuiu.ru, Тюмень, Россия
В работе представлены результаты лабораторных исследований динамики изменения численности микрофлоры луговой почвы юга Тюменской области, загрязненной нефтью, в процессе микробной биоремедиации. При постановке эксперимента применялись различные компонентные составы, включающие в себя бакпрепарат и мелиоранты. В качестве основных мелиорантов были выбраны модифицированный вермикулит и гумат калия.
На протяжении опыта менялась как численность почвенной микрофлоры, так соотношение видов в ней и содержание бактерий, внесенных с биопрепаратом. Полученные результаты показали, что динамика численности углеводородокисля-ющей микрофлоры на среде Мюнца представляла собой S-об-разную кривую с периодом экспоненциального роста с 0 до 3—6 суток и последующим плавным отмиранием культуры. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов в вариантах с добавлением сорбента и извести либо только извести не превышала контрольные данные на всем протяжении опыта. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов в вариантах с добавлением сорбента и извести либо только извести не превышала контрольные данные на всем протяжении опыта. Значимо отличался вариант с добавлением извести и гумата калия, в котором численность углеводо-родокисляющих микроорганизмов в 2—3 раза превышала все остальные варианты.
The paper presents the results of laboratory studies of the dynamics of changes in the number of the microflora of the meadow soil in the south of the Tyumen Region, contaminated with oil, in the process of microbial bioremediation. When setting up the experiment, various component formulations were used, including a bacterial preparation and ameliorants. Modified vermiculite and potassium humate were chosen as the main ameliorants.
During the experiment, both the number of soil microflora and the ratio of species in it and the content of bacteria introduced with the biological product changed. The obtained results showed that the dynamics of the number of hydrocarbon-oxidizing microflora on the Muntz medium was an S-shaped curve with a period of exponential growth from 0 to 3—6 days and subsequent gradual death of the culture. The number of hydrocarbon-oxidizing microorganisms in the variants with the addition of a sorbent and lime or only lime did not exceed the control data throughout the experiment. The number of hydrocarbon-oxidizing microorganisms in variants with the addition of a sorbent and lime or only lime did not exceed the control data throughout the experiment. The variant with the addition of lime and potassium humate was significantly different, in which the number of hydrocarbon-oxidizing microorganisms exceeded all other variants by 2—3 times.
Ключевые слова: биоремедиация, нефть, бактерии, биоаугментация, почва, загрязнение.
Keywords: bioremediation, oil, bacteria, bio-augmentation, soil, pollution.
Введение
Для ликвидации аварийных разливов нефти применяются различные методы. Основная их цель состоит в том, чтобы ликвидировать загрязнение либо ускорить биодеградацию нефтяных углеводородов. Одним из биологических методов является микробная биоремедиация, которая заключается в применении углеводородокисляющих бактерий.
Биоремедиация загрязненной нефтью почвы не требует больших затрат и не приводит к вторичному загрязнению. Большинство исследований данного метода сосредоточено на повышении эффективности биореме -диации за счет увеличения активности аборигенных микроорганизмов путем добавления питательных веществ, таких как азот и фосфор. Эти исследования показывают, что местным микроорганизмам требуется много времени для адаптации к загрязнению из-за медленных темпов роста [1, 2]. Кроме того, низкая метаболическая активность этих естественных микробов замедляет темпы биодеградации, а важнейшим условием старта процесса биоремедиации является снижение общей концентрации нефти в почве до уровня, хотя бы в минимальной степени обеспечивающего жизнедеятельность живых организмов в почве [3]. Поэтому применение биоремедиации с использованием местных микробов имеет довольно ограниченную область применения. Один из подходов, часто рассматриваемых для биоремедиации почвы после разлива нефти, — биоаугментация, которая заключается во внесении в очищаемую среду микроорганизмов, способных разлагать углеводороды.
Применение в работе Курицына с соавторами [4] комплексного биопрепарата, содержащего микроорганизмы рода Pseudomonas, Azotobacter и Bacillus, активизированных к условиям детоксикации нефтезагрязнен-ных земель, позволило снизить остаточное содержание нефтепродуктов до санитарной нормы в 20 г/кг.
В исследовании Wilson (1993) [5] представлены штаммы бактерий, которые показали высокую скорость разложения полициклических ароматических углеводородов.
В работе Jinlan Xu (2012) [6] внесение штаммов Aci-netobacter SY21, Neisseria SY22, Plesiomonas SY23, Xan-thomonas SY24, Azotobacter SY42, Flavobacterium SY43 и Pseudomonas SY44 в нефтезагрязненную почву пока-
зало высокую эффективность и темпы биодеградации нефтепродуктов (80 % после 8 дней биоре-медиации).
Применение бактерий для биодеградации нефти и нефтепродуктов показывает достаточно хорошие результаты, но в то же время использование бакпрепаратов для разных условий (климатические условия, характеристики нефти и почвы) имеет свои особенности и обуславливает необходимость проведения дополнительных исследований.
Модели и методы
При моделировании эксперимента было взято пять сосудов с луговой почвой. Почву загрязняли товарной нефтью, тщательно перемешивали, затем в разные варианты вносили биопрепарат, известь, сорбент и гумат калия по схеме:
1. нефть;
2. нефть + биопрепарат;
3. нефть + биопрепарат + известь + сорбент;
4. нефть + биопрепарат + известь + гумат калия;
5. нефть + биопрепарат + известь.
При планировании опытов предполагался одинаковый уровень загрязнения нефтью всех исследуемых образцов, равный примерно 5,0 % от массы почвы. В ходе эксперимента поддерживалась постоянная влажность почвы на уровне 25 %.
Количество внесенного бакпрепарата (Бак-Верад) определялось в соответствии с нормами расхода, определенными производителем. Количество вносимой извести определялось на основании кислотности солевой вытяжки исследуемой почвы. В качестве мелиорантов и для стимуляции углеводородокисляющих бактерий в почву вносились гумат калия и модифицированный вермикулит.
На протяжении опыта определяли общую численность микрофлоры и численность углево-дородокисляющей микрофлоры (УОМ). Общую численность определяли посевом на мясопептон-ный агар (МПА), численность УОМ — на минеральную агаризованную среду Мюнца с 1 % нефти в качестве единственного источника углерода и энергии [7].
В течение 14 дней с определенной периодичностью из каждого опытного сосуда отбирали смешанный образец почвы. Из образца брали навеску почвы 1 г, вносили в пробирку со стерильным физраствором, добавляли каплю ТВИН-80 и энергично встряхивали в течение 1 минуты для разрушения почвенных комочков и десорбции микробных клеток с поверхности почвенных частиц. Затем взвесь отстаивали в течение 10 минут. Приготовленную взвесь последовательно разбав-
ляли в 10, 100, 1000 и более раз [8]. На агаризо-ванные среды в чашки Петри делали посев из кратных разведений, нанося на поверхность среды 0,1 мл жидкости и равномерно распределяя ее по поверхности агара стерильным шпателем. Чашки с посевами на МПА термостатировали при температуре 28—30 °С в течение 3—5 суток, затем подсчитывали число колоний и описывали микробное разнообразие. На среде Мюнца учет вели на 7—10 сутки после посева, так как формирование колоний на ней происходит дольше, вследствие бедного состава среды. Содержание микрофлоры в почве выражали в тысячах или миллионах колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г воздушно-сухой почвы.
Пересчет на воздушно-сухую почву д елали для адекватного сравнения образцов с разной влажностью.
Влажность определяли параллельно в д ень посева. Навеску почвы 10—15 г того же образца высушивали при 85—90 °С до постоянного веса, затем по разнице веса делали расчет влажности почвы.
Частичное определение таксономической принадлежности микроорганизмов делали на основе описания внешнего вида колоний и микроскопических особенностей клетки, используя определитель Берджи.
Результаты и обсуждение
Микрофлора биопрепарата. Из жидкого биопрепарата на МПА высевалась микрофлора численностью порядка 35—40 млн. КОЕ/см3. Всего высевалось 5—6 культур (рис. 1), наиболее внешне опознаваемыми были три, описание которых представлено в таблице 1.
Остальные бактерии биопрепарата имели плохо узнаваемые колонии, внешне неотличимые от микрофлоры исходной почвы — грязно -белые округлые среднего размера, поэтому определить их динамику численности в почве отдельно от аборигенной микрофлоры не представлялось возможным.
Микрофлора исследуемой почвы. Аммонифицирующая микрофлора исходной почвы до внесения нефти и биопрепарата насчитывала около 440 млн КОЕ/г и была представлена в основном вегетативными формами родов Artrhrobacter и подвижными неспорообразующими палочками нескольких видов, а также небольшим количеством бактерий родов Micrococcus и Rhodococcus. В количестве 10—16 млн КОЕ/г в почве присутствовали несколько видов спорообразующих бактерий рода Bacillus. Микромицеты и актиномице-ты на МПА не выявлены (рис. 2).
Рис. 1. Общий вид микрофлоры жидкого биопрепарата при высевах на МПА
Рис. 2. Общий вид микрофлоры исходной почвы при высевах на МПА
Описание наиболее характерных культур биопрепарата
Таблица 1
Номер культуры Численность в биопрепарате, млн КОЕ/см3 Описание колонии
Фото колоний
Описание клеток
1
1,3—4,0
Крупные серовато-белые полупрозрачные блестящие плоские колонии с волнистым краем, слизистой консистенции
I
Мелкие неподвижные неспо-рообразующие палочки, одиночные или сдвоенные
2
0,7
Крупные светло-розовые или кремовые непрозрачные блестящие плоские округлые колонии с неровным краем, кремовой консистенции
Крупные прямые споро-образующие неподвижные палочки
3
10—21
Мелкие желтые непрозрачные блестящие выпуклые круглые колонии, с ровным краем, кремовой консистенции
Мелкие неподвижные неспо-рообразующие, либо короткие палочки, либо сдвоенные кокки
4500
л а
о
ц
О
3000
а м
н -
О
к
1500
Контроль
БП
...... БП + известь + сорбент
БП + известь + гумат калия
БП + известь
г \
л/ Л
у
12
15 18 Сутки опыта
Рис. 3. Изменение численности микрофлоры при биодеградации 5 % нефтезагрязнения в луговой почве
0
0
3
6
9
На протяжении опыта менялась как численность почвенной микрофлоры, так и соотношение видов в ней и содержание бактерий, внесенных с биопрепаратом (рис. 3).
Динамика роста микрофлоры во всех вариантах опыта представляла собой классическую З-образную кривую с экспоненциальной фазой до 3 суток, снижением численности после 6 суток и выходом на плато на 10—14 сутки. Рост общего количества микрофлоры отмечен сразу после внесения нефти и мелиорантов, без периода адаптации (либо этот период был пропущен и пришелся на 1—2 сутки). С 0,5 млрд КОЕ/г в начале эксперимента за 3 суток численность достигла 2,3—3,7 млрд КОЕ/г в разных вариантах. Такой активный рост может объясняться тем, что луговая почва обладает высоким потенциалом самовосстановления: высоким содержанием гумино-вых веществ и многочисленной почвенной микрофлорой, способной со временем утилизировать
5 % нефтяное загрязнение самостоятельно. На
6 сутки отмечено снижение численности. Такая закономерность была общей как в контроле, так и в опытных вариантах, однако для варианта с
биопрепаратом, сорбентом и известью отмечена устойчивая повышенная численность почти на всем протяжении опыта. В варианте с биопрепаратом, а также при его сочетании с известью и гу-матом калия, численность микрофлоры ненамного превышала контрольную, а к концу опыта разница между вариантами сглаживалась.
Мониторинг численности трех культур, внесенных с биопрепаратом, показал их разное поведение в почве (рис. 4). Культура № 1, содержавшаяся в биопрепарате в количестве 1,3— 4,0 млн КОЕ/см3, менялась параллельно с общей численностью микрофлоры: размножалась на 3— 6 сутки опыта, затем либо снижала численность в 3—20 раз, как в варианте № 2 (только биопрепарат в качестве мелиоранта), либо оказывалась за пределами обнаружения, как в вариантах № 3, 4 и 5 (биопрепарат с добавками).
Культура № 2 была малочисленной в жидком биопрепарате (0,7 млн КОЕ/см3). Ее содержание в ходе опыта было максимальным на 3—6 сутки, затем снижалось в вариантах с добавлением извести, сорбента и гумата калия, лишь в варианте с биопрепаратом без добавок возрастало на 10—17 сутки опыта.
Численность культуры № 3 в разных вариантах менялось различно: при добавлении извести и извести с гуматом калия росла до 10 суток, затем снижалась. В опыте только с биопрепаратом — менялось несколько раз скачкообразно, при добавлении извести и сорбента возрастала к концу эксперимента. Возможно, вместе с культурой № 3 из биопрепарата была учтена почвенная микрофлора со сходного вида колониями, так как жел-топигментные бактерии встречаются в почвах.
Динамика численности угл ево доро докис ля -ющей микрофлоры на среде Мюнца также представляла собой З-образную кривую с периодом экспоненциального роста с 0 до 3—6 суток и
е * 8 @ к а к
о Ц
о
и
Р
250 200 150 100 50 0
5
6
10
"О— 17
я «
и
14
Сутки опыта Культура 1
_в_2 3
--4 ■ 5
О—I
6 10 14 17 Сутки опыта
Культура 2
140
ы 120
турь/г 100
^ ь К т й и 80 60
н мл нм е л с и Р 40
20 0
2 3 —■>— 4 —с> 5 /........*
/ /г ( ^Ч/"
ч ч J * V \о./ \ / \ V -о
6 10 14 17 Сутки опыта
Культура 3
3
3
3
Рис. 4. Изменение содержания трех культур из биопрепарата в разных вариантах опыта: 2 — биопрепарат; 3 — биопрепарат + известь + сорбент; 4 — биопрепарат + известь + гумат калия; 5 — биопрепарат + известь
4500
м о
к
3000
о
1500
S
Контроль БП
БП + известь + сорбент БП + известь + гумат калия БП + известь
12 15 18 Сутки опыта
Рис. 5. Динамика численности углеводородокисляющей микрофлоры при биодеградации 5 % нефтезагрязнения в луговой почве
0
0
3
6
9
последующим плавным отмиранием культуры (рис. 5). Однако для каждого варианта были свои закономерности: аборигенная углеводородокис-ляющая микрофлора в контроле имела сглаженную форму кривой с двумя максимумами на 3 и 14 сутки. В варианте с биопрепаратом без добавок кривая численности УОМ имела 3 максиму-
мума — на 3, 10 и 17 сутки. Численность УОМ в вариантах с добавлением сорбента и извести либо только извести не превышала контрольные данные на всем протяжении опыта. Значимо отличался вариант с добавлением извести и гумата калия, в котором численность УОМ в 2—3 раза превышала все остальные варианты. В работах других авторов [9, 10] также отмечается стимулирующее воздействие на процессы микробной деградации углеводородов нефти.
Заключение
Таким образом, наиболее активный рост почвенной микрофлоры отмечен в вариантах с добавлением жидкого биопрепарата, извести и сорбента либо гумата калия. Максимальной численности микрофлора луговой почвы достигала на 3—6 сутки после внесения нефти и мелиорантов. Микрофлора биопрепарата относительно аборигенной микрофлоры была сравнительно немногочисленна — 6—15 %, в ряде случаев элиминировала к середине эксперимента.
Библиографический список
1. Янкевич М. И., Хадеева В. В., Мурыгина В. П. Биоремедиация почв: вчера, сегодня, завтра // Биосфера. — 2015. — № 2. URL: https://cyberleninka.rU/article/n/bioremediatsiya-pochv-vchera-segodnya-zavtra (дата обращения: 19.10.2020).
2. Никифоров А. С., Сивков Ю. В. Исследование естественного самоочищения нефтезагрязненных почв юга тюменской области // Агрохимический вестник. — 2020. — № 5. — С. 75—79.
3. Смольникова В. В., Дементьева Д. М., Дементьев М. С. Особенности биоремедиации нефтезагрязненных почв // Известия Самарского научного центра РАН. — 2011. — № 1—5. — URL: https://cyberleninka.ru/article/n/osobennosti-bioremediatsii-neftezagryaznennyh-pochv (дата обращения: 19.10.2020).
4. Курицын А. В., Курицына Т. В., Катаева И. В. Биоремедиация нефтезагрязненных грунтов на технологических площадках // Известия Самарского научного центра РАН. — 2011. — № 1—5. — URL: https://cyberleninka.ru/article/n/ bioremediatsiya-neftezagryaznennyh-gruntov-na-tehnologicheskih-ploschadkah (дата обращения: 19.10.2020).
5. Wilson S. C., Jones K. C. Bioremediation of soil contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons: a review [J]. Environmental pollution, 1993, 81 (3): P. 229—249.
6. Jinlan Xu (2012). Bioremediation of Crude Oil Contaminated Soil by Petroleum-Degrading Active Bacteria, Introduction to Enhanced Oil Recovery (EOR) Processes and Bioremediation of Oil-Contaminated Sites, Dr. Laura Romero-Ze^n (Ed.), ISBN: 978-953-51-0629-6, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/ books/introduction-to-enhanced-oil-re-covery-eor-processes-and-bioremediationof-oil-contaminated-sites/ bioremediation-of-oil-contaminated-soil-by-highly-pe-troleum-degrading-bacteria
7. Романенко В. И., Кузнецов С. И. Экология микроорганизмов пресных водоемов. Лабораторное руководство. — Л.: Наука, 1974. — С. 25—26.
8. Звягинцев Д. Г., Асеева И. В., Бабьева И. П. Методы почвенной микробиологии и биохимии. — М.: Изд-во МГУ, 1980. — 224 с.
9. Кулагин А. А., Ганеев И. Г., Сухова С. В., Зиганшин З. У. О безопасности использования технологии рекультивации нефтезагрязненных, нарушенных и деградированных земель с применением гуминовых препаратов // Известия Уфимского научного центра РАН. — 2015. — № 4 (1). — С. 83—85.
10. Минникова Т. В., Колесников С. И., Денисова Т. В. Влияние азотных и гуминовых удобрений на биохимическое состояние нефтезагрязненного чернозема // Юг России: экология, развитие. — 2019. — Т. 14, № 2. — C. 189—201. DOI: 10.18470/1992-1098-2019-2-189-201.
INFLUENCE OF MELIORANTS ON THE DYNAMICS OF THE NUMBER OF HYDROCARBON MICROFLORA IN OIL-CONTAMINATED SOILS
A. S. Nikiforov, Senior Lecturer, Tyumen Industrial University, nikiforovas@tyuiu.ru, Tyumen, Russia,
Yu. V. Sivkov, Ph. D. in Biology, Associate Professor, Tyumen Industrial University, sivkovjv@tyuiu.ru, Tyumen, Russia
References
1. Yankevich M. I., Khadeeva V. V., Murygina V. P. Bioremediaciya pochv: vchera, segodnya, zavtra. [Bioremediation of soils: yesterday, today, tomorrow]. Biosfera. 2015. No. 2, available at: https://cyberleninka.ru/article/n7bioremediatsiya-pochv-vchera-segodnya-zavtra, date of access: 19.10.2020.
2. Nikiforov A. S., Sivkov Y. V. Issledovanie estestvennogo samoochisheniya neftezagryaznennyh pochv yuga tyumenskoj oblasti. [Investigation of natural self-purification of oil-contaminated soils in the South of the Tyumen Region]. Agrohimicheskij vest-nik, 2020. No. 5. P. 75—79 [in Russian].
3. Smolnikova V. V., Dementyeva D. M., Dementyev M. S. Osobennosti bioremediacii neftezagryaznennyh pochv. [Features of bioremediation of oil-contaminated soils]. Izvestiya Samarskogo nauchnogo centra RAN. 2011. No. 1—5. available at: https:// cyberleninka.ru/ article/ n/ osobennosti-bioremediatsii-neftezagryaznennyh-pochv, date of access 19.10.2020.
4. Kuritsyn A. V., Kuritsyna T. V., Kataeva I. V. Bioremediaciya neftezagryaznennyh gruntov na tehnologicheskih ploshadkah. [Bioremediation of oil-contaminated soils at technological sites] Izvestiya Samarskogo nauchnogo centra RAN. 2011. No. 1—5. available at: https://cyberleninka.ru/ article/n / bioremediatsiya-neftezagryaznennyh-gruntov-na-tehnologicheskih-ploschad-kah, date of access: 19.10.2020.
5. Wilson S. C., Jones K. C. Bioremediation of soil contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons: a review. Environmental pollution, 1993, No. 81 (3). P. 229—249 [in English].
6. Jinlan Xu (2012). Bioremediation of Crude Oil Contaminated Soil by Petroleum-Degrading Active Bacteria, Introduction to Enhanced Oil Recovery (EOR) Processes and Bioremediation of Oil-Contaminated Sites, Dr. Laura Romero-Zeron (Ed.), ISBN: 978-953-51-0629-6, In Tech. available at: http://www.intechopen.com/books/ introduction-to-enhanced-oil-recov-ery-eor-processes-and-bioremediationof-oil-contaminated-sites/bioremediation-of-oil-contaminated-soil-by-highly-petrole-um-degrading-bacteria, date of access: 19.10.2020.
7. Romanenko V. I., Kuznetsov S. I. Ekologiya mikroorganizmov presnyh vodoemov. [Ecology of microorganisms in freshwater reservoirs]. Laboratornoe rukovodstvo. Leningrad, Nauka, 1974. P. 25—26 [in Russian].
8. Zvyagintsev D. G., Aseeva I. V., Babeva I. P. Metody pochvennoj mikrobiologii i biohimii. [Methods of soil Microbiology and biochemistry]. Moscow, Izd-vo MGU, 1980. 224 p. [in Russian].
9. Kulagin A. A., Ganeev I. G., Sukhova S. V., Ziganshin Z. U. O bezopasnosti ispolzovaniya tehnologii rekultivacii neftezagryaznennyh, narushennyh i degradirovannyh zemel s primeneniem guminovyh preparatov. [About safety of the use of technology of recultivation of the oil-polluted, disturbed and degraded lands with application of humic preparations]. Izvestiya Ufimskogo nauchnogo centra RAN. 2015. No. 4 (1). P. 83—85 [in Russian].
10. Minnikova T. V., Kolesnikov S. I., Denisova T. V. Vliyanie azotnyh i guminovyh udobrenij na biohimicheskoe sostoyanie nefte-zagryaznennogo chernozema. [Influence of nitrogen and humic fertilizers on the biochemical state of the oil-contaminated Chernozem]. Yug Rossii: ekologiya, razvitie. 2019. Vol. 14, No. 2. P. 189—201. DOI: 10.18470/1992-1098-2019-2-189-201 [in Russian].
