CC BY
19
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
кайме и на слизистом секрете бокаловидных клеток указывает на возможность непосредственного контакта этой протеазы с имеющимися в этой зоне потенциальными субстратами, в том числе, проренином и ангиотензиноге-ном, что предполагает существование Кат G-зависимого пути активации локальной кишечной РАС.
Таким образом, каталитические свойства и клеточная локализация предполагают существование Кат G-зависимого пути активации локальной РАС в кишечном эпителии в норме. В условиях воспаления локальная РАС может дополняться нейтрофил-зависимой ангиотензин-генерирующей системой, инициирующей в очаге воспаления образование ангиотензинов, в том числе А-П, воздействующего на кровоток, проницаемость сосудов и инфильтрацию клеток, что, по-видимому, играет компенсаторную роль в экстремальных условиях.
ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ КЛЕТОК КРЫС ПРИ ТИРЕОТОКСИКОЗЕ В ЭФФЕКТОРНУЮ ФАЗУ ИММУННОГО ОТВЕТА
Зенков А.Л.1, Годовалов А.П.1, Шилов Ю.И.1, 2
1ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения РФ, Пермь, Россия 2 ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН, Пермь, Россия
Ранее выявлена зависимость направленности изменений иммунного ответа от тяжести экспериментального тиреотоксикоза у крыс и участие в них функциональной экспрессии бета-адренорецепторов (Годовалов А.П., Шилов Ю.И., 2009; Шилов Ю.И., Годовалов А.П., 2012). Однако изменения функций перитонеальных лейкоцитов при тиреотоксикозе изучены недостаточно.
Цель. Оценка количественного состава и фагоцитарной активности перитонеальных клеток крыс при экспериментальном тиреотоксикозе в эффекторную фазу иммунного ответа.
Материалы и методы. Эксперимент выполнен на 33 самцах белых крыс с исходной средней массой 313±4 г. Для моделирования тиреотоксикоза ежедневно подкожно вводили L-тироксин в течение 14 дней в суточной дозе 0,04 (1-я группа) или 4 мг/кг массы тела (2-я группа) (Годовалов А.П., Шилов Ю.И., 2009; Шилов Ю.И., Годовалов А.П., 2012). Крысы контрольной группы получали растворитель гормона. На 10-е сутки от начала эксперимента всех животных сенсибилизировали эритроцитами барана (108 клеток подкожно в правую стопу). На 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена (109 эритроцитов подкожно в правую стопу). Через 24 ч (15-е сутки эксперимента) оценивали количественный состав перитонеальных клеток и их фагоцитарную активность по отношению к формалинизированным эритроцитам барана по ранее описанному методу (Шилов С.Ю., Шилов Ю.И., 2012). Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики и критерия Дункана для множественных сравнений.
Результаты. Установлено, что у животных 1-й группы абсолютное число всех перитонеальных лейкоцитов составляет 164,2±2,7 (р < 0,05), у крыс 2-й группы — 104,0±8,9 (р > 0,05), а в контрольной группе — 132,1±15,6 млн клеток. У животных 1-й группы выявляется увеличение абсолютного числа перитонеальных лимфоцитов (85,0±5,6 млн
клеток, а в контрольной — 51,6±7,7 млн клеток; р < 0,05). Абсолютное количество перитонеальных мононуклеар-ных фагоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и тучных клеток в сравниваемых группах статистически значимо не различается. При оценке фагоцитарной активности перитонеальных клеток установлено, что во 2-й группе существенно выше абсолютное число активно фагоцитирующих клеток, чем в контрольной и 1-й группах. Выявленные изменения фагоцитарной активности перитоне-альных клеток связаны, в первую очередь, с изменением фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов.
Заключение. Таким образом, при экспериментальном тиреотоксикозе, вызванном подкожным введением тироксина в суточной дозе 4 мг/кг массы тела, отмечается повышение фагоцитарной активности перитонеальных лейкоцитов преимущественно за счет мононуклеарных фагоцитов.
ВЛИЯНИЕ ЛОКАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦИТОКИНОВЫХ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ НА РОСТ ПЕРЕВИВАЕМОЙ МЕЛАНОМЫ МЫШЕЙ
Золотарева Е.И., Златник Е.Ю., Шульгина О.Г., Новикова И.А., Быкадорова О.В.
ФГБУ«Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения РФ, Ростов-на-Дону, Россия
Введение. Цитокиновые препараты нашли применение в комплексном лечении злокачественных опухолей, в частности меланомы, однако их введение осуществляется преимущественно системно. Тем не менее, при проведении иммунотерапии, наряду с системным действием представляется возможным использовать и локальные эффекты цитокинов, способствующие коррекции микроокружения опухоли. Кроме того, оптимизация комбинаций цитокиновых препаратов для максимального проявления их противоопухолевого и иммуномодулирующего действия рассматривается как важное направление иммунотерапии опухолей.
Цель. Разработка и экспериментальное обоснование новых методов иммунотерапии перевиваемой меланомы с применением цитокиновых препаратов.
Материалы и методы. Эксперимент поставлен на 75 мышах линии С57В1/6 с перевиваемой меланомой В16, у которых после паратуморального введения в течение 8 дней различных комбинаций препаратов рекомбинант-ных цитокинов изучали динамику опухолевого роста. После эвтаназии, которую проводили через 3 дня, оценивали метастазирование в легкие и селезенку, морфологические характеристики меланомы, селезенки и тимуса, состав субпопуляций лимфоцитов в селезенке с помощью проточной цитофлюориметрии. Исследовали 6 групп живот-ных-опухоленосителей, получавших Ронколейкин (ГЬ-2), Ронколейкин + Доксорубицин, Ронколейкин + Ин-гарон (ШЫу), Ронколейкин + Ингарон + Рефнот (ТОТа с тимозином), цитостатик Доксорубицин (внутрибрю-шинно); контроль (физиологический раствор). Суммарные дозы препаратов рассчитывали, исходя из клинически рекомендованных в пересчете на массу тела мышей (18-20 г): Ронколейкин и Ингарон по 1200 МЕ, Рефнот 400 МЕ, доксорубицин 32 мкг.
Результаты. Оптимальной комбинацией оказалась Рон-колейкин + Ингарон, которая как в ходе введения, так и после его окончания вызывает торможение роста опухоли на
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
30-38% по сравнению с контролем. При применении данной комбинации наблюдается выраженный (100%) антиметастатический эффект, т. е. полное отсутствие метастазов у животных, тогда как в контрольной группе они выявлены у 60% мышей в количестве 12 (9 в легких и 3 в селезенке). Торможение роста опухоли сопровождается морфологически регистрируемыми дистрофическими изменениями опухолевых клеток и выраженной лейкоцитарной инфильтрацией. Морфологическое исследование тимуса выявило развитое корковое вещество с плотным расположением тимоцитов, что свидетельствует об активном состоянии Т-клеточного звена иммунитета, которое подтверждается результатами субпопуляционного анализа спленоцитов: содержание Т-клеток было выше контроля (60,33±1,42% против 46,1±2,06%) за счет ТИ. При этом уровень ТИ у мышей данной группы был максимальным среди животных всех групп, составляя 47,9±1,5%, тогда как в других он колебался от 15 до 35%. Все указанные различия статистически достоверны, р < 0,05. По-видимому, стимуляция Х-клеточного звена в данной группе происходит преимущественно под действием Ронколейкина, который обнаруживает аналогичный эффект и при паратуморальном введении в монорежиме. Однако введение одного Ронколейкина не вызывает торможения роста опухоли и только частично ингибирует развитие метастазов. Добавление к комбинации Ронко-лейкин + Ингарон третьего иммуномодулятора Рефнота не приводит к дальнейшей положительной динамике: антиметастатический эффект сохраняется, но составляет 95,4% на фоне незначительного торможения роста меланомы. Сравнение групп, получавших Доксорубицин в монорежиме и Доксорубицин с Ронколейкином, показывает, что Ронколейкин усиливает торможение опухолевого роста как в процессе введения (-27 против -16,2%), так и на момент эвтаназии (-11,55 против +1,9%), но не оказывает значимого влияния на метастазирование в данной комбинации. Иммунологические показатели в комбинации Ронколей-кин + Доксорубицин обнаруживают динамику, аналогичную таковой в других группах, получавших Ронколей-кин (повышение уровня Т-клеток за счет ТИ и снижение В-клеток по сравнению с контролем), в то время как Доксорубицин вызывает депрессию Х-клеточного звена.
Заключение. Проведенные исследования свидетельствуют об антиметастатическом и иммуномодулирую-щем эффекте паратуморального применения комбинации Ронколейкин + Ингарон в эксперименте, а также
0 целесообразности ее использования в лечении онкологических больных. Дальнейший поиск может выявить и другие эффективные сочетания иммунопрепаратов, что позволит оптимизировать цитокинотерапию и уточнить ее роль и место в комплексном лечении злокачественных опухолей, в том числе в комбинации с химиотерапией.
РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОМА В ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА: ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ
Зотова А.1, 3, Лопатухина Е.1, 3, Мазуров Д.1, 2 3
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 ГНЦ«Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия
3 Институт биологии гена РАН, Москва, Россия
Программируемые эндонуклеазы вносят разрыв в определенном участке ДНК, который подвергается репарации в клетках по механизму негомологичного со-
единения концов (NHEJ), что, как правило, приводит к нокаутированию гена, или по механизму гомологичной рекомбинации (HDR), если присутствует ДНК-донор, который точно замещает участок поврежденного генома (knock-in). Редактирование генома лимфоидных клеток человека представляет собой сложную задачу из-за низкой трансфекционной способности этих клеток. Дополнительные трудности вносит неэффективная репарация ДНК-разрывов путем HDR. Тем не менее, интерес к редактированию генома лимфоидных клеток не угасает, что связано, прежде всего, с необходимостью лечения различных наследственных иммунодефицитов и ВИЧ-инфекции.
Перед нами стояла задача оценить эффективность и динамику получения нокаута и нокина в линиях T- и B-клеток человека посредством изменения матрицы для репарации ДНК, локусов ДНК-мишеней и типов геномных нуклеаз. Используя нуклеазу, содержащую домены «цинковых пальцев» (ZFN), мы сконструировали клеточные линии Jurkat и CEM с геномом вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), интегрированным в локус AAVS1. При дополнительной трансфекции вспомогательными векторами такие клетки стабильно производят вирусные частицы. Также было показано, что применение как ZFN, так и CRISPR/Cas9 технологии в равной степени эффективно для получения нокаутов в лимфоидных клетках. Однако нами было отмечено значительное снижение on-target активности высокоточной нуклеазы eCas9 1.1, работающей как никаза. Таким образом, для изучения функциональной роли генов в лимфоидных клетках необходимо учитывать баланс между эффективностью нукле-азы в отношении целевого гена и ее off-target (побочной) активностью.
Работа была выполнена при поддержке гранта РНФ «Поиск новых факторов рестрикции ВИЧ-1, ограничивающих репликацию вируса в условиях его межклеточной трансмиссии, путем скрининга библиотеки нокаутов GeCKO» 15-15-00135.
ОЦЕНКА УРОВНЕЙ ЦИТОКИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ В СУПЕРНАТАНТАХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ
Зурочка А.В.1, 2, Зурочка А.В.1, 2, Дукардт В.В.1, Зуева Е.Б.1, Добрынина М.А.1, Тяпаева Я.В.3, Гриценко В.А.3, 4
1ФГБУН«Институт иммунологии и физиологии» УрО РАН, Екатеринбург, Россия
2 ФГАОУ ВО «Южно-Уральский государственный университет» (Национальный исследовательский университет), Челябинск, Россия
3 ФГБУН«Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза» УрО РАН, Оренбург, Россия
4 ФГБУН «Оренбургский научный центр» УрО РАН, Оренбург, Россия
Введение. Инфицирование тканей макроорганизма бактериальными агентами сопровождается развитием воспалительной реакции, в регуляции которой участвуют различные цитокины, вырабатываемые клетками иммунной системы. В то же время в опытах in vitro нами было показано, что бактерии и супернатанты их бульонных культур при контакте с нейтрофилами существенно влияют на продукцию фагоцитами ци-токинов, причем направленность (стимулирование/ ингибирование) и выраженность этих эффектов зависели от видовой принадлежности микроорганизмов
