CC BY
435
Бюллетень Брянского отделения РБО, 2013. № 2(2). С. 129-133.
Bulletin of Bryansk dpt. of RBS, 2013.
N 2(2). P. 129-133.
БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 634.1:581.143.6
ВЛИЯНИЕ МАРКИ АГАР-АГАРА НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ IN VITRO РАСТЕНИЯ МАЛИНЫ
© Д.Н. Сковородников1, Н.В. Милехина1, Н.А. Сковородникова2 D.N. Skovorodnikov, N.V. Milekhina, N.A. Skovorodnikova
Influence of agar-agar on the cultivated in vitro raspberry plants
1ФГБОУВПО «Брянская государственная сельскохозяйственная академия», кафедра химии, биотехнологии и физиологии растений 243365, Россия, Брянская обл., Выгоничскийр-н, с. Кокино, ул. Советская 2a.
Тел.: +7(48341)2-44-79, e-mail: skovorodnikov_d@mail.ru 2ФГБОУВПО «Брянский государственный университет им. акад. И.Г. Петровского», кафедра экологии и рационального природопользования 241036, Россия, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. Тел.: +7(4832)66-68-16, e-mail: skovorodnikova_n@mail.ru
Аннотация. В работе проведена сравнительная оценка четырех марок агар-агара при клональном микроразмножении ремонтантной малины. В зависимости применяемого желирующего вещества, культивируемые in vitro растения, существенно отличались по показателям роста и развития. Установлено преимущество использования агара марки Panreac и Bacto agar на этапах пролиферации и элонгации побегов.
Ключевые слова: ягодные культуры, малина, культура ткани, клональное микроразмножение, питательная среда, агар-агар.
Abstract. The article presents the comparative estimation of four agar-agar marks at the clonal micropropagation of remontant fruiting raspberries. The cultivated in vitro plants essentially differed in growth and development indicators depending on the applied gelling agent substance. The advantage of use of the agar mark Panreac and Bacto agar at the stages of proliferation and elongation of shoots is established.
Keywords: small fruits, raspberry, tissue culture, clonal micropropagation, nutrient medium, agar-agar.
Введение
Ремонтантные формы малины - уникальные ягодные растения, способные, в отличие от обычных растений малины, плодоносить на однолетних побегах. Лучшие из современных сортов ремонтантного типа обладают высокой урожайностью, крупноплодностью, экологической адаптивностью, пригодны к низкозатратным технологиям возделывания. Однако многие ремонтантные формы малины, обладают низким потенциалом вегетативного размножения, по сравнению с летними сортами малины, что затрудняет их размножение и использование в селекционном процессе (Казаков, Евдокименко, 2007).
Решить проблему ускоренного размножения ценного селекционного материла, стало возможным благодаря применению метода клонального микроразмножения. В сравнении с традиционными способами размножения малины - корневыми отпрысками, корневыми и зелеными черенками, этот способ имеет целый ряд несомненных преимуществ, главные из которых - высокий коэффициент размножения и возможность оздоровления посадочного материала от ряда вредоносных микроорганизмов, в том числе и от вирусной инфекции (Соловых, 2013).
Одним из самых дорогостоящих компонентов питательной среды является агар-агар -продукт (смесь полисахаридов агарозы и агаропектина), получаемый путем экстрагирования из красных и бурых водорослей и образующий в водных растворах плотный студень. Известно, что в зависимости от марки применяемого агар-агара эффективность размножения в условиях in vitro может существенно различаться (Pierik, 1987).
Цель исследования: изучить влияние различных марок агар-агара на морфобиологические показатели растений малины в культуре in vitro.
Материалы и методы
Работа проводилась в научно-образовательном центре биотехнологии Брянской государственной сельскохозяйственной академии.
Объектом исследования являлся сорт ремонтантной малины Оранжевое чудо селекции Кокинского опорного пункта ВСТИСП.
Питательные среды готовились на основе минеральной части сред Мурасиге-Скуга (МС) (Murashige & Skoog, 1962).
Изучали следующие марки агаров: 1) BactoTM Agar Becton Dickinson (USA); 2) агар-агар SERVA KOBE I (Германия); 3) Panreac Agar-agar american type QP, (Испания); 4) Агар микробиологический, ГОСТ 7206-96, сорт первый, ОАО НПК «БИНОМ-ЦЕНТР», «Корсаков-ский агаровый завод».
Культивирование микрочеренков осуществляли в банках объемом 0,5 л, которые закрывали пищевой пленкой в два слоя для сохранения стерильности и уменьшения испарения воды. На этапе пролиферации с среду вводили 6-БАП в концентрации 1 мг/л. На этапе элонгации применяли безгормональную среду МС, разбавленную в два раза и обогащенную витаминно-минеральным комплексом «Компливит».
Результаты и их обсуждение
В культуре изолированных тканей и органов для получения плотных питательных сред агар добавляют в конечной концентрации от 1,5 до 3%, полужидких - 0,3-0,7% (вес/объем).
Консистенция среды является важным фактором, влияющим на процессы роста эксплан-тов и образование адвентивных почек. Известно, что при культивировании растений верхушки побегов в жидких питательных средах на аппаратах роллерного типа значительно стимулируются рост побегов, не наблюдается ярко выраженного апикального доминирования побегов, сокращается период выращивания и количество пересадок, что обусловливается хорошим снабжением растений питательными веществами. С другой стороны, в этих условиях возрастает возможность образования аномальных витрифицированных побегов. Использование твердых агаризованных сред способствует преодолению витрификации, но вместе с тем этот способ выращивания ухудшает условия питания эксплантов и препятствует удалению продуктов метаболизма (Шевелуха, 1998).
В нашей работе при клональном микроразмножении малины было отмечено, что качество используемого агара может существенно влиять на рост и развитие растений in vitro. Так среди отрицательных эффектов может наблюдаться искривление побегов, образование мелких и скрученных листьев, явление витрификации (гипероводненности).
При испытании различных марок агара мы обнаружили различные желирующие свойства у каждого типа. По литературным данным, для культивирования растений малины применяют концентрацию агар-агара - 0,7% (Высоцкий, 1984, Туровская, Стрыгина, 1990). При использовании таких концентраций на разных марках агара мы не всегда получали положительный результат: в одних случаях среда была полужидкой, в других - сильно плотной, что затрудняло культивирование растений. В идеальном варианте микрочеренок должен без усилий погружаться в питательную среду и в то же время постоянно оставаться на поверхности среды в процессе культивирования.
Эмпирическим путем нами были подобраны оптимальные концентрации используемых в настоящее время марок агар-агара, которые бы соответствовали вышеназванным требованиям (табл.).
Таблица
Оптимальная концентрация испытанных марок агара
№ п.п. Марка агар-агара (производитель) Оптимальная концентрация, %
1 Bacto agar (США) 0,76
2 Serva (Г ермания) 0,66
3 Panreac (Испания) 0,70
4 Агар бактериологический (РФ) 0,68
При концентрации 0,7% удовлетворительными свойствами характеризовался лишь испанский агар Panreac, тогда как Bacto agar затвердевал при более высокой концентрации -
0,76%. Отечественный бактериологический агар и немецкий агар Serva наоборот обладали оптимальными свойствами в меньших концентрациях - 0,68% и 0,66% соответственно.
При оценке влияния четырех марок агар-агара на культивируемые растения малины было обнаружено влияние каждого из них на коэффициент размножения и высоту образовавшихся побегов (рис.).
8 7 6 5 4 3 2 1
0
12 3 4
■ Высота растений, мм ■ Коэффициент размножения
Рис. Влияние марки агар-агара на коэффициент размножения и высоту растений малины.
1 - Агар бактериологический РФ; 2 - Panreac (Испания); 3 - Bacto agar (США), 4 - Serva (Г ермания).
Лучшими морфобиологическими показателями отличались растения малины, культивируемые на питательных средах, желируемых испанским агаром фирмы Panreac. В этом варианте побеги достигали максимальных размеров (7,5 мм) и наибольшего коэффициента размножения (6,1). Хорошие результаты были получены и при использовании американского агара Bacto: высота растений достигала 7,3 мм, а коэффициент размножения 5,1. Тогда как отечественный бактериологический агар и агар фирмы Serva уступали двум вышеназванным маркам агара.
Кроме отличий по двум учитываемым параметрам, растения малины имели и другие качественные отклонения. В лучшем варианте, с использованием испанского агара Panreac растения
имели очень мелкие листья и разветвленные верхушки побегов. Аналогичные морфологические признаки отмечались также у растений, культивируемых на отечественном агар-агаре.
Предположительно такие отличия по вариантам могут быть связаны с разной степенью очистки агар-агара. Известно, что, кроме желирующих компонентов, препарат может содержать соли тяжелых металлов, которые могут влиять на эффективность культивирования растительных тканей.
В некоторых методиках авторы рекомендуют тщательно промывать агар перед использованием. Такая процедура, по их мнению, улучшает свойства агара, делая его менее токсичным для растений. В нашей лаборатории имеется практика промывки дешевых марок агара. Суть технологии сводится к следующему: сосуд с порошком агара заполняли дистиллированной водой и оставляли на несколько часов, в течение которых загустевший раствор периодически перемешивали. Затем вода аккуратно сливалась, а сосуд заполнялся свежей. Процедуру повторяли несколько раз. Оставшийся осадок высушивали до воздушно-сухого состояния. Промытый агар с успехом использовали для индукции адвентивного органогенеза у листовых эксплантов малины. Частота регенерации у малины достигала 80%.
Зачастую на показатель приживаемости высаженных растений влияет генотипические особенности культуры, которые могут проявляться еще при выращивании in vitro. Многие исследователи отмечают о разной способности сортов к образованию дополнительных побегов, силе роста и интенсивности корнеобразования при клональном микроразмножении. Не вызывает сомнения тот факт, что лучшими ростовыми показателями после высадки в нестерильные условия будут отличаться генотипы, имеющие высокие, хорошо облиственные побеги, а также достаточно развитую корневую систему. Поэтому главным требованием на последнем этапе культивирования in vitro, должно быть получение качественных растений малины, готовых быстро перенести стресс при их адаптации к нестерильным условиям. Для удовлетворения таких требований в нашей лаборатории отработанны методы, позволяющие получать качественный материал in vitro, готовый к высадке в субстрат. Основные оптимизированные моменты технологии можно резюмировать следующим образом:
1) исключается этап укоренения микрорастений in vitro;
2) вводится этап элонгации побегов для получения более крупного материала. Растения культивируют на разбавленной вдвое безгормональной питательной среде МС с витаминноминеральным комплексом «Компливит»;
3) индукцию укоренения осуществляют в нестерильном субстрате ауксинсодержащим препаратом «Корневин» (д.в. индолилмасляная кислота).
Для оценки влияния различных типов агара на растения малины на этапе элонгации культивирование осуществляли в банках объемом 0,5л. В таком объемном сосуде более естественно проявлялись морфобиологические признаки растений малины в сравнении с культивируемыми в химических пробирках, что давало возможность более корректно оценить качественное влияние изучаемого фактора.
Изучение совместного действия на культивируемые растения малины in vitro оказывали как марка используемого агар-агара, так и наличие в питательной среде витаминноминерального комплекса «Компливит».
Анализируя полученные данные, можно отметить, что наличие «Компливита» во всех вариантах стимулировало вытягивание растений малины на безгормональной среде. Лучшие результаты по этому показателю были получены при желировании среды агарами марок Bacto и Panreac, несколько уступал агар, произведенный фирмой Serva.
При оценке различных марок агара без присутствия витаминно-минеральной добавки можно заключить, что по высоте культивируемых растений они не имеют существенных отличий.
Выводы
1. При приготовлении питательных сред использовать марки агара Bacto agar (США), Panreac, Serva (Германия), агар бактериологический (РФ) в следующих концентрациях
0,76%; 0,66%; 0,70%; 0,68% соответственно. Для клонального микроразмножения малины предпочтение должно отдаваться агарам типа Bacto agar (США) и Serva (Германия).
2. Показано преимущество агара Panreac и Bacto agar на этапе собственно размножения.
3. Продемонстрировано преимущество Bacto agar при использовании его на этапе элонгации побегов.
Список литературы
Высоцкий В.А. Усовершенствование способов получения растений малины из изолированных меристематиче-ских верхушек // Ягодоводство в Нечерноземье, 1984. C. 3-8.
Казаков И.В., Евдокименко С.Н. Малина ремонтантная. ГНУ ВСТИСП. М., 2007. 288 с.
Соловых Н.В. Эффективность использования различных цитокининов для клонального размножения in vitro растений рода Rubus // Плодоводство и ягодоводство России, 2013. Т. 37, № 1. С. 316-321.
Туровская Н.И., Стрыгина О.В. Микроклональное размножение малины // Садоводство и виноградарство. 1990. № 8. С. 26-29.
Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Дягтерев С.В. и др. Сельскохозяйственная биотехнология М.: Высшая школа, 1998. С. 416.
Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. 1962. Vol. 15, №. 13. P. 473-497.
Pierik R.L.M. In vitro culture of higher plants. Martinus Nijhoff, 1987. 344 p.
Сведения об авторах
Skovorodnikov Dmitry Nikolaevich
Ph.D. in Agricultural science, Ass. Professor of the Department of Chemistry, Biotechnology and Physiology ofplants Bryansk State Agriculture Academy, Kokino E-mail: skovorodnikov_d@mail.ru
Milekhina Natalia Vitalievna
Ph.D. in Agricultural science, Ass. Professor of the Department of Chemistry, Biotechnology and Physiology ofplants Bryansk State Agriculture Academy, Kokino E-mail: skovorodnikov_d@mail.ru
Skovorodnikova Natalia Alexeevna
Ph.D. in Agricultural science, Ass. Professor of the Department of Ecology and Rational nature management Bryansk State University, Bryansk E-mail: skovorodnikova_n@mail.ru
e-mail: skovorodnikova_n@mail.ru
Сковородников Дмитрий Николаевич
к.с.-х н., доцент кафедры химии, биотехнологии и физиологии растений ФГБОУВПО «Брянская государственная сельскохозяйственная академия», Кокино E-mail: skovorodnikov_d@mail.ru
Милехина Наталья Витальевна
к.с.-х н., доцент кафедры химии, биотехнологии и физиологии растений ФГБОУ ВПО «Брянская государственная сельскохозяйственная академия», Кокино E-mail: skovorodnikov_d@mail.ru
Сковородникова Наталья Алексеевна
к.с.-х н., доцент кафедры экологии
и рационального природопользования
ФГБОУ ВПО «Брянский государственный университет
им. акад. И.Г. Петровского», Брянск
