CC BY
83
дов Dioscorea deltoidea Wall // Бюл. эксперимент. биологии и медицины. 1998. № 8. С. 178-181.
5. Максимовских С. Ю. Защита картофеля от болезней препаратами группы «стероидные гликозиды» в условиях Курганской области : автореф. дис. ... канд. с/х наук. Краснодар, 2012. 24 с.
6. Grigorovich M. A., Kudrin B. I., Evdocimov A. N. Investigation of chronic toxicity of furostanolic steroidal glycosides from semen Capsicum annum L. // Bitehno-
logii avansate-realizari si perspective. III Simpozion national cu participare international. Chisinau, 2013. Р. 47.
7. Меньщиков В. В. Лабораторные методы исследования в клинике : справочник. М. : Медицина, 1987. 368 с.
8. ГублерЕ. В., Генкин А. А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л. : Медицина, 1973. 144 с.
9. Лакин Г. Ф. Биометрия. М. : Высш. шк., 1973. 343 с.
УДК 579.835+581.19
ВЛИЯНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ АЗОСПИРИЛЛ НА СОДЕРЖАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ИЗОФОРМ ПЕРОКСИДАЗЫ В КОРНЯХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ
Л. В. Косицына, С. А. Коннова, А. А. Галицкая, Ю. П. Федоненко1, Е. П. Шувалова
Саратовский государственный университет 1Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратоа E-mail: [email protected]
Приведены данные по определению содержания гваяколзависи-мой и о-фенилензависимой пероксидаз в корнях 2-суточных проростков пшеницы, выращенных в присутствии препаратов ЛПС ассоциативных диазотрофных ризобактерий A. brasilense Sp107 и S17. Показано увеличение активности гваяколовой пероксидазы, вызванное полисахаридами обоих штаммов. Выявлены штаммо-вые различия в действии ЛПС на содержание кислых и нейтральных фракций о-фенилензависимой пероксидазы. Ключевые слова: пшеница, пероксидаза, Azospirillum, липопо-лисахарид.
Effect of Azospirillum Lipopolysaccharides on the Content of Various Peroxidase Isoforms in Wheat Seedling Roots
L. V. Kositsyna, S. A. Konnova, A. A. Galitskaya, Yu. P. Fedonenko, Ye. P. Shuvalova
Data are presented on the content of guaiacol- and о-phenylene peroxidases in the roots of 2-day-old wheat seedlings grown in the presence of the lipopolysaccharides of the associative diazotrophic rhizobacteria A. brasilense Sp107 and S17. It was shown that the activity of guaiacol peroxidase increased under the effect of polysaccharides from both strains. Strain differences in LPS action on the content of acidic and neutral fractions of о-phenylene peroxidase were detected. Key words: wheat, peroxidase, Azospirillum, lipopolysaccharide.
Особую роль в реализации ответных реакций растений на биотический стресс играет суперсемейство пероксидаз (КФ 1.11.1.7). Благодаря широкому спектру изоферментов, пероксидаза
активно реагирует на стрессовые воздействия. К числу биогенных элиситоров, вызывающих индукцию синтеза этих защитных ферментов, относят олигосахариды, белки, гликопротеины и липиды. Некоторые элиситоры обнаружены в среде роста микроорганизмов, другие - в составе клеточных стенок и в содержимом цитоплазмы [1]. Подобную реакцию у растений могут вызывать полисахариды и липополисахариды (ЛПС) внешней мембраны грамотрицательных бактерий [2, 3]. Известно изменение ее активности в растительной ткани в ответ на действие различных стрессовых факторов, в том числе метаболитов потенциально опасных для растения фитопатогенных микроорганизмов. Практически не исследован вопрос о том, какие ответные реакции растений вызывает обогащение почвы бактериальными полисахаридами непатогенных бактерий.
Бактерии рода AzospmUum, распространенные в почвах прикорневой зоны широкого круга растений, являются диазотрофами, стимулирующими рост и развитие растений, благодаря потенциально высокой азотфиксирующей активности. Данные бактерии способны продуцировать фитогормоны и иные физиологически активные вещества. Большой научный и практический интерес представляют ассоциации бактерий A. brаsilense со злаками, в частности с пшени-
© Косицына Л. В., Коннова С. А., Галицкая А. А., Федоненко Ю. П., Шувалова Е. П., 2014
цей, в процессе формирования которых важная роль отводится поверхностным гликополимерам бактерий, в том числе и ЛПС [4].
Целью нашей работы было выявление влияния препаратов ЛПС Azospirillum brasilense Sp107 и S17 на изменение содержания феноловых пероксидаз в корнях проростков пшеницы сорта Саратовская 29.
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования служили препараты ЛПС двух штаммов бактерий A. brasilense Sp107 и S17. ЛПС получали стандартной процедурой экстракции горячим водным фенолом [5]. После диализа экстракты концентрировали на роторном испарителе и титровали 40%-ной ТХУ до рН 2.7, что приводило к выпадению в осадок примеси нуклеиновых кислот и белка. Экстракты вновь диализовали против дистиллированной воды и лиофилизировали.
В качестве растительных объектов использовали пшеницу сорта Саратовская 29 (2009 г. генерации), любезно предоставленную ГНУ НИ-ИСХ Юго-Востока Россельхозакадемии. Перед стерилизацией зерна промывали детергентом, затем помещали на 1 мин в 70%-ный водный раствор этилового спирта, после чего промывали стерильной дистиллированной водой. Затем семена погружали на 5 мин в диацид и вновь промывали стерильной дистиллированной водой. Контроль стерильности зерен осуществляли, выдерживая их в чашках Петри на мясопептонном агаре 24 ч при 25°С [6].
Растворы препаратов ЛПС готовили в концентрации 0.125 мг/мл в стерильной дистиллированной воде. Стерильные семена выкладывали между двумя слоями фильтровальной бумаги, пропитанными этими растворами и выращивали в течение 2 сут при 25°С [7]. Контролем служили проростки пшеницы, выращенные на стерильной дистиллированной воде.
Для определения содержания пероксидаз использовали модифицированную методику. Грубый белковый экстракт для определения содержания феноловых пероксидаз получали путем гомогенизации корней проростков в 0.01М Ш-фосфатном буфере, рН 6.0 (ФБ). Отношение массы навески к объему ФБ было 1:3. Экстракт центрифугировали 25 мин при 12000 g на центрифуге MiniSpin («Eppendorf», Германия). Содержание пероксидазы в реакционной смеси из 0.5 мл 0.05%-ного раствора гваякола (2,6-ди-бромфенола), 200 мкл 0.25%-ной Н2О2 и 2 мл супернатанта оценивали, измеряя с помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-4 оптическую
плотность при X = 470 нм. Контроль готовили аналогичным образом, но без добавления перекиси водорода [8].
В качестве субстратов для исследования содержания феноловых пероксидаз использовали гваякол и о-фенилендиамин (ОФДА). Содержание феноловых пероксидаз определяли по калибровочной кривой, построенной по пероксидазе хрена [3].
Для выделения анионной пероксидазы к грубому белковому экстракту дробно добавляли по 200 мг хитина. Отношение массы навески к объему Ка-фосфатного буфера было 1:3. После 10 мин инкубации получали нейтральные фракции пероксидаз из надосадочной жидкости. Анионную пероксидазу элюировали с хитина 1М NaCl и количественно определяли микрометодом [9]. В плоскодонные планшеты заливали 0.075 мл экстракта из корней проростков, 0.025 мл раствора ОФДА в концентрации 0.5 мг/мл и добавляли 0.025 мл Н2О2 (конечная концентрация 0.0015%). Реакцию останавливали добавлением 0.05 мл 4н H2SO4. Планшет сканировали на иммуноферментном анализаторе Multiscan Ascent при X = 492 нм. Обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения Ascent Software для Multiscan Ascent («Thermo Electron», Китай). Содержание белка в препаратах определяли микрометодом по модифицированной методике Бредфорд [10].
Электрофорез образцов проводили на приборе для вертикального гель-электрофореза в пластинах полиакриламидного геля, используя систему буферных растворов Лэммли [11].
Результаты и их обсуждение
Для реализации цели исследования определяли содержание гваяколзависимой и о-фени-лензависимой пероксидаз в корнях 2-суточных проростков пшеницы, выращенных в присутствии препаратов ЛПС бактерий A. brasilense Sp107иS17.
Штамм A. brasilense Sp107 был выделен из корней пшеницы (Triticum aestivum L.), а A. brasilense S17 - из ризосферы проса жемчужного (Pennisetum glaucum). Для анализируемых препаратов ЛПС ранее были обнаружены незначительные отличия в биополимерном составе. Так, в ЛПС штамма Sp107 было показано более высокое (~ в 1.5 раза) содержание углеводов и отсутствие фосфатов, в то время как ЛПС A. brasilense S17 характеризовался присутствием 3.3 % фосфора [12, 13]. Необходимо отметить, что при сходном составе жирных кислот липидов А повторяющиеся звенья
О-специфических полисахаридов (ОПС) ЛПС исследуемых штаммов отличаются кардинально. ОПС штамма A. brasilense Бр107 является линейным полимером Б-рамнозы [13], представителем широко распространённой серогруппы азоспирилл, среди которых выявлены эндо-фитные для пшеницы культуры. В то же время в составе ОПС A. brasilense Б17 установлено наличие двух типов повторяющихся звеньев: тетрасахаридного глюкорамнана, состоящего из трех остатков Ь-рамнозы в основной и остатка
А, мкг/мл 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0
Б-глюкозы в боковой цепи, и разветвленного три-сахаридного из остатков 2-О-метил-Ь-рамнозы, 2-дезокси-2[(Б)-3-гидроксибутаноиламино] маннозы и терминального остатка 2-дезокси-2-ацетамидоглюкозы [14].
Выращивание растений в присутствии ЛПС азоспирилл привело к увеличению содержания гваяколовой пероксидазы в экстракте проростков пшеницы в 1.6 раза по сравнению с контролем. При этом достоверных различий в активности между препаратами ЛПС не выявлено (рис. 1).
[] Контполь
Щ ЛПС A. brasilense S17 ¡3 ЛПС A. brasilense Sp107
Бактериальные ЛПС
Рис. 1. Влияние ЛПС бактерий Л. brasilense на содержание гваяколзависимой пероксидазы (КФ 1.11.1.7) в экстрактах проростков пшеницы Саратовская 29 (А - содержание пероксидазы, мкг/мл)
Гваяколовая пероксидаза, окисляющая фе-нольные соединения, участвует в биосинтезе лигнина, поэтому повышение ее активности может быть как результатом включения анти-оксидантной защиты, так и проявлением неспецифических реакций на стресс, связанных с укреплением клеточных стенок [15].
Содержание пероксидазы возрастает при многих изменениях метаболизма, а многие ее изоформы синтезируются при стрессовых влияниях de novo [16]. Поэтому мы оценили содержание кислых и нейтральных фракций о-фенилензависимой пероксидазы, разделив их с помощью хроматографических методов. Результаты электрофоретического анализа в полиакриламидном геле выделенных фракций о-фенилензависимой пероксидазы, представленные на рис. 2, показывают различия в их полипептидных профилях в контрольных образцах. Проращивание семян пшеницы в присутствии бактериальных полисахаридов привело к количественным и качественным изменениям электро-
форетических характеристик полипептидов в экстрактах корней.
Количественное содержание о-фенилензависимой пероксидазы во фракциях определяли микрометодом в планшетах для иммунофер-ментного анализа (рис. 3 и 4). Из данных, представленных на гистограммах, следует, что под воздействием ЛПС Л. brasilense Б17 содержание нейтральной и кислой фракций пероксидаз достоверно не изменилось по сравнению с контролем. В то время как препарат ЛПС Л. brasilense Бр107 вызывал увеличение содержания изопе-роксидазы нейтральной - в 2 раза и кислой - в 2.6 раза. Эти данные кореллируют с результатами электрофореза ( см. рис. 2).
Анионные пероксидазы характеризуются свойством связываться с хитином клеточных стенок фитопатогенных грибов, что, вероятно, объясняется наличием у этого фермента полиса-харид-связывающего домена [17]. Полученный результат соответствует литературным данным о том, что активация основных пероксидаз
37553724083137313755374937
Рис. 2. Электрофорез белков в ПААГ нейтральных (1-3) и кислых (4-6) фракций о - фенилензависимой пероксидазы: 1, 4 - контроль (Н2О дист.); 2, 5 - ЛПС А. Ътаъйете Б17; 3, 6 - ЛПС А. Ътаьйете Бр107; Ь]^ -маркеры молекулярных масс
А, мкг/мл 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
□ Контроль
@ ЛПС А. ЪгаэИете 817 0 ЛПС А. ЪгаэИете 8р107
Бактериальные ЛПС
Рис. 3. Влияние ЛПС бактерий А. Ътазйете на содержание о-фенилензависимой пероксидазы (нейтральные фракции) (КФ 1.11.1.7) в корнях проростков пшеницы Саратовская 29 (А - содержание пероксидазы, мкг/мл)
А, мкг/мл 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1
0.5 0
□ Контроль
ЛПС А. Ъrasilense 817
0 ЛПС А. Ъга.к1ете 8р107
Бактериальные ЛПС
Рис. 4. Влияние ЛПС бактерий А. Ъта5йете на содержание о-фенилензависимой пероксидазы (кислые фракции) (КФ 1.11.1.7) в корнях проростков пшеницы Саратовская 29 (А - содержание пероксидазы, мкг/мл)
приводит к увеличению активности кислых фракций [16]. Поэтому можно предположить, что активация этих изоформ происходит под действием поверхностных полисахаридов бактерий штамма-изолята из растений пшеницы (Sp107), как более селективного и, возможно, воспринимающегося растением как потенциальный эндофит.
При этом следует отметить, что обработка семян бактериальными полисахаридами в большинстве случаев приводит к увеличению содержания белка в корнях проростков (таблица). Произошло существенное увеличение содержания белка в кислых и нейтральных фракциях экстрактов под влиянием ЛПС A. brasilense Sp107 в 8 и 8.7 раз соответственно, а под воздействием ЛПС A. brasilense S17 — в 15 и 13.6 раз соответственно. Можно предположить, что эти препараты вызывали проявление защитных реакций в растительных клетках, следствием которых оказался синтез различных пептидных и белковых соединений, в том числе и фермента пероксидазы. Более низкую активность ЛПС A. brasilense Sp107 в отношении индукции синтеза белка проростками пшеницы можно объяснить тем, что этот полисахарид оказывает влияние не только на содержание, но и на активность пероксидазы, вызывая синтез наиболее активных ее изоформ.
Содержание белка в корнях проростков пшеницы Саратовская 29, выращенных в присутствии липополисахаридов азоспирилл
Вариант опыта Содержание белка, мкг/мл
кислые фракции нейтральные фракции
Контроль, без ЛПС 0.8±0.1 1.2±0.1
ЛПС A. brasilense S17 11.3±1.1 16.5±1.0
ЛПС A. brasilense Sp107 5.9±1.3 10.6±1.1
Примечание. Приведены результаты измерений 6 экспериментов; доверительный интервал приведен для надежности 95%.
Полученные результаты показали, что ответные реакции растений с участием перок-сидаз могут формироваться на поверхностные полисахариды не только патогенных микроорганизмов, но и на потенциально полезных, отнесённых к группе бактерий, стимулирующих рост растений. Кроме того, учитывая, что одним из перспективных направлений современной фитоиммунологии является поиск индукторов формирования у растений устойчивости к бо-
лезням и стрессам, возможно использование бактериальных полисахаридов непатогенных микроорганизмов р. Azospirillum для этих целей.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках базовой части (код проекта: 1287), а также при частичной поддержке РФФИ (проект № 14-04-01658 А).
Список литературы
1. Перковская Г. Ю., Кравчук Ж. Н., Гроздинский Д. М., Дмитриев А. П. Индукция активных форм кислорода и фитоалексинов в культуре клеток лука (Allium cepa) биогенными элиситорами из гриба Botrytis cinerea II Физиология растений. 2004. Т. 51, № 5. С. 680-685.
2. Dow M., Newman M. A., von Roepenack E. The induction and modulation of plant defence responses by bacterial lipopolysaccharides II Ann. Rev. Phytopathol. 2000. Vol. 38. P. 241-261.
3. Стадник Г. И., Калашникова Е. Е., Коннова С. А., Игнатов В. В. Роль поверхностных и внеклеточных соединений бактерии Xantomonas campestris в патогенных взаимоотношениях с растениями капусты II Микробиология. 2001. Т. 70, № 2. С. 270-274.
4. Konnova S. A., Makarov O. E., Skvortsov I. M., Igna-tov V. V. Isolation, fractionation and some properties of polysaccharides produced in a bound form by Azospirillum brasilense and their possible involvement in Azospirillum - wheat root interaction II FEMS Microbiol. Lett. 1994. Vol. 118, № 2. P. 93-99.
5. Вестфаль О., Янн К. Бактериальные липополисаха-риды II Методы химии углеводов. М. : Мир, 1967. С. 325-332.
6. Рубин Б. А., Зеленова И. В. Влияние разных штаммов ВТМ на содержание пигментов и активности железосодержащих ферментов в листьях Nicotiana tabacum L. II Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология, почвоведение. 1964. № 6. С. 46-50.
7. Викторов С. И. Практикум по физиологии растений I под ред. проф. И. И. Гунара. М. : Колос, 1972. 168 c.
8. Бурханова Г. Ф., Ярулина Л. Г., Максимов И. В. Регуляция хитоолигосахаридами защитных реакций растений пшеницы при инфицировании Bipo-laris sorokiniana II Физиология растений. 2007. Т. 54, № 1. С. 119-126.
9. Юсупова З. Р., Ахметова И. Э., Хайруллин Р. М., Максимов И. В. Влияние хитоолигосахаридов на образование перекиси водорода и активность анионных пероксидаз в колеоптилях пшеницы II Физиология растений. 2005. Т. 52, № 2. С. 238-242.
10. СкоупсР. Методы очистки белков. М. : Мир, 1985. 315 с.
11. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 II Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.
12. Игнатов В. В., Коннова О. Н., Бойко А. С., Фомина А. А., ФедоненкоЮ. П., Коннова С. А. Характеристика состава жирных кислот липидов А липополи-
сахаридов бактерий рода Azospirillum // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2009. Т. 9, вып. 1. С. 36-41.
13. Бойко А. С., Смолькина О. Н., Федоненко Ю. П., Здоровенко Э. Л., Качала В. В., Коннова С. А., Игнатов В. В. Особенности структуры О-полисахаридов азоспирилл серогруппы I // Микробиология. 2010. Т. 79, № 2. С. 219-227.
14. Fedonenko Yu. P., Konnova O. N., ZdorovenkoE. L., Konnova S. A., Zatonsky G. V., ShashkovA. S., Ignatov V. V., Knirel Y. A. Structural analysis of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense S17 // Carbohydr. Res. 2008. Vol. 343. P. 810-816.
УДК 616.9:616-07
О. А. Волох1, Е. М. Кузнецова1, А. А. Щербаков2
1Российский научно-исследовательский институт «Микроб», Саратов 2Саратовский государственный аграрный университет
В работе представлены результаты анализа эффективности экспериментальных антительных диагностических препаратов для детекции чумного и туляремийного микробов методами иммунодиагностики. Экспериментальные диагностикумы получены на основе ряда антигенов внешней мембраны туляремийного (про-тективный антигенный комплекс) и чумного (солюбилизирован-ные белки внешней мембраны и S-белок) микробов. Показано, что сконструированные иммуноглобулиновые чумные диагно-стикумы позволяют выявлять штаммы Y.pestis не зависимо от температуры культивирования и плазмидного профиля. Экспериментальные туляремийные диагностикумы позволяют выявлять бескапсульные штаммы F.tularensis и обладают высокой чувствительностью и специфичностью. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования разработанных экспериментальных диагностических препаратов. Ключевые слова: Yersiniapestis, Francisella tularensis, антигены внешней мембраны, иммунодиагностические препараты.
Assessment of Possibility of Use
of the Experimental Immunodiagnostic Preparations
in Laboratory Diagnostics of Plague and Tulyaremiya
O. A. Voloh, E. M. Kuznetsova, A. A. Shcherbakov
In work results of the analysis of efficiency experimental the antitelnykh of diagnostic preparations for detection of plague and tulyaremiyny microbes by immunodiagnostics methods are presented. Experimental diagnosticum are received on the basis of a number of anti-genes of an external membrane of tulyaremiyny (a protective anti-gene complex) and plague (solyubilizirovanny proteins of an external membrane and S-squirrels) microbes. It is shown that designed immunoglobulinovy plague diagnosticum allow to reveal strains of Y.pestis it isn't dependent
15. Алиева Д. Р., Бабаев Г. Г., Азизов И. В. Активность и изоферментный состав пероксидазы // Вктн. Дншропетров. Ун-ту. Бюлопя. Медицина. 2010. Вип. 1, т. 1. С. 16-21.
16. Андреева В. А. Фермент пероксидаза : Участие в защитном механизме растений. М. : Наука, 1988. 128 с.
17. Хайруллин Р. М., Юсупова З. Р., Максимов И. В. Защитные реакции пшеницы при инфицировании грибными патогенами. 1. Взаимодействие анионных пероксидаз пшеницы с хитином и телиоспорами Tilletia caries // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 1. С. 108-113.
on temperature of cultivation and a plazmidny profile. Experimental tulyaremiyny diagnosticum allow to reveal acapsular strains of F.tularensis and possess high sensitivity and specificity. The obtained data testify to prospects of use of the developed experimental diagnostic preparations. Key words: Yersinia pestis, Francisella tularensis, anti-genes of an external membrane, immunodiagnostic preparations.
Разработка новых высокоспецифичных препаратов и эффективных методических подходов для диагностики чумы и туляремии является актуальной научно-практической задачей в связи с высокой эпидемической значимостью этих природно-очаговых инфекций.
У возбудителя чумы нельзя исключать возможность элиминации плазмид и, соответственно, изменения антигенного состава, а также сохранение атипичными штаммами способности вызывать инфекционный процесс, что снижает диагностическую ценность имеющихся препаратов, основанных на детекции видоспе-цифических, детерминируемых плазмидами антигенов чумного микроба. Кроме того, выращенные при 28°С клетки типичных штаммов чумного микроба не выявляются с помощью иммуноглобулиновых препаратов, полученных к капсульному антигену F1, поэтому требуется дополнительное время для культивирования подозрительных на чуму колоний при 37°С. В связи с этим остается актуальной проблема разработки
ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ
© Волох О. А., Кузнецова Е. М, Щербаков А. А., 2014
