CC BY
25
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2009. - Вип. 17, т. 3. - С. 66-70. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Ecology. - 2009. - Vol. 17, N 3. - P. 66-70.
УДК 546.719:54.024:577.1
К. В. Парамонова, Д. Є. Єгорова, О. Ю. Ключівська, Р. С. Стойка, Н. І. Штеменко
Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара Український державний хіміко-технологічний університет Інститут клітинної біології НАНУ
ВПЛИВ ЛШОСОМНИХ ФОРМ РЕНІЙ-ПЛАТИНУ ПРОТИПУХЛИННОЇ СИСТЕМИ НА АНТИПРОЛІФЕРАТИВНУ АКТИВНІСТЬ РАКОВИХ КЛІТИН
Уперше показано антипроліферативну активність реній-платинової системи на клітинах раку крові людини СЕМ-Т4. Найефективнішими виявилися експерименти, де використовувались обидва компоненти системи. Показано також перевагу ліпосомних форм порівняно з розчинами препаратів та переважний апоптотичний механізм загибелі клітин під дією системи.
Е. В. Парамонова, Д. Е. Егорова, О. Ю. Ключивская, Р. С. Стойка, Н. И. Штеменко
Днепропетровский национальный университет им. Олеся Гончара Украинский государственный химико-технологический университет Институт клеточной биологии НАНУ
ВЛИЯНИЕ ЛИПОСОМНЫХ ФОРМ РЕНИЙ-ПЛАТИНА ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ СИСТЕМЫ НА АНТИПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ РАКОВЫХ КЛЕТОК
Впервые показана антипролиферативная активность рений-платиновой системы на клетках рака крови человека СЕМ-Т4. Наиболее эффективными оказались эксперименты, где использовались оба компонента системы. Показано также преимущество липосомных форм в сравнении с растворами препаратов и преимущественный апоптотический механизм гибели клеток под действием системы.
KV. Paramonova, D. E. Yegorova, O. U. Klyuchivska, R. S. Stoika, N. I. Shtemenko
Oles’ Gonchar Dnipropetrovs’k National University Ukrainian State Chemical-Engineering University, Institute of Cell Biology NASU
INFLUENCE OF LIPOSOME FORMS OF RHENIUM-PLATINUM ANTI-TUMOR SYSTEM ON THE PROLIFERATIVE ACTIVITY OF CANCER CELLS
First the antiproliferative activity of the antitumor system rhenium-platinum on the human blood cancer cells СЕМ-Т4 was shown. Experimental administration of both components of the system showed the most effectiveness. The advantages of liposomic forms in comparison with preparations solutions and dominating apoptotic mechanism of the cancer cells death under the treatment by the system were shown.
Вступ
Раніше нами було показано ефективність реній-платинової системи, що полягала у введенні одноразово розчину цисплатину та кластерної сполуки ренію за схемою
© К. В. Парамонова, Д. Є. Єгорова, О. Ю. Ключівська, Р. С. Стойка, Н. І. Штеменко, 2009 66
антиоксидантної терапії ([Re-P^-сисгема) [б; S; 9]. Проте здатність до пригнічення системою росту пухлини була продемонстрована на видоспецифічній карциномі щурів. Подальше впровадження перспективних кластерних сполук в онкологічну практику неможливе без вивчення впливу сполук ренію окремо та всієї системи Re-Pt на життєздатність і проліферативну активність ракових клітин людини [3; 5]. Відомо, що кластерні сполуки ренію нестійкі у водних розчинах і для введення їх в організм необхідна їх капсуляція у ліпосоми [4]. Отже, мета роботи - оцінити антипроліферативну активность розчинів та ліпосомних форм цисплатину, кластерної сполуки ренію та системи Re-Pt на проліферативну активність ракових клітин людини.
Матеріал і методи досліджень
Вивчали кластерну сполуку ренію з органічними лігандами (КРОЛ) Re2(i-C3H7COO)4Cl2-Re (Re-isob) та цисплатин (cisPt) у розчинній та ліпосомній формах, синтезовані в Українському державному хіміко-технологічному університеті на кафедрі неорганічної хімії [7].
Клітини лінії CEM-T4 лейкемічних лімфоцитів людини отримані із спеціалізованої колекції клітинних ліній та клонів Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України (Київ). Клітини культивували у скляних 20 см2 культуральних флаконах Карреля у середовищі RPMI іб40 (Sigma, США) з додаванням і0 % сироватки крові плодів великої рогатої худоби (Sigma, США). Пасажування клітин здійснювали у співвідношенні і : 5 через 2-3 доби. Для проведення дослідів клітини висівали на пластикові 24-лункові планшети (SARSTED, США) в кількості 5 x і05 клітин на лунку. Проміжні розведення водних препаратів досліджуваних речовин готували на безсироватковому середовищі RPMI іб40 і вносили в лунки до кінцевої концентрації і0-9-і0-5 М залежно від умов досліду.
Для оцінки життєздатності клітин до і 00 мкл суспензії додавали і0 мкл і % розчину трипанового синього (Sigma, США), інкубували протягом 2-3 хв. 20 мкл забарвленої суспензії клітин вносили в камеру Горяєва та здійснювали підрахунок живих і мертвих клітин на мікроскопі МікМед-і2 (ЛОМО, Санкт-Петербург, Росія) при збільшенні ~200 разів. За цих умов живі клітини відрізнялися від нежиттєздатних (мертвих) тим, що не поглинали барвник. До і00 мкл суспензії клітин, отриманої як було описано вище, додавали і мкл і % розчину акридину оранжевого (область збудження 3б0-4б0 нм та емісії 4S0-700 нм, АО, Sigma, США), інкубували протягом 20-30 хвилин 20 мкл забарвленої суспензії клітин, вносили в камеру Горяєва та рахували живі, апоптичні та мертві клітини на люмінесцентному мікроскопі МікМед-і2 при збільшенні x400 в області збудження 450-4S0 нм і емісії 500-530 нм. За цих умов клітини розрізняли за розподілом кольорів у цитоплазмі та морфологією ядер [і; 2]. Статистичний аналіз отриманих даних проводили з використанням t-критерію Стьюдента, з оцінкою вірогідності отриманих результатів на рівні значимості не менше р < 0,05. Дані виражали у вигляді М ± m.
Результати та їх обговорення
Використовуючи розчини металоорганічних сполук, вдалося показати, що вже на першу добу ефективними антипроліферантами були як сполуки ренію і цисплатину, так і система cisPt + Re-isob та Re-isob (рис. і).
При цьому відбувалось гальмування системою проліферативної активності в концентраціях і0-§ та і0-7 моль/л відповідно на б5,9 та 70,4 %. Re-isob на першу добу знижував проліферативну активність лінії СЕМ-Т4 в аналогічних концентраціях на 42,3 %.
100
&
£
£
с
£
с
и
о4
80 -
60 -
40
20
0
□ СІїзРІ, розчин
□ Яе-І8оЬ, розчин
□ Яе-І8оЬ+СІ8Р1, розчин
2 3
Концентрація, моль/л
Рис. 1. Антипроліферативна активність системи Яе-Р! та її компонентів у розчинах у різних концентраціях на першу добу після внесення препаратів у культуру клітин СЕМ-Т4:
К - контроль; 1 - 10~9 моль/л; 2 - 10-8 моль/л; 3 - 10~7 моль/л; 4 - 10~6 моль/л; 5 - 10-5 моль/л;
* - вірогідна різниця порівняно з групою контролю,р < 0,05; ** - вірогідна різниця порівняно з групою контролю,р < 0,01; *** - вірогідна різниця порівняно з групою контролю,р < 0,001
На другу добу дія системи СІ8Р + Яе^оЬ в ліпосомній формі (рис. 2) виявилася набагато ефективнішою, ніж у розчинній. У концентрації 10-8 моль/л кількість клітин під дією системи сІ8р + Яе-І8оЬ у ліпосомній формі знижувалась на 85 %, тоді як при концентрації 10-7 моль/л відбувалось 100 % гальмування життєздатності клітин. Дія окремих компонентів системи (як Яе-І8оЬ, так і СІ8Р) була менш ефективною. Найефективнішою виявилася дія Яе-І8оЬ у концентраціях 10-6 та 10-5 моль/л, при цьому кількість клітин знизилась на 67,3 та 65,3 %.
§100
С
&
Н X §80 о
60
з40
« 20 .4
£
0
ненавантажені ліпосоми сізРі ІІр
□ Ие^оЬ, ІІр
■ сізРі+Ие-ізоЬ, ІІр
2 3
Концентрація, моль/л
Рис. 2. Антипроліферативна активність системи Яе-Р та її компонентів у ліпосомній формі у різних концентраціях на другу добу після внесення препаратів у культуру клітин СЕМ-Т4:
позначення див. рис. 1
Для дослідження механізму загибелі СЕМ-Т4 виконано підрахунок кількості апоптичних і некротичних клітин у проведених експериментах (табл.). З’ясування механізму дії препаратів показало, що загибелі клітинної лінії СЕМ-Т4 властиві обидва шляхи клітинної смерті. У високій концентрації сІ8р діє як некротичний агент, а за низької концентрації діють обидва механізми загибелі. Переведення СІ8Р у ліпосомну форму не змінює цієї закономірності. Така сама закономірність характерна і для Яе-І8оЬ. Якщо цисплатин відомий цитостатик, то антипроліферативна дія для Яе-І8оЬ показана нами вперше. Слід звернути увагу на те, що величини кількості загиблих
клітин для обох препаратів порівняно однакові, що свідчить про перспективність використання ренієвих сполук у антиракових дослідженнях, особливо з огляду на їх малотоксичність для ссавців.
Таблиця
Кількість загиблих клітин СЕМ-Т4 за механізмом апоптозу і некрозу (% до загальної кількості клітин) на другу добу експерименту
№ Варіант експерименту Апоптоз Некроз
1 сІ8ІЧ, 10-6 моль/л, розчин 20,00 ± 1, 23 46,67 ± 2,33
2 сізРЧ, 10-9 моль/л, розчин 14,70 ± 0,73 8,82 ± 0,43
3 сізРЧ, 10-6 моль/л, ліпос. форма 0 43,75 ± 2,18
4 сізРЧ, 10-9 моль/л, ліпос. форма 11,40 ± 3,00 11,90 ± 0,59
5 Яе^оЬ, 10-6 моль/л, розчин 0 30,77 ± 1,53
6 Яе-І8оЬ, 10-9 моль/л, розчин 7,50 ± 0,37 12,50 ± 0,62
7 Яе^оЬ, 10-6 моль/л, ліпос. форма 12,50 ± 0,62 43,75 ± 2,18
8 Яе^оЬ, 10-9 моль/л, ліпос. форма 8,80 ± 0,43 14,70 ± 0,73
9 сізРЧ + Яе-І8оЬ, 10-6 моль/л, розчин 75,00 ± 3,75 10,00 ± 0,50
10 СІ8рЧ + Яе-І8оЬ, 10-9 моль/л, розчин 30,23 ± 1,51 7,70 ± 0,38
11 сІзРЧ + Яе^оЬ, 10-6 моль/л, ліпос. форма 3,33 ± 0,16 60,00 ± 3,00
12 сІзРЧ + Яе^оЬ, 10-9 моль/л, ліпос. форма 0 16,67 ± 0,83
Використання системи 0І8Р + Яе-І8оЬ у розчинах призводить до переважно апоптотичного механізму загибелі клітин, що на теперішній час розвитку тематики не має обґрунтованого пояснення. Очевидно, що використання системи ініціює в клітині сигнальні шляхи, які призводять до обох шляхів клітинної смерті, що і веде до максимальних ефектів смертності ракової клітини. Капсуляція системи 0І8Р + Яе-І8оЬ у ліпідну оболонку змінює цю закономірність і спричиняє некроз, аналогічно до дії самого цисплатину. Це може бути пояснено тим фактом, що всередині ліпосоми речовини існують у квазі-кристалічному стані, коли концентрація кожного компонента набагато перевищує можливу концентрацію у розчині. У такому стані можуть працювати ефекти зближення, або й хімічні взаємодії, що можуть змінювати або й інактивувати деякі реакційні сайти молекул.
Висновки
За дії на клітини лейкемії людини СЕМ-Т4 ефективними антипроліферантами були як сполуки ренію і цисплатину, так і система 0І8Р + Яе-І8оЬ; найефективнішим виявилося застосування системи єібРі + Яе-І8оЬ у ліпосомній формі. Ліпосомні форми мали перевагу порівняно з розчинами препаратів. Показано некротичний і апоптотичний механізми загибелі клітин під дією компонентів і системи єібРі + Яе^оЬ. Апоптотичний механізм загибелі максимально реалізується при застосуванні системи у розчині.
Бібліографічні посилання
1. Культура животных клеток. Методы / Под ред. Р. Фрешни. - М. : Мир, 1989. - С. 58-79.
2. Молекулярная биология клетки / Б. Албертс, Д. Брей, Д. Льюис и др. - Т. 15. -М. : Мир, 1994. -С. 135-180.
3. Токсикологія сполук ренію: погляд на проблему / С. А. Олійник, Н. І. Штеменко, Н. О. Горчакова и др. // Современные проблемы токсикологии. - 2001. - № 1. - С. 11-15.
4. Штеменко Н. І. Вивчення впливу ліпідної складової ліпосом на стійкість еритроцитів / Н. І. Штеменко, М. А. Зеленюк, О. В. Штеменко // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2004. - Вип. 14, т. 1. - С. 195-199.
5. Якубовская Р. И. Современные представления о молекулярных механизмах канцерогенеза и опухолевой прогрессии как основа для разработки новых методов терапии злокачественных новообразований // Российский онкологический журнал. - 2000. - № 6. - С. 42-49.
6. Liposomal forms of rhenium cluster compounds: enhancement of biological activity / N. I. Shtemenko, O. V. Berzenina, D. E. Yegorova, A. V. Shtemenko // Chemistry&Biodiversity. -2008. - N 5. - P. 1660-1667.
7. Shtemenko A. V. Chemistry of binuclear rhenium clusters / A. V. Shtemenko, B. A. Bovykin // Rhenium and Rhenium Alloys. - Pensilvania: TMS Publication, 1997. - P. 189-197.
8. Shtemenko N. Dihlorotetra да-isobutyratodirhenium (III): enhancement of cisplatin action and RBC-stabilizing properties / N. Shtemenko, P. Collery, A. Shtemenko // Anticancer Research. - 2007. -Vol. 27. - P. 2487-2492.
9. Synthesis, characterization, in vivo antitumor properties of the cluster rhenium compound with GABA ligands and its synergism with cisplatin / A. V. Shtemenko, P. Collery, N. I. Shtemenko et al. // Dalton Trans. - 2009. - Vol. 26. - P. 5132-5136.
Надійшла до редколегії 24.11.2009
