CC BY
26
ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.821
ВЛИЯНИЕ МАЛЫХ ДОЗ ПОЛИДАИА НА УСЛОВНЫЙ РЕФЛЕКС ПАССИВНОГО ИЗБЕГАНИЯ (КАК МОДЕЛИ ПАМЯТИ) У КРЫС
Н.А. Тушмалова, |Л.Л. Прагина|, Е.Л. Мальцева, Е.Б. Воеводина, Е.Б. Бурлакова
(кафедра высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ, Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН; e-mail: evoevodina@web.de)
В результате многолетнего изучения молекулярных механизмов памяти у эукариот, отличных по морфологии нервной системы на уровне аро-морфозов, была выявлена фундаментальная закономерность — универсальность изменений, отражающих формирование процессов памяти (Тушмалова, 1990а, б).
Полученные факты позволили сформулировать гипотезу о механизмах влияния различных психотропных средств, оптимизирующих память (Тушмалова, 1994). Ее суть заключается в том, что регулирующее влияние на память препаратов различной природы, включая биологически активные соединения, обусловлено их действием на белко-во-нуклеиновый синтез — отражение модификации в геноме. При этом подчеркивается, что достижение конечного "адресата" — генетического аппарата клетки — зависит от роли индивидуальных особенностей исследуемых веществ в клеточном метаболизме. В связи с актуальностью защиты психики человека от неблагоприятных антропогенных воздействий и возможной минимизации влияния синтетических химических соединений основное внимание было сосредоточено на анализе мнемо-тропных свойств биологически активных соединений природного происхождения. В качестве общепринятой экспериментальной модели памяти была использована реакция пассивного избегания электроболевого раздражения в одном сочетании (условный рефлекс пассивного избегания) у крыс. Показано, что полидан в дозе 110 мг/кг оптимизирует процессы памяти у крыс (Тушмалова и др., 1999).
Цель данного исследования — продолжение экспериментов по изучению мнемотропных свойств полидана (в сверхмалых дозах).
Методика
Опыты проводились на 56 беспородных и линии Вистар крысах-самцах весом 180—200 г. Животные содержались при естественном освещении и комнатной температуре в пластиковых клетках по 7 крыс в каждой. В работе использовали фирменный препарат полидан, представляющий собой
1,5%-й раствор спермата натрия. С учетом молекулярного веса (пик — 400 000 дальтон) это составляет 3,75 • 10-5 М.
Схема разведений препарата была следующей: 100 мкл фирменного раствора полидана, отобранного шприцем фирмы "Gamilton", разводили в 10 раз 0,1%-м раствором NaCl до 1 мл и получали концентрацию 3,75 • 10-6 М. Затем 100 мкл раствора также разводили в 10 раз до 1 мл и получали 3,75 • 10-7 М. Последующие концентрации 3,75 • 10-8 М; 3,75 • 10-9 М; 3,75 • 10-10 М; 3,75 • 10-11 М; 3,75 • 10-12 М; 3,75 • 10-13 М; 3,75 • • 10-14 М были получены так называемым методом "последовательного разведения" 0,1%-м раствором NaCl с "шагом" концентраций 10-1 М. Каждая из приготовленных концентраций препарата подвергалась 3-минутному перемешиванию на специализированной установке "Vortex", модель Pa-solina NS-80.
В опытах с однократным введением препарата животным (крысам) использовали три исходные концентрации: 3,75 • 10-10 М; 3,75 • 10-12 М; 3,75 • 10-14 М, соответственно в организме эти концентрации, как принято считать (Бурлакова и др., 1990), понижаются на два порядка: 10-10 М до 10-12 М, что соответствует 10-7 мг/кг, 10-12 М до 10-14 М (10-9 мг/кг), 10-14 М до 10-16 М (10-11 мг/кг). Следует отметить, что граница сверхмалых доз (СМД) биологически активных веществ лежит ниже области 10-11—10-12 М (или при введении in vivo 10-6—10-7 мг/кг) (Бурлакова и др., 1990; Духович и др., 1999). Таким образом, использованные в наших экспериментах три концентрации лежат в области СМД.
Было проведено 2 серии опытов: однократное внутрибрюшинное введение препарата в дозах 10-10 мг/кг, 10-12 мг/кг и 10-14 мг/кг и уточняющий эксперимент с дозой 10-14 мг/кг. В опытах по каждой дозе было 14 крыс (7 — опытных, 7 — контрольных). Контрольным животным вводили внутрибрюшинно физиологический раствор в том же объеме, что и опытный препарат.
Моделью памяти служили оборонительные рефлексы пассивного избегания (УРПИ). Эксперимен-
ты проводились в камере, разделенной перегородкой с отверстием. Одна половина камеры быта темная, а другая освещена лампой (100 Вт). Животное помещалось в светлую половину камеры. Крысы — сумеречные животные, поэтому они уходят из освещенной части камеры в темную. Как только животное заходило в темную часть камеры, оно получало удар током 0,8 миллиампер (через сетку металлического пола) и выбегало в светлую часть камеры. Время входа в темную часть камеры и выхода из нее фиксировалось. Так животные обучались. Через 24 ч крысы помещались в светлый отсек камеры, измерялось время, в течение которого они не заходили в "опасную" часть камеры. Особое внимание обращалось на количество заглядываний животных (реакция напоминания) в "опасную" часть камеры. Эти реакции служили поведенческим показателем прочности памятного следа. Эффект препарата проверялся через 24 ч, 3 сут, 5 сут, 14 сут и 21 сут (отдаленное влияние).
Применение общепринятых статистических методов анализа (различных вариаций однофакторного дисперсионного анализа) экспериментальных данных эффекта не выявило. Для более детального анализа влияния препарата на память нами был ранее специально разработан новый прием количественной оценки глубины памятного следа. Этот метод получил наименование "коэффициент консолидации памятного следа" и быи успешно апробирован для оценки влияния пантогама и алоксано-вого диабета на условно-рефлекторную память крыс. Детально этот методический прием, выраженный математической формулой, описан нами ранее (Пра-гина и др., 2004).
Вводятся функции, характеризующие поведение 1-й крысы в Т-тестировании.
Обозначим через N множество крыс в опытной группе, через N — множество крыс в контрольной группе;
I — тестирование через 24 ч.;
II — тестирование через 3 сут (отдаленный эффект);
III — тестирование через 5 сут (отдаленный Т = \ эффект);
IV — тестирование через 14 сут (отдаленный эффект);
V — тестирование через 21 сут (отдаленный эффект).
О = (^(Т) ■ Х1(Т))/180]/|^|;
К = (1 - У1(Т)) ■ ЗД]/^ (1 - У^Т));
Б = [Х1е^(1-У1(Т))]/|^|;
где } = {о — опыт; к — контроль}.
Х1(Т) = 1 (сек) — время, затраченное 1-й крысой на пребывание в светлой части камеры в Т-тес-тировании; = п — количество реакций напо-
минания (п = 0, 1, 2, 3, ...) 1-й крысы в Т-тес-
тировании; У1(Т) = {1 — если 1-я крыса вошла в темную часть камеры в Т-тестировании, 0 — если не вошла}. N — количество крыс в _|-й группе, где } = {о — опыт; к — контроль}. В^Т) — обозначает наличие реакций напоминания (= 1) или отсутствие таковыгх (= 0).
О-коэффициент показывает значимость загля-дываний в темную часть камеры как факта ситуативного напоминания об ударе током для всей группы в целом. Коэффициент О выражает значимость заглядывания в темную часть камеры для напоминания об опасности захода в нее (безусловное подкрепление — электрический ток).
К-коэффициент показывает долю крыс, заглядывавших в темную часть камеры и не вошедших в нее, среди всех, не вошедших туда.
Б-коэффициент показывает процент крыс (Б*100%), "помнящих" электрическое воздействие, полученное в затемненном отсеке клетки.
Значения коэффициентов определяются для каждой конкретной группы крыс.
Результаты
Анализ данных выявил неоднозначное влияние на условно-рефлекторную память крыс при однократном введении полидана. Критерием эффекта препарата служило время незахода (латентный период) в темную (оборонительную) часть камеры и количество так называемых незавершенных реакций (заглядывание в "оборонительный" отсек).
Влияние однократного введения полидана на УРПИ крыс. После обработки первичных данных по специальной формуле (см. методику) оценивали результат влияния препарата. Использование метода, позволяющего в цифровом выражении характеризовать степень прочности (консолидации) памяти, продемонстрировало значительные отличия прочности памятного следа опытных крыс от контрольной группы (табл. 1).
Как видно из табл. 1, эффект при дозе 10-10 М через 24 ч в 7,61 раза больше, чем в контроле; через 3 сут — в 5,28 раза; через 5 сут — в 22,9 раза; через 14 сут — в 2,5 раза. К 21-м сут эффект исчезает.
При дозе 10-12 М значительный эффект отмечен на 5-е сут (в 8,8 раза) и незначительный — на 14-е сут (в 2,08 раза).
При дозе незначительный эффект на-
блюдается через 24 ч (в 1,43 раза) и на 3-и сут (в 2,33 раза).
Таким образом, наиболее эффективной выглядит доза 10-10 М.
Разница в величине коэффициента О опытной и контрольной групп была отмечена не только спустя 24 ч после обучения, но и при анализе в динамике отдаленного влияния (через 3, 5 и 14 сут после формирования памятного следа).
Таблица 1
Влияние малых доз полидаиа на степень консолидации памятного следа при однократном введении (О-коэффициент, показывающий значимость заглядываний в темную часть камеры)
Концентрация полидана Длительность влияния (отн. ед.)
24 ч 3 сут 5 сут 14 сут 21 сут
К. Оп. Эфф. К. Оп. Эфф. К. Оп. Эфф. К. Оп. Эфф. К. Оп. Эфф.
10-10 М 0,60 4,57 7,61 0,52 2,75 5,28 0,10 2,2 9 22,90 0,36 0,90 2,50 0,71 0,33 0,46
10-12 М 0,60 100% - 0,52 0,57 1,10 0,10 0,88 8,80 0,36 0,75 2,08 0,71 0,99 1,40
10-14 М 0,60 0,86 1,43 0,52 1,21 2,33 0,10 0,05 0,50 0,36 0,03 0,08 0,71 0,83 1,17
Примечание. Эффект определяется при делении значения О-коэффициента для опытной группы на значение О-коэффициента для контрольной группы.
Через 3 недели эта разница была значительно менее выражена.
Динамика отличий (число раз) степени консолидации памятного следа (коэффициент О) между влияниями использованных малых концентраций полидана представлена в табл. 2 (значение коэффициента О для первой концентрации делили на значение коэффициента О для второй концентрации).
Таблица 2
Динамика отличий (в число раз) степени консолидации памятного следа (коэффициент О) между влиянием использованных малых концентраций полидана при однократном введении
Концентрация полидана Длительность эффекта (отн. ед.)
24 ч 3 сут 5 сут 14 сут
10-10 М и 10-12 М - 4,8 2,6 1,2
10-10 М и 10-14 М 5,3 2,27 45,8 30
10-12 М и 10-14 М - 0,47 17,6 25
Как видно из табл. 2, доза 10-10 М более действенна при отдаленном эффекте: через 24 ч в 5,3 раза эффективней дозы через 3 сут
в 4,8 раза эффективней дозы 10-12 М и в 2,27 раза эффективней дозы на 5-е сут в 2,6 раза
эффективней дозы в 45,8 раза эффек-
тивней дозы 10-14 М; на 14-е сут доза 10-10 М в 30 раз эффективней дозы
Следует подчеркнуть, что хотя традиционные методы статистической обработки и не обнаружили статистически значимых отличий опыта от контроля, но выявили разницу в величине влияния полидана на латентные периоды незаходов в темную часть камеры при всех использованных дозах полидана.
Влияние пятикратного введения полидана на УРПИ крыс. При пятикратном внутрибрюшинном введении полидана в дозах 75 мг/кг и 100 мг/кг проводилось морфологическое исследование мозга
(гиппокамп и кора) и было обнаружено истощение нейронов и их ультраструктур. При пятикратном введении малых доз мы не получили значимых отличий от контроля.
Использование коэффициента консолидации памятного следа позволило выявить эффект влияния малых концентраций полидана на условно-рефлекторную память крыс, что не удалось сделать стандартными методами математической статистики (различными вариациями однофакторного дисперсионного анализа). В то же время, выявленные закономерности подтвердили адекватность выбора поведенческих реакций крыс для анализа влияния препарата на память: значимость заглядывания в темную часть камеры для напоминания об опасности захода в нее; долю крыс, заглядывавших в темную часть камеры и не вошедших в нее, среди всех, не вошедших туда; процент крыс, "помнящих" электрическое воздействие, полученное в затемненном отсеке экспериментальной камеры.
Заключение
В настоящее время появляется все большее число фактов, свидетельствующих об активности малых и сверхмалых (СМД) доз различных воздействий. Однако механизм действия этого природного феномена окончательно не изучен. Четко отмечено принципиальное подобие свойств СМД для самых разных биологических систем и воздействий на них (Бурлакова и др., 1990). Возникновение в эволюции феномена СМД мы рассматриваем как универсальный механизм защиты Природы от "лишних" энергетических затрат, что выражается в возможности адекватно реагировать на воздействия как можно оперативнее, еще на стадии СМД (Тушмалова, 1999). В эволюции феномен чувствительности живых систем к действию СМД возник уже у донервных простейших (Тушмалова и др., 1998). Одно из предположений о механизмах реализации эффекта СМД состоит в возможности встречи единичных молекул с отдельными клетками и мишенями (Ашмарин и др., 1992; Лелико-
ва и др., 1992; Бурлакова и др., 1990). В качестве мишеней СМД рассматривает различные мишени: ферменты, ДНК, т.е. возможно попадание отдельных молекул в составе СМД не только через рецепторы, но и через менее специфические каналы.
Все сказанное применимо и к объяснению эффекта полидана.
Практически все исследователи эффектов СМД действия различных факторов отмечают вариабельность ответов на однотипные действия и как следствие плохое воспроизведение результатов (Подкол-зин, Гуревич, 2002).
В этой связи необходимо специально подчеркнуть значение разработанного приема цифровой оценки результатов изучения влияния различных фармакологических препаратов и соединений на основные критерии свойств приобретенной памяти. Несмотря на то что стандартные методы статистической обработки (STADIA, дисперсионный од-
нофакторный анализ) не выявили эффекта использованных доз, в результате использования разработанного нами приема был выявлен эффект действия СМД полидана на памятный след крыс.
Итак, можно сделать вывод, что следствием специфических свойств СМД служит то, что общепринятые методы статистической обработки не всегда могут выявить реально отмеченный эффект.
В заключение подчеркнем, что результаты проведенных экспериментов с использованием СМД полидана в сочетании с оригинальным способом обработки данных представляют интерес для дальнейших исследований уже с использованием нано-технологии.
Авторы выражают благодарность аспиранткам кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ В.С. Каптарь и О.В. Курской за помощь в проведении экспериментов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Аляутдин Р.И., Кройтер Й., Харке-вич Д.А. 2003. Доставка лекарственных препаратов в мозг с помощью наночастиц // Журн. эксперимент. и клинич. фармакология. 66. № 2. 65—68.
Ашмарин И.П., Лелекова Т.В., Сан-жи е в а Л . Ц . 1992. Об эффективности ультрамалых доз и концентраций биологических соединений // Изв. РАН. Сер. биол. № 4. 531—536.
Бурлакова Е.Б. 1999. Особенности действия сверхмалых доз биологически активных веществ и физических факторов низкой интенсивности // Рос. хим. журн. 28. № 5. 3—11.
Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Худяков И. В. 1990. Воздействие химических агентов в сверхмалых дозах на биологические объекты // Изв. АН СССР. Сер. биол. № 2. 184—194.
Духович Ф.С., Горбатова Е.Н., Куроч-кин В.К., Петрунин В.А. 1999. Количественный подход к определению "сверхмалые дозы лекарственных веществ и ядов" // Рос. хим. журн. 28. № 5. 12—15.
Леликова Т.В., Ашмарин И.П., Александров П.Н., Зажирей В.Д., К о з и -нец И.А., Ритума И.Р., Рыбакина Е.Г., Санжиева Л.Ц., Чипенс Г.И. 1992. Действие некоторых пептидов-иммуномодуляторов на сократительную активность мезентериальных лимфатических сосудов крысы // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 3. 14—18.
Подколзин А.А., Гуревич К.Г. 2002. Действие биологически активных веществ в малых дозах. М. С. 170.
Прагина Л.Л., Тушмалова Н.А., Цел-кова Н.В., Воеводина Е.Б. 2004. Форми-
рование и сохранение условного рефлекса пассивного избегания у крыс под влиянием пантогама: отдаленный эффект // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 2. 3-6.
Прагина Л.Л., Тушмалова Н.А., Цел-кова Н.В., Воеводина Е.Б. 2004. Влияние ал-локсановой гипергликемии на поведение крыс и на условный рефлекс пассивного избегания // Тез. докл. XI Рос. нац. конгресса "Человек и лекарство". 19—23 апреля, Москва.
Тушмалова Н.А. 1990а. О новой мнемофунк-ции ДНК мозга (дальнейшее развитие гипотезы) // Мозг и поведение. М. С. 169—178.
Тушмалова Н.А. 19906. Современные представления о макромолекулярных механизмах памяти // Исследования памяти / Под ред. Н.Н. Корж. М. С. 137—146.
Тушмалова Н.А. 1994. Общебиологическая гипотеза механизмов влияния различных психотропных средств, оптимизирующих память // Журн. высш. нервн. деят. № 4. Вып. 1. 3—8.
Тушмалова Н.А., Бурлакова Е.Б., Лебедева Н.Е. Головкина Т.В. 1998. Поведение донервных организмов — индикатор эффекта сверхмалых доз // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 4. 24—25.
Тушмалова Н.А., Прагина Л.Л., Иноземцев А.Н., Асафов А.В. 1999. Улучшение выработки и воспроизведения условного рефлекса пассивного избегания под действием деривата ДНК (поли-дан) // Журн. высш. нервн. деят. 49. Вып. 5. 777—780.
Тушмалова Н.А. 1999. О биологическом значении сверхмалых доз // Междунар. мед. журн. № 9.10.
Поступила в редакцию 15.11.07
INFLUENCE OF THE POLIDANE SMALL DOSES ON THE CONDITIONED PASSIVE AVOIDANCE REFLEX (AS A MEMORY MODEL) IN RAT
N.A. Tushmalova, L.L. Pragina, E.L. Malceva, E.B. Voevodina, E.B. Burlakova
This paper presents the results of the research how RNA-comprising biologically active compound "palidane" influences on the rat conditioned reflex memory. As a memory model was used conditioned passive avoidance reflex. Thew polidane dose 10-10 M positively influences on the memory.
4 BMY, SncraorHa, № 4
