Влияние мелатонина на уровень повреждения ДНК сперматозоидов белых крыс Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ БИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА

УДК 576.08

ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА УРОВЕНЬ ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК СПЕРМАТОЗОИДОВ БЕЛЫХ КРЫС

С.М. Слесарев, В.В. Шестаков, А.В. Хохлова, Е.В. Слесарева

ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»

Мелатонин - гормон эпифиза, обладающий широким спектром биологической активности, которая в настоящее время интенсивно изучается. Он не только является трансдук-тором циркадианных ритмов, но и обладает прямой антирадикальной активностью, оказывает непрямое протекторное действие в отношении макромолекул клетки, проявляющееся в регуляции транскрипции генов антиоксидантных ферментов. Также в последние несколько лет показана зависимость нуклеотидэксцизионного репарационного механизма ДНК от циркадианных ритмов. Цель исследования - определить влияние мелатонина на количество разрывов в ДНК после его введения в физиологических концентрациях интактным животным. В результате исследования было обнаружено, что мелатонин может оказывать протекторное действие в низких концентрациях, введение мелатонина в

ночное время оказывает более выраженный эффект. Полученные нами данные свидетельствуют о тканенеспецифичности протекторного действия низких концентраций ме-латонина.

Ключевые слова: мелатонин, однонитевые и двунитевые разрывы ДНК, методика Comet assay.

Введение. По данным ряда авторов, среди всех причин бесплодия доля мужского бесплодия составляет от 25 до 50 %, являясь не только серьезной медицинской, но и социальной проблемой [1]. Ряд нарушений репродуктивной функции может быть связан с повреждениями генетического материала развивающихся мужских половых клеток, которые либо носят стохастический характер (вследствие ошибки в работе ферментных систем репликации и репарации молекул ДНК), либо могут быть вызваны различными внешними причинами (физические и химические факторы). Их действие на ДНК в основном обусловлено образующимися активными формами кислорода и другими свободными радикалами [2].

Считается, что развивающиеся мужские половые клетки крайне чувствительны к повреждающим действиям, что обусловлено дефицитом в них антиоксидантов и систем восстановления структуры ДНК, причем способность мужских половых клеток самим генерировать свободные радикалы находится в обратной зависимости от их зрелости [3].

Протекторные свойства мелатонина имеют дозозависимый эффект. При высоких концентрациях они обусловлены прямыми антиоксидантными свойствами молекулы. При невысоких, сопоставимых с физиологическими, дозах они обусловлены генорегули-рующими свойствами мелатонина и представляют интерес для исследования [11].

Цель исследования. Определить влияние мелатонина на количество разрывов в ДНК после его введения в физиологических концентрациях интактным животным.

Материалы и методы. Эксперимент был выполнен на 56 самцах белых крыс. Общее количество групп - 8 (по 7 животных в группе). Группы были разделены на 2 подгруппы (по 4 группы в каждой) по времени выведения из эксперимента - дневное и ночное. Схема введения мелатонина в обеих подгруппах представлена в табл. 1.

Таблица 1

Схема введения мелатонина

Выведение из эксперимента № группы Вводимое вещество

1 Контроль

День 2 Мелатонин - утро

3 Мелатонин - вечер

4 Мелатонин - круглосуточно

5 Контроль

Ночь 6 Мелатонин - утро

7 Мелатонин - вечер

8 Мелатонин - круглосуточно

Животных в течение 20 дней адаптировали к 12-часовому режиму освещения (свет с 8-00 до 20-00). Доступ к пище и воде был

свободным. По истечении адаптационного периода в течение двух недель до выведения из эксперимента животные получали мелато-

нин в соответствии с 3 схемами введения: 1) круглосуточно; 2) в дневное время (с 8-00 до 20-00); 3) в ночное время (с 20-00 до 8-00). Мелатонин вводился с питьевой водой в течение 10 дней, в дозе 500 мкг/кг, в которой он оказывает непрямое антиоксидантное действие [13, 16]. В работе использовался мелатонин производства фирмы Unipharm Inc. (США) в таблетках по 3 мг под торговым названием Melaxen. Растворы мелатонина готовились на 50 % этаноле и отфильтровывались от вспомогательных веществ, содержащих кальция фосфат, магния стеарат и тальк. Животные групп, не получавших мелатонин, получали эквивалентное количество этанола в питьевой воде, конечная концентрация этанола была пренебрежимо мала. Выведение животных из эксперимента проводилось на 14-е сут после начала введения мелатонина под хлороформным наркозом в дневное и ночное время в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».

Для исследования брались придатки семенников, которые помещались в фосфатно-солевой буферный раствор (рН=7,4) с 5 % диметилсульфоксидом, замораживались и хранились до завершения эксперимента при t=-25 °С.

Уровень повреждений ДНК в сперматозоидах оценивался с помощью методики Comet assay, достоинствами которой являются относительная простата исполнения и высокая чувствительность в пределах 5010000 повреждений ДНК на клетку [15].

Было использовано 2 модификации методики Comet assay, позволяющих выявлять несколько типов повреждений ДНК, в частности: 1) щелочная версия, выявляющая общее количество разрывов (1-, 2-нитевые разрывы и щелочно-лабильные сайты); 2) нейтральная версия, предназначенная для выявления 2-нитевых разрывов ДНК.

При проведении исследования использовался модифицированный протокол P.L. Olive [15].

1. Подготовка слайдов.

Для улучшения адгезии агарозы применялись частично фростированные предмет-

ные стекла, подготовленные с использованием абразивного материала, обезжиренные ацетоном и 1 % раствором «Тритон Х-100». Стекла покрывались 1 % раствором агарозы с фростированной стороны, высушивались при комнатной температуре и хранились до проведения анализа.

2. Подготовка образцов.

2.1. Образцы со сперматозоидами размораживались в течение 10 мин при комнатной температуре.

2.2. Плотность клеток в образцах контролировалась с использованием камеры Го-ряева, образцы разводились PBS с EDTA до конечной концентрации 210 клеток/мл.

2.3. 100 мкл клеточной суспензии смешивалось с 2 мл 1 % LMP-агарозы, расплавленной и охлажденной до 45 °С на тер-мошейкере при постоянном перемешивании в 2 мл пробирках-эппендорфах.

2.4. 800 мкл агарозно-клеточной суспензии наносилось на подогретые до 45 °С слайды.

2.5. Слайды помещались на аккумулятор холода (4 °С), и агароза твердела в течение 5 мин.

3. Лизис.

Полученные слайды помещались в нейтральный лизирующий раствор (1,25 M NaCl, 0,09 M H3BO3, 0,09 M Tris-base, 0,25 M EDTA, 0,25 M Na2SO3, 1 % Triton X-100, 10 N NaOH до растворения всего EDTA и подъема pH до 8,5) в герметичные емкости по 4 стекла в каждую, лизис осуществлялся при 4-5 °С в холодильнике в течение ночи.

4. После лизиса слайды промывались в дистиллированной воде в течение 5 мин.

5. Затем слайды инкубировались с про-теиназой К (DNAse free) 0,5 мг/мл (раствор с добавлением 10 мкмоль Са2+ и 0,5 % Triton X-100 [4, 15], по 100 мкл раствора на слайд. Инкубация осуществлялась в термостате в течение 1 ч при 37 °С.

6. Далее слайды дважды промывались дистиллированной водой в течение 5 мин.

7. На данном этапе слайды делились на 2 группы:

1) щелочной электрофорез (рН=12,3);

2) нейтральный электрофорез (рн=8,5).

8. Слайды отмывались 5 мин в дистиллированной воде.

9. Ионная эквилибровка в течение 20 мин в электрофорезном буфере с соответствующим рН.

10. Электрофорез слайдов проводился в течение 20 мин при напряжении 20 В и силе тока 40 мА.

11. После электрофореза слайды обрабатывались осаждающим раствором (50 % C2H5OH, 0,05 M Tris-base), по 400 мкл/слайд.

12. Окраска слайдов красителем DNA-Dye NonTox в 100-кратном разведении б^оск-раствора для гелей в течение 20 мин, по 250 мкл/слайд.

13. Слайды промывались 5 мин в дистиллированной воде.

14. Затем слайды микроскопировались. Рассчитывался индекс поврежденных клеток в выборках как отношение количества найденных комет к количеству сперматозоидов без повреждений и фотографировались найденные кометы. На каждом слайде анализировалось по 100 клеток.

Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием критерия Манна-Уитни для попарного сравнения групп с контролем, уровень значимости отличий p=0,05.

Результаты и обсуждение

а)

1. Доля сперматозоидов, экспрессирую-щих общее количество повреждений ДНК (1- и 2-нитевые разрывы ДНК, а также щелоч-но-лабильные сайты) в виде «ДНК-комет».

В результате исследования было установлено, что при дневном выведении животных из эксперимента введение последним мелатонина привело к достоверному (р<0,05) снижению доли сперматозоидов с общим количеством повреждений ДНК во 2-й группе (введение мелатонина утром (медиана=0; 25 персентиль=0; 75 персентиль=0)) и 3-й группе (введение мелатонина вечером (медиа-на=0; 25 персентиль=0; 75 персентиль=0)) по сравнению с контролем - 1-й группой (ме-диана=0,0334; 25 персентиль=0; 75 персен-тиль=0,1139) (рис. 1а).

Аналогичная ситуация наблюдалась и при ночном выведении из эксперимента. Доля клеток с повреждениями достоверно снижалась в 6-й группе (введение мелатонина утром (медиана=0; 25 персентиль=0; 75 персен-тиль=0,0075)) и 7-й группе (введение мелато-нина вечером (медиана=0; 25 персентиль=0; 75 персентиль=0)) по сравнению с контролем - 8-й группой (медиана=0,0325; 25 пер-сентиль=0,005; 75 персентиль=0,07) (рис. 1б).

Доля клеток с общим количеством разрывов ДНК

0,30

0,25

* 0,20 о

«В 0,15

к с о ч:

0,10

0,05 0,00 -0,05

ср

CN

_fl с о

Ср

ср со

ср ш

т ф

m

ср

<j

о

Median I I 25%-75%

Non-Outlier Range Extremes

группы животных (выведение из эксперимента - день)

б)

Доля клеток с общим количеством разрыво ДНК

с о

0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 -0,01

ю

-—. '—.

si si

1_ I—

CÇ6

а.

о а)

H т

> ш

1 m

I 1

s I

I s

о I

H о

го h-

с го

ш с

s ш

s

i_

SÜ

о о с

группы животных (выведение из эксперимента - ночь)

Median 25%-75% I Non-Outlier Range о Outliers Extremes

Рис. 1. Доля сперматозоидов белых крыс (выраженная в долях единицы) с общим количеством повреждений ДНК: а) дневное выведение животных из эксперимента; б) ночное выведение животных из эксперимента. Тип графика - Box-percentile plot with whiskers, ломаная линия показывает изменение медианных значений в группах. Нижний и верхний усы показывают границы 1,5 интерквартильного размаха (12,5 и 82,5 % данных соответственно). Остальные обозначения даны на графике. График получен с помощью статистического пакета Stasistica 6.0

Однако в группах с ночным выведением из эксперимента при хроническом введении мелатонина утром, а также вечером отмечался достоверный спад доли сперматозоидов с общим количеством повреждений: в 6-й группе (введение мелатонина утром (ме-диана=0; 25 персентиль=0; 75 персентиль= 0,0075)) и 7-й группе (введение мелатонина вечером (медиана=0; 25 персентиль=0; 75 пер-сентиль=0)) по сравнению с контролем -5-й группой (медиана=0,0325; 25 персен-тиль=0,005; 75 персентиль=0,07) (рис. 2). При круглосуточном введении мелатонина достоверного снижения доли поврежденных клеток не наблюдалось. Такой эффект может быть связан с циркадианной динамикой повреждений ДНК [12]. Так, недавно было установлено, что сигналинг повреждений ДНК и NER-репарационный механизм находятся под управлением циркадианных часов клетки

[6, 8]. Поскольку мелатонин усиливает экспрессию генов некоторых антиоксидантных ферментов [2] и такое действие может иметь дозозависимый характер [10], то, следовательно, протекторного эффекта с большей вероятностью можно ожидать в группах с ночной фиксацией биоматериала. В это время действие эндогенного мелатонина усиливается влиянием экзогенного (в нашем эксперименте этот эффект проявился в 2 группах дневного против 4 групп ночного выведения из эксперимента). При круглосуточном введении мелатонина как в дневном, так и в ночном выведении животных из эксперимента достоверных отличий не было, но наблюдалась тенденция к снижению количества поврежденных клеток при введении мелатонина: контроль -1-я группа (медиана=0,0334) и 4-я группа (мелатонин круглосуточно (медиана=0,0192)), р=0,0673 в дневном и контроль - 5-я группа

(медиана=0,0325) и 8-я группа (мелатонин круглосуточно (медиана=0,0167)), р=0,381 в ночном забое соответственно.

Таким образом, при введении мелатонина в ночное время он оказывает более выраженный протекторный эффект по сравнению с его введением в дневное время и круглосуточно.

2. Доля сперматозоидов, экспресси-рующих 2-нитевые повреждения ДНК в виде «ДНК-комет».

При дневном выведении животных из эксперимента введение мелатонина не привело к достоверному изменению доли сперматозоидов с 2-нитевыми разрывами ДНК в какой-либо из 4 групп по сравнению с контролем. Наблюдаемые изменения являются лишь стохастическими флуктуациями.

При ночном выведении животных из эксперимента введение мелатонина вечером в 7-й группе привело к снижению (р<0,05) уровня 2-нитевых повреждений ДНК (медиа-на=0; 25 персентиль=0; 75 персентиль=0,01) по сравнению с контролем - 5-й группой (ме-диана=0,0325; 25 персентиль=0,0178; 75 пер-сентиль=0,05). Введение мелатонина при других схемах такого влияния не оказало (рис. 2).

Заключение. Таким образом, данные эксперимента подтверждают впервые поя-

вившиеся в 2000-е гг. сведения о наличии у мелатонина непрямых протекторных свойств, которые, в отличие от прямых антиоксидант-ных свойств, проявляются при низких физиологических концентрациях и связаны в основном с регуляцией экспрессии генов ферментов антиоксидантной системы [11]. При изучении уровня м-РНК трех ферментов ан-тиоксидантной системы клеток тканей мозга: глутатион-пероксидазы, Си, 2п-зависимой супероксиддисмутазы, а также Мп-зависимой супероксиддисмутазы было выявлено, что введение мелатонина в более низкой дозе (50 мкг/кг) вызывало почти в 4 раза большее увеличение относительного уровня м-РНК ферментов, чем введение мелатонина в высокой дозе (500 мкг/кг). Также показано, что при введении мелатонина в высокой дозе он оказывает примерно одинаковое действие на уровень м-РНК как при остром, так и при хроническом введении [9, 14, 17].

Дозозависимый подавляющий митотиче-скую активность эффект мелатонина показан также при изучении его влияния на опухолевый рост. Высокие, надфизиологические, дозы гормона не оказывали влияния на рост некоторых типов опухолей, в то время как его физиологические дозы тормозили рост злокачественных новообразований [5].

Рис. 2. Доля сперматозоидов белых крыс (выраженная в долях единицы) с общим количеством повреждений ДНК.

Расшифровка обозначений соответствует рис. 1

Доля клеток с 2-нитевыми разрывами

о

н

ф

к с; о

0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 -0,01

ср |_

ю

.0 с;

0 ср

H

1

о

о С с

s о ср H > Ф T Ф 00 d о F

X s I m ■ > ср

о s 1

H i

m о s

ц H m

ф о

S Ф H m

S ^ Ф S

Median I I 25%-75%

Non-Outlier Range Extremes

группы животных (выведение из эксперимента - ночь)

В доступной нам литературе встречаются единичные работы, посвященные оксидатив-ному стрессу в семенниках [7], результаты которых не позволяют судить о тканеспеци-фичности действия мелатонина. Полученные нами данные свидетельствуют о тканенеспе-цифичности протекторного действия низких концентраций мелатонина в отношении сперматозоидов белых крыс.

1. Абубакиров А. Н. Повреждение ДНК сперматозоидов и мужское бесплодие / А. Н. Абубакиров // Урология. - 2009. - № 3. - С. 86-91.

2. Кислородный эффект при тепловых повреждениях ДНК / А. В. Черников [и др.] // Биофизика. - 2007. - Т. 52, вып. 2. - С. 244-251.

3. Aitken R. J. Oxidative stress in the male germ line and its role in the aetiology of male infertility and genetic disease / R. J. Aitken, M. A. Baker,

D. Sawyer // Reproductive Biomedicine Online. -20034- VAZqUeHssAe DNA. Re-Mr Measured by the Comet Assay / A. Azqueta, S. Shaposhnikov, A. R. Collins // DNA Repair, Publisher InTech. - 2011. -P. 615-636.

5. Blask D. E. Putting cancer to sleep at night: the neuroendo-crine/circadian melatonin signal / D. E. Blask, R. T. Dauchy, L. A. Sauer // Endocrine. -2005. - Vol. 27, № 2. - P. 179-188.

6. Circadian oscillation of nucleotide excision repair in mammalian brain / T. H. Kang [et. al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2009. - Vol. 106. -P. 2864-2867.

7. Combined effects of Vitamin E and Vitamin C supplementation on cadmium induced testicular morphology and oxidative stress / R. D. Kini [et al.] // Research J. of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2011. - Vol. 2, issue 4. - P. 27-34.

8. Jackson S. P. The DNA-damage response in human biology and disease / S. P. Jackson, J. Bartek // Nature. - 2009. - Vol. 461. - P. 1071-1078.

9. Kotler M.Melatonin increases gene expression for antioxidant enzymes in rat brain cortex / M. Kotler [et al.] // J. of Pineal Research. - 1998. -Vol. 24. - P. 83-89.

10. Melatonin Anticancer Effects: Review / G. Di Bella [et. al.] // International J. of Molecular Sciences. - 2013. - № 14. - P. 2410-2430.

11. Melatonin as an antioxidant: biochemical mechanisms and pathophysiological implications in humans / R. J. Reiter [et al.] // Acta Biochemica Polonica. - 2003. - Vol. 50, № 4. - P. 1129-1146.

12. Melatonin enhances DNA repair capacity possibly by affecting genes involved in DNA damage responsive pathways / Ran Liu [et al.] // Cell Biology. - 2013. - Vol. 14, № 1. - P. 1-8.

13. Neurohormone melatonin prevents cell damage: effect on gene expression for antioxidant enzymes / I. Antolin [et al.] // FASEB J. - 1996. -Vol. 10. - P. 882-890.

14. Okatani Y. Melatonin increases activities of glutathione peroxidase and superoxide dismutase in fetal rat brain / Y. Okatani, A. Wakatsuki, C. Kaneda // J. of Pineal Research. - 2000. - Vol. 28. - P. 89-96.

15. Peggy L. O. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells / L. O. Peggy, J. P. Banath // Nature Protocols. - 2006. - Vol. 1. - P. 23-29.

16. Regulation of antioxidant enzymes: a significant role for melatonin / C. Rodriguez [et al.] // J. of Pineal Research. - 2004. - Vol. 36. - P.1-9.

17. The protective effects of melatonin from oxidative damage induced by amyloid beta-peptide 25-35 in middle-aged rats / Y. X. Shen [et al.] // J. of Pineal Research. - 2002. - Vol. 32. - P. 85-89.

EFFECT OF MELATONIN ON THE LEVEL OF DNA DAMAGE IN THE SPERM CELLS OF WHITE RATS

S.M. Slesarev, V.V. Shestakov, A.V. Hohlova, E.V. Slesareva

Ulyanovsk State University

Melatonin is the hormone of pineal gland possessing wide spectrum of a biological activity has been intensively studied. It is not only transducer of circadian rhythms, but possesses a direct scavenger activity from free radicals and an indirect protective activity against cells macromolecules manifested in the regulation of gene transcription of antioxidant ferments. Also in the last few years, NER pathway of repair DNA fromt a circadian rhythm is shown. Goal of current research is to determine influence of melatonin on quantity of DNA breaks after melatonin administration at physiological concentration to intact animals.

The result of study - found that melatonin may exert a protective effect at low concentrations, the administration of melatonin at night have a more pronounced protective effect. Our data indicate are non specificity protective effect of low concentrations of melatonin.

Keywords: melatonin, single and double strand breaks of DNA, a method «Comet assay».