CC BY
44УДК 612:159.91:615.3 Минина Е. Н., Черетаев И. В.
ВЛИЯНИЕ МАЛЫХ ДОЗ ДАЛАРГИНА ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ НА ПОВЕДЕНИЕ КРЫС В ТЕСТЕ ПОРСОЛТА
Таврическая академия, ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295003, проспект Вернадского, 4, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Минина Елена Николаевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры теории и методики адаптивной физической культуры, физической реабилитации и оздоровительных технологий, E-mail: cere-el@yandex.ua
For correspondence: Elena N. Minina, PhD of biological Sciences, associate Professor of the Department of theory and methodology of adaptive physical culture, physical rehabilitation and health technologies, Tavrida Academy CFU of Vernadsky, Simferopol, Russia
INFORMATION ABOUT AUTHORS Minina E.N., http://orcid.org/0000-0002-6692-5343 Cheretaev I.V., http://orcid.org/0000-0003-1852-4323
РЕЗЮМЕ
Интраназальное применение биологически-активных веществ не только местного, но и системного действия является перспективной областью медико-биологических исследований. Использование интраназального способа введения может быть полезным в отношении ряда регуляторных пептидов, которые не способны проникать через гематоэнцефалический барьер, в частности, при использовании даларгина в малых дозах. Традиционно этот препарат считается препаратом периферического действия, реализующим свои эффекты через активацию периферических |j- и б-опиоидных рецепторов, поскольку его проникновение через ГЭБ затруднено.
В работе изучено поведение лабораторных крыс в тесте Порсолта после ежедневного 21-дневного интраназального введения даларгина в малых дозах (концентрации 10-11, 10-10 и 10-9 М).
В концентрациях 10-10 и 10-11 М даларгин после 21-дневного интраназального введения не оказывает существенного влияния на поведение крыс в тесте Порсолта, то есть данные дозы принадлежат к диапазону «мёртвой зоны», в которых не наблюдается эффект препарата.
В концентрации 10-9 М обнаружен антидепрессантный эффект данного препарата. Это свидетельствует об эффективности применения данной дозы даларгина с использованием интраназального способа введения. Это результаты доказали потенциальную возможность применения препарата при тревожно-депрессивных расстройствах с использованием интраназального способа введения в малых дозах.
Авторы акцентируют внимание на необходимости проведения тщательных доклинических и клинических испытаний препарата в диапазоне малых концентраций и изучения роли каскадно-сигнальных и нейрохимических процессов в физиологическом механизме антидепрессантного действия даларгина.
Ключевые слова: даларгин, малые дозы, интраназальное введение, тест Порсолта, антидепрессантный эффект.
SUMMARY
INFLUENCE OF SMALL DOSES OF DALARGIN ON THE BEHAVIOR OF RATS IN THE TEST OF PORSOLT WHEN ADMINISTERED INTRANASALLY
Minina E. N., Cheretaev I. V.
Intranasal application of biologically-active substances not only local but also systemic effects is a promising area of biomedical research. The use of intranasal mode of administration can be useful in a number of regulatory peptides that are not able to penetrate the blood-brain barrier, in particular, the use of dalargin in small doses. Traditionally, this drug is a drug peripheral actions, realizing their effects via activation of peripheral j - and б-opioid receptors, because its penetration through the BBB is difficult.
The authors studied the behavior of laboratory rats in the test of Porsolt after the daily 21-day intranasal administration of dalargin in small doses (concentrations of 10-11, 10-10 and 10-9 M).
In concentrations of 10-10 and 10-11 M dalargin after 21-day intranasal administration has no significant effect on the behavior of rats in the test of Porsolt, i.e., these doses belong to the band «the dead zone», which is not observed effect of the drug.
At a concentration of 10-9 M discovered the antidepressant effect of this drug. This demonstrates the effectiveness of using this dose of dalargin using intranasal mode of administration. This results proved the potential use of the drug for anxiety and depressive disorders using intranasal mode of administration in small doses.
The authors emphasize the need for careful preclinical and clinical trials of the drug in the range of low concentrations and study the role of cascading signaling and neurochemical processes in the physiological mechanism of the antidepressant action of dalargin.
Keywords: dalargin, low doses, intranasal injection, test Porsolt, antidepressant effect.
Интраназальное применение биологически-активных веществ не только местного, но и системного действия является перспективной областью медико-биологических исследований. Так же актуально изучение фармакологических эффектов интраназально введённых препаратов, так же обусловленных и различной концентрацией, что в дальнейшем может быть использовано в клинической медицине [1]. Во многих случаях интраназальное введение позволяет избежать инъекционного или парентерального пути введения и уменьшить число неблагоприятных реакций проводимой терапии. Так, при широких возможностях регулирования многих физиологических и психических процессов использование в терапевтических целях пептидных веществ ограничивается трудностями их доставки в организм в активной форме. Целый ряд пептидных препаратов может быть введен сейчас только в виде инъекций, так как при пероральном введении происходит их быстрое разрушение в желудочно-кишечном тракте под влиянием различных пептидаз.
В литературе имеется достаточно сведений об использовании интраназального введения для целого ряда клинически важных пептидов [2]. На сегодняшний день известно уже более 30 белково-пептидных гормонов, которые всасываются при интраназальном применении [3].
Особое место среди этого класса веществ занимают нейропептиды, участвующие в регуляции функций нервной системы и управляющие различными формами поведения у человека и животных [4]. Показано, например, что эн-кефалины и эндорфины являются пептидами с опиатными свойствами и могут принимать участие в механизмах аналгезии, памяти, обучения [5]. Значительную роль они играют в предотвращении различных стрессовых, психопатологических состояний: депрессии, маний, некоторых симптомов шизофрении и в формировании агрессивного, ориентировочно-исследовательского и социального поведения [6].
При этом важно учитывать, что транспорт БАВ возможен не только через сосудистое русло респираторного эпителия носовой полости, но так же в качестве транспортного канала для поступления фармакологических препаратов в ЦНС возможно рассматривать обонятельную систему [7].Существует также ряд уникальных анатомических особенностей в организации центральных обонятельных проекций, благодаря которым следует обратить внимание на использование интраназального способа введения, как одного из самых удобных для воздействия психотропными и нейротропными средствами. Во-первых, безрелейная связь пери-
ферических отделов обонятельного анализатора с корой; во-вторых, тесная связь с гиппокампом, одной из функций которого в настоящее время считают формирование раннего обонятельного импринтинга, а также значительной стойкости в ЦНС многих обонятельных образов. И, в-третьих, связь с теми ядрами лимбической системы и гипоталамуса, которые осуществляют контроль и формирование многих форм инстинктивного поведения в первую очередь полового, агрессивного, социального и т.п.
Следует также отметить, что периферический отдел обонятельной системы обладает высокой способностью к связыванию молекул пахучих веществ, особенно тех, которые являются биологически значимыми для данного вида животных. При этом эффективная концентрация этих веществ может быть ничтожно мала (10~9-10~12 М).Однако оказалось, что обонятельная ткань вообще обладает более высокой способностью к связыванию и поглощению из окружающей среды различных химических соединений, не являющихся обонятельными стимулами [1]. Поэтому можно предположить, что пути обонятельной системы, реагируя на малые дозы БАВ, могут быть использованы для воздействия на функции ЦНС препаратами, доставка которых через кровеносное русло неэффективна или нецелесообразна из-за непроницаемости для них гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Практический интерес к этой проблеме не ослабевает, а также нерешенность целого ряда вопросов в физиологическом механизме интра-назального транспорта, эффективных концентраций БАВ определяют актуальность проводимых нами экспериментальных исследований. На наш взляд, использование интраназального способа введения может быть полезным в отношении ряда регуляторных пептидов, которые не способны проникать через ГЭБ, в частности, при использовании даларгина в малых дозах. Традиционно этот препарат считается препаратом периферического действия, реализующим свои эффекты через активацию периферических ц- и 6-опиоидных рецепторов, поскольку его проникновение через ГЭБ затруднено [8].
Цель исследования- выявить влияние курсового интраназального введения даларгина в дозах (10-9, 10-10 и 10-11 М), в которых он не проходит через ГЭБ, на поведение крыс в тесте Порсолта.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования выполнены на 40 белых беспородных крысах-самцах массой 250-280 г со средней двигательной активностью и низкой эмоциональностью, предварительно отобранных в тесте «открытое поле» [9, 10]. Горизон-
тальная двигательная активность животных в тесте «открытое поле» составляла 25,2 ± 1,5 усл. ед., вертикальная двигательная активность -6,1 ± 0,9 усл. ед., число дефекаций - 0,72 ± 0,14.
Отобранных животных разделяли на 4 группы по 10 особей в каждой. Трём экспериментальным группам крыс в течение 21 дня ежедневно в 9.00 утра вводили интраназально даларгин по 0,2 мл в концентрациях 10-11, 10-10 и 10-9 М, а контрольной группе - 0,2 мл физиологического раствора. Даларгин разводили до необходимых концентраций по методу Ганемана [11], обязательно проводя потенцирование. На 21 день через 5 мин. после интраназального введения даларгина в указанных дозах плавательное поведение животных исследовали в течение 3 мин. в тесте Порсолта [12, 13], который используется для обнаружения антидепрессантной активности веществ. Установка данного теста представляет собой прозрачную цилиндрическую ёмкость из оргстекла высотой 45 см и диаметром 20 см, которую на 2/3 заполняли дистилированной водой, температура которой составляла 22±1°С. Тестируемое животное при этом не имело возможности коснуться дна хвостом и выпрыгнуть из цилиндра. Анализировали основные показатели теста (латентный период первого зависания животных в воде, суммарная продолжительность периодов активного и пассивного плавания), а также рассчитывали индекс де-прессивности (отношение суммарного времени пассивного плавания животных к времени суммарного активного плавания), подобный подход использовался и в более ранних работах [14].
Статистически значимые различия показателей контрольной и экспериментальной групп определяли с помощью непараметрического и-критерия Манна-Уитни [15]. Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего. При выполнении экспериментов соблюдали этические нормы и принципы Хельсинкской Декларации 1975 г., пересмотренной и дополненной в 2000 г.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ основных показателей теста Пор-солта показал, что 21-дневное интраназальное введение даларгина в концентрациях 10-10 и 10-11 М не приводило к достоверным отличиям продолжительности латентного периода первого зависания в воде, суммарных периодов активного и пассивного плавания (рис. 1-2), а также индекса депрессивности (табл. 1). Однако в концентрации (10-9 М) даларгин после курсового интраназального введения обладал существенным антидепрессантным эффектом, который выражался в достовер-
ном повышении (р<0,01)относительно контроля продолжительности латентного периода первого зависания в воде на 29,7 с (рис. 1) и суммарного времени активного плавания на 23,4 с (рис. 2, А). При этом достоверно снижались (р<0,01)суммарная продолжительность периодов пассивного плавания крыс (рис. 2, Б) и их индекс депрессивности, что также свидетельствует о выраженном антидепрес-сантном эффекте даларгина в концентрации 10-9 М (табл.) в условиях сильного стресса.
Рис. 1. Влияние малых доз даларгина при ин-траназальном введении на латентный период первого зависания крыс в воде в тесте Порсолта.
Рис. 2. Влияние малых доз даларгина при ин-траназальном введении на суммарная продолжительность периодов активного и пассивного плавания крыс в тесте Порсолта: А и Б - суммарная продолжительность периодов активного и пассивного плавания соответственно. ** - р < 0,01 - достоверные изменения показателей относительно контроля.
ОБСУЖДЕНИЕ
Отсутствие эффекта препарата в концентрациях 10-10 и 10-11 М, приближающихся согласно [11] к нижней границе сверхмалых доз, можно объяснить их принадлежностью к так называемой «мёртвой зоне» - области концентраций,
где не наблюдается видимого биологического эффекта вещества. Присутствие «мёртвых зон» характерно для различных БАВ в малых и сверхмалых дозах, что является проявлением универсальных закономерностей «расслоения» и полимодальности их биологического эффекта [10]. Следует отметить, что обнару-
женная нами биологическая активность да-ларгинав концентрации 10-9М согласуется с результатами, свидетельствующими о наличии выраженной анальгетической активности этого препарата в дозе 0,2 мкг/кг (10-9 М) и её отсутствии в дозе 0,002 мкг/кг (10-11 М), относящейся к диапазону «мёртвой зоны» [16].
Таблица 1.
Индекс депрессивности крыс (M±m) в тесте Порсолта под влиянием малых доз даларгина
Вещество, доза или концентрация Индекс депрессивности, усл. ед.
физиологический раствор (контроль) 0,52 ± 0,10
даларгин 10-11 М 0,50 ± 0,09
даларгин 10-10 М 0,55 ± 0,10
даларгин 10-9 М 0,26 ± 0,07 **
Примечание: ** - p<0,01 - достоверные изменения показателей относительно контроля.
ОБСУЖДЕНИЕ
Отсутствие эффекта препарата в концентрациях 10-10 и 10-11 М, приближающихся согласно [11] к нижней границе сверхмалых доз, можно объяснить их принадлежностью к так называемой «мёртвой зоне» - области концентраций, где не наблюдается видимого биологического эффекта вещества. Присутствие «мёртвых зон» характерно для различных БАВ в малых и сверхмалых дозах, что является проявлением универсальных закономерностей «расслоения» и полимодальности их биологического эффекта [10]. Следует отметить, что обнаруженная нами биологическая активность даларгинав концентрации 10-9М согласуется с результатами, свидетельствующими о наличии выраженной анальгетической активности этого препарата в дозе 0,2 мкг/кг (10-9 М) и её отсутствии в дозе 0,002 мкг/кг (10-11 М), относящейся к диапазону «мёртвой зоны» [16].
Таким образом, даларгин в дозе 10-9 М, в которой он не способен проникать через ГЭБ, можно использовать в качестве перспективного антидепрессантного препарата, используя интраназальный способ введения данного препарата. Для детального раскрытия перспективы использования препарата в качестве антидепрессанта при интраназальном введении, необходимо проведение тщательных доклинических и клинических испытаний препарата в диапазоне малых концентраций и изучение роли каскадно-сигнальных и нейрохимических процессов в физиологическом механизме антидепрессантного действия даларгина.
ВЫВОДЫ
1. В концентрациях 10-10 и 10-11 М даларгин после 21-дневного интраназального введения не оказывает существенного влияния на поведение крыс в тесте Порсолта, то есть данные дозы принадлежат к диапазону «мёртвой зоны», в которых не наблюдается эффект препарата.
2. В тесте Порсолта после 21-дневного ин-траназального введения даларгина в концентрации 10-9 М обнаружен антидепрес-сантный эффект данного препарата. Это свидетельствует об эффективности применения данной дозы даларгина с использованием интраназального способа введения.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1.Гладышева О.С. Обонятельная система позвоночных животных как канал назального транспорта веществ в структуры мозга. Сенсорные системы. 2007;21(2):99-113.
2.Студеникин В.М. Пептидный препарат для интраназального введения в педиатрии и психоневрологии. Поликлиника.2016;1:33-38.
3.Metder B., Anderton S., Manickasingham S.P., Wraith C. Kinetics of peptide uptake and tissue distribution following a single dose ofpeptide. Immunol.Invest.2000;29(1):61-70.
4. Ашмарин И.П. Перспективы практического применения и некоторые фундаментальные исследования малых регуляторных пептидов. Вопр. мед.химии. 1984;3:2-7.
5.Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н. Опиоидные ней-ропептиды, стресс и адаптационная защита сердца. Томск:ТГУ;1994.
6.Соллертинская Т.Н., Шорохов М.В. Церебропротек-тивная роль нейропептидов при нарушении и деструкции гиппокампа у млекопитающих (коррекция нарушенных интегративных функций мозга). Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2007;9(3):117-141.
7.Смагин В.Г., Виноградов В.В., Булгаков С.А. Лиган-ды опиатных рецепторов. М.: Наука; 1983.
8. Титов М.И., Виноградов В.А., Беспалова Ж.Д. Даларгин - пептидный препарат с цитопротективным действием. Бюллетень ВКНЦ. 1985;2:72-76.
9. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Высшая школа; 1991.
10. Sestakova N., Puzserova A., Kluknavsky M., Bernatova I. Determination of motor activity andanxiety-relatedbehaviourinrodents: methodologicalaspects and role of nitric oxide. Interdiscip. Toxicol. 2013; 6(3): 126-135.
11. Славецкая М., Капай Н. Сверхмалые дозы биологически активных веществ как основа лекарственных препаратов для ветеринарии. М.: Аквариум-Принт; 2012.
12. Porsolt R.D., Le Pinchon M., Jalfre M. Depression: а new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature. 1977;5604:730-732.
13. Slattery D.A., Cryan J.F.Using the rat forced swim test to assess antidepressant-like activity in rodents. NatureProtocols. 2012; 7(6): 1009-1014.
14. Черетаев И.В. Влияние сверхнизких концентраций 2-аминометилбензимидазола на поведение крыс в тесте Порсолта в норме и на фоне активации дофа-минергической системы юмексом. Молодой учёный. 2014;19(78):100-104.
15. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа; 1990.
16. Коренюк И.И., Минина Е.Н., Белоусова Ю.В., Че-ретаев И.В. Влияние даларгина в малых дозах на болевую чувствительность у крыс. Учёные записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». 2014;27(66),4:43-51.
REFERENCES
1. Gladysheva O.S. Obonjatel'naja sistema pozvonochnyh zhivotnyh kak kanal nazal'nogo transporta veshhestv v struktury mozga. Sensornye sistemy.2007; 21(2): 99-113(In Russ.).
2. Studenikin V.M. Peptidnyj preparat dlja intranazal'nogo vvedenija v pediatrii i psihonevrologii.Poliklinika.2016;1:33-38(In Russ.).
3. Metder B., Anderton S.,Manickasingham S.P., Wraith C. Kinetics of peptide uptake and tissue distribution following a single dose ofpeptide. Immunol.Invest.2000;29(1):61-70.
4. Ashmarin I.P. Perspektivy prakticheskogo primenenija i nekotorye fundamental'nye issledovanija malyh reguljatornyh peptidov.Vopr. med. himii. 1984; 3: 2-7 (In Russ.).
5. Lishmanov Ju.B., Maslov L.N. Opioidnye nejropeptidy, stress i adaptacionnaja zashhita serdca. Tomsk, TGU, 1994(InRuss.).
6. Sollertinskaja T.N., Shorohov M.V. Cerebroprotektivnaja rol' nejropeptidov pri narushenii i destrukcii gippokampa u mlekopitajushhih (korrekcija narushennyh integrativnyh funkcij mozga).Zhurnal jevoljucionnoj biohimii i fiziologii. 2007; 9(3): 117-141 (InRuss.).
7. Smagin V.G., Vinogradov V.V., Bulgakov S.A. Ligandy opiatnyh receptorov. M., Nauka, 1983 (InRuss.).
8. Titov M.I., Vinogradov V.A., Bespalova Zh.D. Dalargin - peptidnyj preparat s citoprotektivnym dejstviem. Bjulleten' VKNC.1985;2:72-76(InRuss.).
9. Buresh Ja., Bureshova O., H'juston D. Metodiki i osnovnye jeksperimenty po izucheniju mozga i povedenija. M., Vysshaja shkola, 1991.(In Russ.).
10. Sestakova N., Puzserova A., Kluknavsky M., Bernatova I. Determination of motor activity andanxiety-relatedbehaviourinrodents: methodologicalaspects and role of nitric oxide. Interdiscip. Toxicol. 2013; 6(3): 126-135.
11. Slaveckaja M., Kapaj N. Sverhmalye dozy biologicheski aktivnyh veshhestv kak osnova lekarstvennyh preparatov dlja veterinarii. M., Akvarium-Print, 2012.(In Russ.).
12. Porsolt R.D., Le Pinchon M., Jalfre M. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature. 1977;5604:730-732.
13. Slattery D.A., Cryan J.F.Using the rat forced swim test to assess antidepressant-like activity in rodents. NatureProtocols. 2012; 7(6): 1009-1014.
14. Cheretaev I.V. Vlijanie sverhnizkih koncentracij 2-aminometilbenzimidazola na povedenie krys v teste Porsolta v norme i na fone aktivacii dofaminergicheskoj sistemy jumeksom. Molodoj uchjonyj. 2014; 19(78): 100-104(In Russ.).
15. Lakin G.F. Biometrija. M., Vysshaja shkola, 1990 (In Russ.).
16. Korenjuk I.I., Minina E.N., Belousova Ju.V., Cheretaev I.V. Vlijanie dalargina v malyh dozah na bolevuju chuvstvitel'nost' u krys. Uchjonye zapiski Tavricheskogo nacional'nogo universiteta im. V.I. Vernadskogo. Serija «Biologija, himija». 2014; 27(66), 4: 43-51. (InRuss.).
