CC BY
160
УДК 612.017.2:57.083
ВЛИЯНИЕ МАЛЫХ ДОЗ МИКРООРГАНИЗМОВ BACILLUS SP. НА ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ
АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ
Л.Ф. КАЛЁНОВА, А.М. СУББОТИН, М.А. НОВИКОВА, А.С. БАЖИН
Тюменский научный центр СО РАН, ул. Малыгина, 86, Тюмень, Россия, 625026, e-mail: [email protected]
Аннотация. В эксперименте на мышах F1 CBA/Black-6 установлено, что однократное введение микроорганизмов штамма М3 Bacillus sp., выделенных из проб многолетних мерзлых пород, оказывает влияние на морфофункциональную активность иммунной системы на разных уровнях ее организации - от костномозгового кроветворения до эффекторной стадии формирования иммунного ответа. Данный эффект сохраняется более 21 суток после введения 5-103 микробных клеток на животное. Установлена последовательность изменения структурно-функциональных параметров иммунной системы: снижение активности дифференцировки миелоидных и лимфоидных предшественников в костном мозге - снижение притока лимфоидных предшественников в тимус - сохранение повышенной активности дифференцировки Т-лимфоцитов в тимусе - сохранение на повышенном уровне функциональной активности Т- и В-лимфоцитов. На клетках костного мозга мышей отмечено повышение экспрессии рецепторов CD34+CD117+ и CD25+CD44+ и уровня лимфоцитов среди всей популяции гемопоэтических клеток. На лимфоцитах тимуса повышена экспрессия CD25+TCR+ мах и CD44+TCR+. Повышена функциональная активность гуморального (по уровню антителообразующих клеток в селезенке) и клеточного (в реакции гиперчувствительности замедленного типа) иммунитета. Полученные данные могут свидетельствовать о возможности регуляции малыми дозами бактерий Bacillus sp. механизмов с про- и противовоспалительной направленностью иммунного ответа и сдвиге баланса в сторону активации механизмов с противовоспалительной активностью. Обсуждаются возможные механизмы выявленных эффектов.
Ключевые слова: микроорганизмы мерзлоты, дифференцировка лимфоцитов, иммунитет.
EFFECTS OF LOW DOSES OF MICROORGANISMS BACILLUS SP. ON DIFFERENTIATION AND FUNCTIONAL ACTIVITY OF THE
LYMPHOCYTES
L.F. KALENOVA, A.M. SUBBOTIN, M.A. NOVIKOVA, A.S. BAZHIN
Tyumen Scientific Center of the Russian Academy of Sciences, 625026, Russia, Tyumen, ul. Malygina, 86, e-mail: [email protected]
Abstract. In theexperiment on mice F1 CBA/Black-6 it found that a single dose of microorganisms M3 strain Bacillus sp., isolated from samples of perennial permafrost species has effect on morphofunctional activity of the immune system at different levels - from bone marrow blood to stage an immune effector response. This effect persists for more than 21 days after the introduction of 5 • 103 bacterial cells per animal. The sequence of changes in the structural and functional parameters of the immune system is determined, i.e. reduce of activity of differentiation of myeloid and lymphoid precursors in the bone marrow - reduce of inflow of lymphoid progenitors in the thymus - preservation of high activity differentiation of T-cells in the thymus - saving at a higher level of functional activity of T-and B-lymphocytes. On bone marrow cells of mice was an increase in expression of receptors CD34+CD117+ and CD25+CD44 + cells and the level of among the entire population of hematopoietic cells. On the lymphocytes of the thymus increased expression of CD25+ TCR+ max and CD44+TCR+. Increased functional activity of humoral (the ability to produce antibodies spleen lymphocytes) and cellular (by delayed-type hypersensitivity reactions) immunity. These data allow to indicate the possibility of regulation by small doses of bacteria Bacillus sp. mechanisms of pro-and anti-inflammatory immune response and directivity shift the balance towards activation mechanisms with anti-inflammatory activity. Possible mechanisms of the identified effects are discussed.
Key words: permafrostmicroorganisms, differentiation of lymphocytes,immune system.
Повышение качества и продолжительности жизни зависит не только от социальных программ и национальных проектов, но и от состояния среды обитания [1]. Разработанный как компонент стратегической безопасности в России Системный экологический мониторинг предусматривает установление причинно-следственных связей между внешними воздействиями, здоровьем и качеством жизни людей; прогнозирование неблагоприятных явлений и процессов; предупреждение, минимизацию или ликвидацию негативных природных и техногенных воздействий. В перспективе - поиск новых подходов к лечению заболеваний, восстановление «здравоохранительной» стратегии вместо «лечебной» [1]. В последнее десятилетие получило свое развитие новое научное направление - геомедицина, одной из задач которой является поиск средств адаптации человека к современным условиям, связанным с вариациями погоды и климата, загрязнением окружающей среды, длительными полетами и погружениями и т.д. [6].
Важной структурной компонентой биосферы являются микроорганизмы [13]. Сам принцип участия микроорганизмов в поддержании адаптационного потенциала других организмов известен. При этом функцию защиты организма от чужеродных антигенов и сохранения здоровья обеспечивает иммунная система. Для сохранения жизни в условиях «многополярности» окружающего микромира иммунная система выработала многочисленные специфические и неспецифические механизмы. На инфицирование патогенными микроорганизмами развивается естественный иммунный ответ с формированием клеток иммунологической памяти. Результатом этих реакций является ликвидация инфекта и восстановление нарушенного здоровья [2,13]. Данный механизм является затратным и приводит к потере части материи и энергии у макроорганизма. На вакцинные штаммы микроорганизмов развивается искусственный иммунный ответ с формированием клеток иммунологической памяти. Результатом этих реакций является повышение
устойчивости к данному виду микроорганизмов или формирование специфической толерантности [2]. Этот механизм является более экономичным и в значительной степени способствует сохранению структуры и энергии.
Наиболее адекватными мерами для восстановления «здравоохранительной» стратегии и построения эффективной системы адаптации к широкому спектру внешних воздействий могут служить микроорганизмы-пробиотики. Микроорганизмы-пробиотики активируют преимущественно неспецифические реакции в макроорганизме, которые заключаются в повышении резистентности к инфекциям и неблагоприятным факторам внешней среды. Хотя большинство бактерий, обладающих пробиотическими свойствами, являются представителями семейств Lactobacillus и Bifidobacterium, все чаще в таком качестве стали использоваться сапрофитные бактерии, в особенности из рода Bacillus [3,10,11,16]. Бактерии рода Bacillus это грампо-ложительные аэробные спорообразующие микроорганизмы, имеющие форму палочек [16], широко распространены в биосфере, включая воздушный бассейн, почвенный покров, моря и океаны, внутренние водоемы материков и криогенные среды. Это наиболее древние микроорганизмы, с которыми на протяжении всей истории своего существования сталкивался человек. Неудивительно, что при таком широком распространении микроорганизмы рода Bacillus могут оказывать выраженное влияние на жизнедеятельность организмов растительного и животного происхождения [3,9,10,11,16]. В настоящее время активно изучаются возможности их использования в медицине и ветеринарии в качестве пробиотиков и только российскими учеными заявлены около 20 наименований препаратов на основе представителей рода Bacillus [3]. В качестве примера медицинского использования можно привести лекарственный препарат «Бактисубтил» (Франция), действующим началом которого является B. cereus JP 5832. Установлена способность отдельных штаммов Bacillus, входящих в состав пробиотиков, оказывать иммуностимулирующее воздействие при пероральном и парентеральном введении в дозах 106 и 109 инактивированных микробных клеток на мышь [10].
Ранее нами было установлено, что один штамм микроорганизмов (Bacillus sp.), выделенный из проб вечной мерзлоты Центральной Якутии, при парентеральном введении живых бацилл способен оказывать позитивное влияние на качество и продолжительность жизни животных [15]. Изучение эффекта дозозависимости (2,5• 103-1 • 109 микробных клеток/мышь) показало, что минимальные дозы бактерий Bacillus sp. (2,5-103-20-103 микробных клеток) способны значимо повышать функциональную активность клеточного и гуморального иммунитета [7]. Представляет интерес изучение влияния малых доз микроорганизмов Bacillus sp. на различные этапы функционирования иммунной системы - от костномозгового кроветворения до эффектор-ной стадии иммунного ответа. Актуальность подобного роста исследований ассоциируется с важностью проблемы создания новых препаратов, способных модулировать активность иммунопоэза.
Цель исследования - изучить влияние малых доз микроорганизмов Bacillus sp., выделенных из многолетних мерзлых пород, на дифференцировку лимфоцитов в костном мозге и тимусе и их функциональную активность в эксперименте на лабораторных мышах.
Материалы и методы исследования. В качестве объекта исследования выбран штамм микроорганизмов, выделенных из образцов мерзлых пород с Мамонтовой горы в
Центральной Якутии. Образцы взяты из многолетних мерзлых пород позднего неогена, которая не оттаивала, по всей вероятности, более 3,5 миллионов лет [4]. Штамм идентифицирован как Bacillus sp. (штамм М3) и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетики под регистрационным № В-10130 [5]. Изучение острой
токсичности Bacillus sp. штамм М3 выявило совпадение с результатами исследования бацилл-пробиотиков B.cereus штамма IP5832 из лекарственного препарата «Бактисубтил» [11]. В то же время в биологическом потенциале данных штаммов выявлены определенные различия. В частности установлено, что преинкубация Bacillus sp. штамм M3 и
B.cereus штамм IP5832 в течение 72 часов при температуре -5°С (средняя температура вечной мерзлоты) способствовала снижению острой токсичности у штамма М3 на 34,7% относительно штамма IP5832, а в серии экспериментов по изучению эффекта дозозависимости показано, что малые дозы штамма М3 стимулируют активность клеточного и гуморального иммунитета [7], в то время как данный эффект не выявлен у штамма IP5832. Следует отметить, что температурная регуляция биологических свойств микроорганизмов известна и широко используется, в частности при разработке живых вакцин [8].
Эксперимент проведен на 36 мышах F1 CBA/Black-6, $ массой 20-23 г, которые содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Опытным животным (n=18) ввели штамм М3 однократно внутри-брюшинно в дозе 5000±217 в 100 мкл физиологического раствора (доза с наиболее выраженными реакциями иммунной системы). Бациллы перед введением животным провели через один цикл «замораживание-оттаивание». Концентрацию Bacillus sp. определяли культуральным методом по числу КОЕ в чашках Петри на плотных питательных средах. В связи с выявленными различиями в биологическом потенциале Bacillus sp. и их современными аналогами, контрольным животным (n=18) ввели растворитель - физиологический раствор. Исследование проводили на 21 сутки после введения Bacillus sp. Активность дифференцировки клеток в костном мозге оценивали двумя способами - по мие-лограмме и фенотипу. Для получения миелограммы из одной бедренной кости выделяли костный мозг на обезжиренное предметное стекло в 10 мкл физиологического раствора, мягко пипетировали и делали мазок. Мазки фиксировали этиловым спиртом и окрашивали по Романовско-му-Гимза. Подсчет клеток проводили на 400 клеток и выражали в %. Для иммунофенотипирования костный мозг выделяли из другой бедренной кости в 96-луночные планшеты в 100 мкл фосфатно-солевого буфера рН 7,2, аккуратно пипетировали, осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 1000 об/мин и дважды отмывали раствором Хенкса в том же режиме. Конечную концентрацию клеток доводили до 1406/мл. Жизнеспособность клеток в тесте с трипановым синим составила 94-96%. Фенотипиро-вание клеток проводили методом прямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител, конъюгированными с флюоресцеинизотиоцианатом и фикоэрит-рином (Becton Dickinson Biociencies, USA). Определялись маркеры: CD117 - рецептор для фактора стволовых клеток; CD34 - рецептор адгезии стволовых клеток к строме костного мозга; CD25 - рецептор для ИЛ-2, ответственного за пролиферацию лимфоцитов; CD44 - молекула «хоминга», принимает участие в миграции клеток в лимфоидную ткань; TCRap - Т-клеточный рецептор, экспрессируется на
зрелых регуляторных Т-лимфоцитах (описание дано по «CD-номенклатуре» «Becton Dickinson», США, 2012). Тимус выделяли в 1 мл изотонического раствора (NaCl 0,9%). Суспензию тимоцитов получали при помощи автоматической системы для механической гомогенизации ткани Medimachine (Becton Dickinson, USA). Тимус дезагрегировали в пластиковом контейнере с микролезвиями (Medikon) в течение 30 секунд. Тимоциты переносили из контейнера в пробирку, контейнер промывали 3 раза по 1 мл NaCl 0,9%. Клетки пропускали через фильтр Filcons (Becton Dickinson, USA) с диаметром пор 50 мкм и осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 1500 об/мин. Концентрацию доводили до 1х106 кл/мл. Жизнеспособность тимоцитов в тесте с трипановым синим составила 94-97%. Рецепторный репертуар тимоцитов оценивали с использованием моноклональных антиле против CD34, CD25, CD44 и TCRp, конъюгированных с флюоресцеинизотиоцианатом, фико-эритрином и перидинхлорофилл протеином (Becton Dickinson Biociencies, USA). Анализировали на проточном лазерном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson). Результаты обрабатывали в программе CellQuest. Клеточный состав периферической крови анализировали на гематологическом анализаторе PCE-90Vet (High Technology, USA). У перитонеальных макрофагов, адгезированных на стекле, оценивали две функции - поглотительную (ФП, %) в тесте с инактивированными дрожжевыми клетками и метаболическую в спонтанном варианте НСТ-теста (НСТ, %). Функциональное состояние гуморального иммунитета оценивали методом Cunningham в нашей модификации. Модификация заключалась в подсчете лимфоцитов в гомогенате спленоцитов (гомогенизировали селезенку в стеклянном гомогенизаторе) на гематологическом анализаторе PCE-90Vet (High Technology, USA). Учитывалось число лимфоцитов в селезенке (ЛФс), число антителообразующих клеток в 1х106 ЛФс (АОК/106) и в пересчете на все лимфоциты в селезенке (АОК/сел.). Активность клеточного иммунитета оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) по Crowle.
Все исследования проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Пр. МЗ ССР от 12.08.1977 г. №755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных» от 18.03.1986.
Достоверность различий между группами оценивали по t критерию Стьюдента в программе «SPSS 11,5 for Win-dows».
Результаты и их обсуждение. Влияние Bacillus sp. штамма М3 на дифференцировку клеток в костном мозге. Анализ показателей миелограммы (рис.) свидетельствует о достоверном уменьшении доли недифференцированных бластов (p<0,01), миелобластов (p<0,01) и сегментоядерных нейтрофилов (p<0,01) на фоне повышения уровня лимфоцитов (p<0,01) среди всей популяции гемопоэтических клеток в костном мозге. Эти данные свидетельствуют о модулирующем влиянии малых доз Bacillus sp. на пролиферативную активность ранних предшественников гемопоэза и дифференцировку клеток миелоцитарного и лимфоцитарного ростков кроветворения в костном мозге со сдвигом баланса в сторону лимфопоэза.
Известно, что костный мозг является не только органом кроветворения, а также центральным органом иммунной системы, в котором происходит созревание лимфоидных предшественников из гемопоэтической стволовой клетки (ГСК), начальные этапы созревания В-лимфоцитов, а 7-8%
лимфоидных клеток костного мозга являются предшественниками Т-лимфоцитов [12,14]. Исследование иммунофенотипа клеток костного мозга позволило оценить влияние малой дозы Bacillus sp. на ранние этапы дифференцировки лимфоцитов. При иммунофенотипировании активность дифференцировки клеток в костном мозге оценивалась по экспрессии рецепторов CD117 и CD34 на ранних предшественниках гемопоэтических клеток, маркеров активации CD25 и CD44 на лимфоцитах и антигенспецифических рецепторов TCRap на регуляторных Т-лимфоцитах (табл. 1).
SS лл
**
~ Сі
НєдиФФєрє цировс нньіє Лимфоциты Миєло ласты Сєгмєнто ядЄрнь e
о бЛс сТы ‘. нєитр Ф'іілЬ.
**
-60 - **
**
ии
Рис. Влияние Bacillus sp. на уровни недифференцированных бластов, миелобластов и лимфоцитов в костном мозге. Примечание: достоверность различия между опытной и контрольной группами ** - p<0,01. (Показатели опытной группы представлены в виде процентов отличия от контрольного уровня)
Таблица 1
Фенотип клеток костного мозга (%)
Рецепторы Контроль n=9 Bacillus sp. n=9
CD34-CD117+ 3,62±0,28 4,47±0,35*
CD34+CD117+ 43,79±2,11 37,48±2,10*
CD34+CD117- 7,76±0,87 5,93±0,52*
CD25+CD44- 46,43±1,54 39,42±3,07**
CD25+CD44+ 28,23±1,28 33,24±2,23*
CD25-CD44+ 18,72±1,46 14,91±1,13**
TCRae+ 5,14±0,19 4,57±0,26*
Примечание: достоверность различия между опытной и контрольной группами * - p<0,05; ** -- p<0,01.
В костном мозге под влиянием Bacillus sp. увеличивается численность клеток с фенотипом CD117+CD34' (p<0,05) и CD25+CD44+ (p<0,05) на фоне уменьшения доли клеток с фенотипами CD34+CD117+ (p<0,01), CD34+CD117- (p<0,05), (CD25+CD44-, p<0,05). CD44+CD25- (p<0,05), TCRap+ (p<0,01). На основании полученных данных можно описать влияние Bacillus sp. на дифференцировку гемопоэтических предшественников, в том числе лимфоцитов.
Дифференцировка ранних предшественников гемопоэтиче-ских клеток. К числу CD117+CD34' клеток могут относиться плюрипотентные стволовые кроветворные клетки (СКК), которые еще не экспрессируют на своей мембране CD34 [12,14]. CD117 является рецептором для фактора стволовых клеток (ФСК), который вырабатывается клетками стромы костного и отвечает главным образом за их рост и созревание. К CD34+CD117+ клеткам, одновременно экспрессирующим рецепторы для ФСК и молекулы адгезии к строме костного мозга (CD34) относится значительная часть ГСК, пул лимфоидных стволовых клеток (ЛСК) и ранние предшественники В-лимфоцитов (про-В, пре-В1 и пре-В2), которые могут пролиферировать и дифференцироваться, в том числе, под влиянием ФСК и ИЛ-7. К пулу клеток с фенотипом CD34+CD117-могут относиться уже более продвинутые в своей дифферен-цировке клетки, инертные к воздействию ФСК, в том числе
незрелые В-лимфоциты, начавшие экспрессию поверхностного иммуноглобулина [12,14]. В этой связи увеличение численности CD117+CD34' клеток с одновременным уменьшением долей клеток с фенотипами CD34+CD117+ и CD34+CD117-позволяет нам высказать мнение о некотором снижении активности дифференцировки гемопоэтических предшественников под влиянием Bacillus sp.
Дифференцировка лимфоцитов. К числу CD25+CD44' клеток могут относиться «оседлые» лимфоидные предшественники - ЛСК и предшественники В-лимфоцитов, лишенные молекул «хоминга» CD44 и имеющие маркеры CD25 для ИЛ-2, необходимого им для активной пролиферации и дифференцировки, а также активированные Т-лимфоциты
[12,14]. В пул клеток с фенотипом CD25+CD44+ могут входить более продвинутые в свой дифференцировке лимфоциты, в том числе, предшественники Т-лимфоцитов, которые направляются для дальнейшей дифференцировки в тимус, так и незрелые В-лимфоциты, заканчивающие стадию антигеннезависимой дифференцировки в костном мозге и направляющиеся для завершения дифференциров-ки (антигензависимой стадии) во вторичные органы иммунной системы. Фенотип CD44+CD25' за исключением самых ранних предшественников могут иметь почти все кроветворные клетки костного мозга, в том числе В-лимфоциты на терминальной стадии дифференцировки в плазматические клетки. В этой связи увеличение численности CD25+CD44+ клеток на фоне уменьшения долей клеток с фенотипами CD25+CD44' и CD44+CD25' может свидетельствовать, по-нашему мнению, о некотором снижении активности дифференцировки гемопоэтических предшественников и затухании повышенной активности лимфопоэза на 21 сутки после введения Bacillus sp.
Т-лимфоциты (TCRafi). К числу клеток, несущих анти-генраспознающие рецепторы TCRap в костном мозге, относятся зрелые Т-лимфоциты, принимающие участие в регуляции гемопоэза [14]. Снижение численности клеток с TCR может служить показателем снижения регуляторной функции Т-лимфоцитов в костном мозге на 21 сутки после введения Bacillus sp.
Влияние Bacillus sp. на дифференцировку лимфоцитов в тимусе. Результаты фенотипирования клеток в тимусе позволили уточнить характер и динамику дифференцировки Т-лимфоцитов (табл. 2).
Таблица 2
Фенотип лимфоцитов тимуса (%)
Рецепторы Контроль n=9 Bacillus sp. n=9
CD34+CD44+ 73,7±3,4 58,3±3,9**
CD34+CD44- 14,6±0,7 18,3±1,1*
CD25+TCR- 1,25±0,04 1,68±0,13**
CD25-TCR+ 16,6±1,2 25,1±2,5**
CD25+TCR+ мах 1,62±0,14 2,87±0,16**
CD44+TCR+ 19,1±1,2 27,9±2.4**
Примечание: достоверность различия между опытной и контрольной группами * - p<0,05; ** - p<0,01
В тимусе отмечается снижение уровня CD34+CD44+ лимфоцитов (p<0,01) и увеличение численности лимфоцитов с фенотипами CD34+44- (p<0,05), CD25+TCR- (p<0,01), CD25-TCR+ (p<0,01), CD25+TCR+ мах (p<0,01) и
CD44+TCR+(p<0,01). На основании полученных данных можно в определенной степени приближения описать отдельные стадии дифференцировки Т-лимфоцитов на 21 сутки после введения Bacillus sp.
Рекрутирование лимфоцитов тимусом. Из костного мозга предшественники Т-лимфоцитов попадают в субкап-сулярную зону тимуса. На их мембране сохраняется экспрессия и CD34 и CD44. Рекрутирование лимфоцитов тимусом зависит от нескольких факторов, в том числе - от уровня тимических гормонов и численности предшественников Т-лимфоцитов, выходящих из костного мозга [14]. Пока лимфоциты сохраняют рецептор «хоминга» CD44, они еще могут покинуть тимус и дифференцироваться в В-лимфоциты (сохранилась молекула СD34 для стромы костного мозга), ЕК-клетки или ДК (лимфоцитарные дендритные клетки покровных тканей и тимуса формируются из этих предшественников лимфоцитов). Способность лимфоцитов к циркуляции и, соответственно, дифференциров-ке в другие клоны утрачивается вместе с потерей молекулы «хоминга» в субкапсулярной зоне тимуса (CD34+CD44-)
[12,14]. В этой связи снижение численности CD34+CD44+ лимфоцитов в субкапсулярной зоне в большей степени может быть обусловлено снижением секретирующей активности тимуса, так как в костном мозге уровень CD25+CD44+ лимфоцитов, способных к циркуляции, повышен. Учитывая повышение численности CD34+СD44' лимфоцитов в тимусе, можно высказать мнение, что лимфоциты задерживаются в нем для дальнейшей дифференциров-ки в Т-лимфоциты.
Созревание TCR. Параллельно с потерей молекул «хоминга» в субкапсулярной зоне лимфоциты приобретают рецептор CD25 для ИЛ-2, как фактора роста и пролиферации лимфоцитов, и переходят в корковый слой [14]. В корковом слое происходит реанжировка генов бета-цепей ТКР и в цитоплазме появляется p-цепь рецептора и лимфоциты становятся про-Т (CD25+TCR-). Клетки, успешно прошедшие реанжировку генов p-цепи ТКР подвергаются позитивной антиген-независимой селекции за счет экспрессии гена В^2 и пролиферация идет под влиянием ИЛ-2, ИЛ-7. После пролиферации про-Т-клетки переходят к стадии пре-Т-клеток (CD25'TCR+). На стадии пре-Т-клеток происходит реанжировка генов альфа-цепей ТКР. Клетки, успешно прошедшие реанжировку генов, проходят позитивную антиген-независимую селекцию - пролиферируют через взаимодействие молекул прото-ТКР (состоящей из бета-цепи ТКР) на тимоцитах и СD81 на тимусэпителиальных клетках без участия ИЛ-2 (нет CD25) [12,14]. Фактором роста пре-Т-клеток является ИЛ-7, а селекции - экспрессия в митохондриях Bcl-2. Одновременно с формированием ТКР у лимфоцитов в цитоплазме синтезируется комплекс CD3 молекул. Появление CD3 вместе с ТКР на мембране указывает на переход пре-Т в стадию через стадию незрелых кортикальных тимоцитов в зрелые Т-лимфоциты (CD25+TCR+) [12; 14]. При фенотипировании фракции Т-лимфоцитов значимо различаются по интенсивности флюоресценции Т-клеточных рецепторов. Особенностью зрелых Т-клеток является высокий уровень экспрессии комплексов «TCR-CD3» и они фенотипируются как CD25+TCR+мах. В этой связи увеличение численности про-Т-клеток (CD25+TCR'), пре-Т-лимфоцитов (CD25'TCR+) и зрелых Т-лимфоцитов (CD25+TCR+мах) с высокой плотностью экспрессии данного комплекса, можно расценивать как активацию процесса дифференцировки Т-лимфоцитов в тимусе на 21 сутки после введения Bacillus sp.
Эмиграция Т-лимфоцитов. Прежде чем эмигрировать из тимуса, Т-лимфоциты претерпевают еще ряд изменений: они защищаются от фагоцитоза и приобретают молекулы хоминга, в частности L-селектин и CD44 (CD44+TCR+)
([12,14]. На 21 сутки после введения Bacillus sp. численность Т-лимфоцитов, эмигрирующих из тимуса (CD44+TCR+) находится на повышенном уровне.
Влияние Bacillus sp. на клеточный состав периферической крови. На 21 сутки после введения Bacillus sp. клеточный состав периферической крови (табл. 3), в том числе уровень лимфоцитов, практически не отличался от контрольных значений.
Таблица 3
Клеточный состав периферической крови
Показатели Контроль n=9 Bacillus sp. n=9
Лейкоциты, 109/л 5,26±0,45 5,36±0,48
Нейтрофилы, 109/л 1,73±0,14 1,51±0,12
Лимфоциты, 109/л 3,39±0,23 3,73±0,28
Моноциты, 109/л 0,14±0,01 0,12±0,01
Влияние Bacillus sp. на функциональную активность иммунной системы. Функциональная активность перитонеальных макрофагов (табл. 4) по уровню их поглотительной (ФП) и метаболической (НСТ) активности практически не отличалась от контрольных значений (p>0,05 в обоих случаях), а функциональная активность клеточного и гуморального иммунитета была повышена.
Таблица 4
Функциональная активность клеток иммунной системы
Показатели Контроль n=9 Bacillus sp. n=9
ФП, % 16,4±1,11 17,2±1,28
НСТ, % 11,6±0,94 13,6±1,2
ГЗТ, % 26,2±1,73 31,7±2,25*
АОК/106 782±38 894±57*
ЛФс х106 116±7,8 138±9,6*
АОК/сел. 90170±4365 123402±5354**
Примечание: достоверность отличия показателей в опытной группе от контрольного уровня * - p<0<05; ** - p<0<01
В данном исследовании структурная составляющая гуморального иммунитета представлена общим числом лимфоцитов в селезенке (ЛФс х106), а функциональная составляющая - числом АОК в 1 млн. лимфоцитов в селезенке (АОК/106), уровень которых в опытной группе несколько превышает контрольный (p<0,05 в обоих случаях). Активность системного гуморального иммунитета зависит как от функциональной, так и структурной составляющей, поэтому число антителообразующих клеток во всей селезенке (АОК/сел) увеличивается уже значимо (p<0,01). Функциональная активность клеточного иммунитета (по уровню реакции ГЗТ) также несколько повышена (p<0,05).
Заключение. Весь спектр полученных данных свидетельствует, что штамм М3 микроорганизмов Bacillus sp., выделенных из проб многолетних мерзлых пород, способен оказывать комплексное влияние на морфофункциональную активность иммунной системы современных млекопитающих на разных уровнях ее организации - от костномозгового кроветворения до эффекторной стадии формирования иммунного ответа. Причем данный эффект сохраняется более 21 суток после парентерального введения Bacillus sp в относительно небольшой дозе - 5-103 м.т. на животное.
Установленное снижение уровня миелобластов, сегментоядерных нейтрофилов (данные миелограммы) и численности клеток с фенотипом CD44+CD25', в число которых также могут входить клетки-предшественники миелоидно-го ряда, может свидетельствовать о возможности регуляции малыми дозами бактерий Bacillus sp. механизмов с про- и противовоспалительной направленностью иммунного отве-
та и сдвиге баланса в сторону активации механизмов с противовоспалительной активностью. Повышение на этом фоне общей доли лимфоцитов (данные миелограммы) и числа лимфоцитов, покидающих костный мозг (CD25+CD44+) на 21 сутки после введения бактерий может свидетельствовать о сдвиге баланса гемопоэза в сторону лимфопоэза и «включении» механизмов компенсаторного пополнения пула лимфоцитов в системной циркуляции после установленного нами ранее [7] значимого повышения функциональной активности иммунной системы на 14 сутки после введения Bacillus sp.
Обращает на себя внимание последовательность изменения структурно-функциональных параметров иммунной системы: снижение активности дифференцировки миелоидных и лимфоидных предшественников в костном мозге - снижение притока лимфоидных предшественников в тимус - сохранение повышенной активности дифферен-цировки Т-лимфоцитов в тимусе - сохранение на повышенном уровне функциональной активности Т- и В-лимфоцитов. Представленные данные свидетельствуют, что реакции иммунной системы развиваются волнообразно и затухание иммунного ответа начинается с костного мозга.
Возможными управляющими механизмами подобных изменений могут быть:
- Компенсаторные изменения в спектре секретируе-мых цитокинов перитонеальными макрофагами и резидентными стромальными клетками брюшной полости (согласно месту введения бактерий). Подтверждением этому является установленное восстановление до контрольных значений показателей функциональной активности перитонеальных макрофагов.
- Компенсаторное снижение регуляторной функции тимуса. Подтверждением этому может служить установленное уменьшение численности регуляторных Т-лимфоцитов с фенотипом TCRap+ в костном мозге и снижение притока предшественников Т-лимфоцитов с фенотипом CD34+CD44+ в тимус на фоне сохранения повышенной активности их дифференцировки в зрелые Т-лимфоциты.
- Общие закономерности развития иммунного ответа на бактериальные антигены. Подтверждением этому является восстановление функциональной активности перитонеальных макрофагов до контрольных значений, снижение активности клеточного иммунитета (по уровню реакции ГЗТ) на 28%, гуморального иммунитета (по числу АОК) - на 22% относительно данных, полученных на 14 сутки после введения Bacillus sp [7].
Таким образом, результаты исследования свидетельствуют, что функционирование иммунной системы основано на тонком динамическом балансе механизмов индукции ответа и его рационального ограничения при попадании в организм малых доз сапрофитных бактерий. Иммунорегуля-торный баланс реализуется практически на всех уровнях организации тканевых и клеточных систем, а также непосредственно в динамике иммунного реагирования. Пролонгированное сохранение структурного следа в иммунной системе может являться свидетельством наличия у Bacillus sp. свойств пробиотиков. Исследование возможности модуляции активности гемо- и лимфопоэза в костном мозге мышей малыми дозами одного изолята микроорганизмов (штамм 3М Bacillus sp. из многолетних мерзлых пород) может оказаться полезным для оценки влияния на разные стадии иммунопоэза малых доз других бактерий, определения механизмов и веществ-носителей установленных эффектов.
Литература
1. Агаджанян, Н.А. Системный экологический мониторинг как компонент стратегической безопасности / Н.А. Агаджанян, О.И. Аптикаева, Г.А. Гамбурцев, Е.А. Жал-ковский, Ф.А. Летников, В.Н. Расторгуев, П.И. Сидоров, В.А. Черешнев, Ф.Н. Юдахин // Приложение к журналу "Безопасность жизнедеятельности".- 2009.- № 9.- С. 1-24.
2. Ада, Г. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ / Г. Ада, А. Рамсей.- М.: Медицина, 2002.- 344 с.
3. Бакулина, Л.Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus / Л.Ф. Бакулина,
Н.Г. Перминова, И.В. Тимофеев // Биотехнология.- 2001.-№ 2.- С. 48-56.
4. Брушков, А.В. Биогеохимия мерзлых пород Центральной Якутии / А.В. Брушков, В.П. Мельников, М.В. Щелчкова, Г.И. Грива, В.Е. Репин, Е.В. Бреннер, М. Танака // Криосфера Земли.- 2011.- Т. XY.- № 4.- С. 90-100.
5. Реликтовые микроорганизмы криолитозоны как возможные объекты геронтологии / А.В. Брушков [и др.] // Успехи геронтологии.- 2009.- Т. 22.- № 2.- С. 253-258.
6. Григорьев, А. Перспективы геомедицинских исследований / А. Григорьев, А. Макоско, А. Матешева // Наука в России.- 2012.- № 2.- С. 4-10.
7. Калёнова, Л.Ф. Влияние микроорганизмов вечной мерзлоты на морфофункциональную активность иммунной системы в эксперименте / Л.Ф. Калёнова, Ю.Г. Суховей, А.В. Брушков, В.П. Мельников, Т.А. Фишер, И.М. Беседин, М.А. Новикова, Ю.А. Ефимова, А.М. Субботин // Бюл. экспер. биологии и медицины.- 2011.- Т. 151.- № 2.- С. 164—168.
8. Маркушин, С.Г. Изучение иммунного ответа мышей, иммунизированных интраназально живой гриппозной холодоадаптированной вакциной в комбинации с производными хитозана в качестве адъювантов /
С.Г. Маркушин, А.Д. Переверзев, Н.К. Ахматова, Г.Г. Кривцов // Российский иммунологический журнал.- 2011.- Т. 5.-№ 14.- С. 233-243.
9. Мелентьев, А. И. Аэробные спорообразующие бактерии в агроэкосистемах / А.И. Мелентьев.- М.: Наука, 2007.- 145 с.
10. Сорокулова, И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов / И.Б. Сорокуло-ва // Антибиотики и химиотерапия.- 1998.- № 2.- С. 20-23.
11.Сорокулова, И.Б. Изучение безопасности бацилл-пробиотиков / И.Б. Сорокулова, И.Г. Осипова, Н.В. Тереш-кина // Вестник российской АМН.- 2006.- №1.- С.50-54.
12.Фрейдлин, И.С. Клетки иммунной системы. Лимфоциты: монография / И.С. Фрейдлин, А.А. Тотолян.-СПб.: Наука, 2001.- 390 с.
13.Шевченко, Ю.Л. Микроорганизмы и человек. Некоторые особенности их взаимососуществования на современном этапе / Ю.Л. Шевченко, Г.Г. Онищенко // ЖМЭИ.-2001.- № 2.- С. 94-104.
14. Ярилин, А.А. Основы иммунологии / А.А. Яри-лин.- М.: Медицина, 1999.- 606 с.
15.Effects of permafrost microorganisms on the quality and duration of life of laboratory animals / L.F. Kalenova [et al.] // Neuroscience and Behavioral Physiology.- 2011.- V. 41.-№ 5.- P. 484-490.
16.Rasko, D.A. Genomics of the Bacillus cereus group of
organisms / D.A. Rasko, M.R. Altherr, C.S. Han, J. Ravel // FEMS Microbiol. Rev.- 2005.- V. 29.- № 2.- P. 303-329.
References
1. Agadzhanyan NA, Aptikaeva OI, Gamburtsev GA, Zhalkovskiy EA, Letnikov FA, Rastorguev VN et al. Sistemnyy ekologicheskiy monitoring kak komponent strategicheskoy bezopasnosti. Prilozhenie k zhurnalu "Bezopasnost' zhiznedeyatel'nosti". 2009;9:1-24. Russian.
2. Ada G, Ramsey A. Vaktsiny, vaktsinatsiya i immunnyy otvet. Moscow: Meditsina; 2002. (per. s angl.). Russian.
3. Bakulina LF, Perminova NG, Timofeev IV. Probiotiki na osnove sporoobrazuyushchikh mikroorganiz-mov roda Bacillus. Biotekhnologiya. 2001;2:48-56. Russian.
4. Brushkov AV, Mel'nikov VP, Shchelchkova MV, Gri-va GI, Repin VE, Brenner EV et al. Biogeokhimiya merzlykh porod Tsentral'noy Yakutii. Kriosfera Zemli. 2011;XY(4):90-100. Russian.
5. Brushkov AV, Mel'nikov VP, Sukhovey YuG, Griva GI, Repin VE, Kalenova LF et al. Reliktovye mikroorganizmy kri-olitozony kak vozmozhnye ob”ekty gerontologii. Uspekhi ge-rontologii. 2009;22(2):253-8. Russian.
6. Grigor'ev A, Makosko A, Matesheva A. Perspektivy geomeditsinskikh issledovaniy. Nauka v Rossii. 2012;2:4-10. Russian.
7. Kalenova LF, Sukhovey YuG, Brushkov AV, Mel'nikov VP, Fisher TA, Besedin IM et al. Vliyanie mikroorganiz-mov vechnoy merzloty na morfofunktsional'nuyu aktivnost' immunnoy sistemy v eksperimente. Byul. eksper. biologii i me-ditsiny. 2011;151(2):164-8. Russian.
8. Markushin SG, Pereverzev AD, Akhmatova NK, Krivtsov GG. Izuchenie immunnogo otveta myshey, immuniziro-vannykh intranazal'no zhivoy grippoznoy kholodoadaptiro-vannoy vaktsinoy v kombinatsii s proizvodnymi khitozana v kachestve ad”yuvantov. Rossiyskiy immunologicheskiy zhur-nal. 2011;5(14):233-43. Russian.
9. Melent'ev AI. Aerobnye sporoobrazuyushchie bak-terii v agroekosistemakh. Moscow: Nauka; 2007. Russian.
10. Sorokulova IB. Vliyanie probiotikov iz batsill na funktsional'nuyu aktivnost' makrofagov. Antibiotiki i khimiote-rapiya. 1998;2:20-3. Russian.
11. Sorokulova IB, Osipova IG, Tereshkina NV. Izuchenie bezopasnosti batsill-probiotikov. Vestnik rossiyskoy AMN. 2006;1:50-4. Russian.
12. Freydlin IS, Totolyan AA. Kletki immunnoy sistemy. Limfotsity: monografiya. Saint Petersburg: Nauka; 2001. Russian.
13. Shevchenko YuL, Onishchenko GG. Mikroorganizmy i chelovek. Nekotorye osobennosti ikh vzaimososushchestvova-niya na sovremennom etape. ZhMEI. 2001;2:94-104. Russian.
14. Yarilin AA. Osnovy immunologii. Moscow: Meditsina; 1999. Russian.
15. Kalenova LF, Sukhovei YuG, Brushkov AV, Melnikov WP, Fisher TA, Besedin IM. et al. Effects of permafrost microorganisms on the quality and duration of life of laboratory animals. Neuroscience and Behavioral Physiology. 2011;41(5):484-90.
16. Rasko DA, Altherr MR, Han CS, Ravel J.Genomics of the Bacillus cereus group of organisms. FEMS Microbiol. Rev. 2005;29(2):303-29.
