CC BY
50
рушения. - М.: СЛОВО, 2003. - 271 с.
6. Rechtshaffen A., Kales A. Manual of standardized terminology, techniques, and criteria for the scoring of УДК 576.893.161.21:615.849.112.19[:612.085.2(045)]
stages of sleep and wakefullness of human subjects. -Washington, DC: US Government Printing Office, 1968. -204 p.
ВЛИЯНИЕ ЛАЗЕРНОГО, СВЧ- И КВЧ-ИЗЛУЧЕНИЙ НА TRYCHOMONAS VAGINALIS В УСЛОВИЯХ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
П. В. Глыбочко, Д. А. Пляченко, В. С. Софьин, А. В. Лобанова
НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии, клиника кожных и венерических болезней, Саратовский государственный медицинский университет
Изучено влияние лазерного, СВЧ- и КВЧ-излучений на жизнеспособность и морфологию Tr. vaginalis в условиях непрерывного его культивирования на жидких средах. Показано, что все виды излучений в терапевтических дозах способствуют увеличению количества клеток. Облучение культуры приводит к изменению формы и к потере подвижности трихомонад. Однако это не является свидетельством снижения их жизнеспособности, поскольку клетки сохраняли способность к интенсивному размножению. Различные дозы излучений не оказывают мутагенного действия на ДНК, что вызывает необходимость пересмотра отношения к этим физиотерапевтическим методам лечения трихомониаза.
Ключевые слова: trychomonas vaginalis, лазерное излучение.
EFFECT OF LASER, MICROWAVE AND EHF-RADIATION ON TRYCHOMONAS VAGINALIS IN CONDITIONS OF CONTINUOUS
CULTURE GROWTH
P. V. Glybochko, D. A. Plyanchenko, V. S. Sofyin, A. V. Lobanova
Abstract. The effect of laser, microwave and EHF-radiation on the viability and morphology of Tr. vaginalis in conditions of growing it continually in liquid media is investigated. It is shown that all kinds of radiations in therapeutic dozes promote an increase in the quantity of cells. The irradiation of culture results in a change of the form and in a loss of mobility of Trichomonas. However, this does not indicate a decrease in their viability as cells preserved their ability for intensive reproduction. Various dozes of radiations have no mutagen action on DNA, which calls for revision of these physiotherapeutic methods of treatment of trichomoniasis.
Key words: trichomonas vaginalis, laser irradiation.
Трихомониаз является одним из распространенных заболеваний мочеполового тракта и занимает ведущее место среди заболеваний, передаваемых половым путем. Инвазия вызывается Trichomonas vaginalis и имеет "космополитический" характер. По данным Всемирной организации здравоохранения, частота заболеваемости трихомониазом в мире составляет ежегодно более 170 млн случаев [10], по Российской Федерации - 340-370 случаев на 100 тыс. населения [6].
В настоящее время при лечении больных острым и хроническим трихомониазом широко используются лазерное, КВЧ- и СВЧ-излучения. В литературе имеется ряд работ по изучению воздействия этих излучений на прокариотиче-ские организмы - патогенные и непатогенные бактерии [1, 2, 5]. Однако сведений о воздействии данных излучений на Tr. vaginalis не имеется. Между тем этот тканевой паразит относится к эука-риотическим организмам, и поэтому можно пред-
положить, что биологический эффект воздействия на него различного рода излучений будет эффективным.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить влияние лазерного, СВЧ- и КВЧ-излучений на жизнеспособность и морфологию Tr. vaginalis в условиях непрерывного его культивирования на жидких средах.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Для исследования патологического материала использовали культуральный метод [7, 8], микроскопическое исследование нативных и окрашенных мазков [3, 4] и метод молекулярно-генетических исследований - полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [9, 11, 12].
Для посева использовали жидкую диагностическую среду "Vagicult" (Финляндия), которая содержит белковый гидролизат, дрожжевой экстракт, мальтозу, цистеин, аскорбиновую кислоту, сыворотку крови овец, а также антибиотики для
подавления сопутствующей патогенной микрофлоры. Культивирование проводили в термостате при температуре 37 оС. Была проведена 4-кратная пересадка материала. В 1-м и 2-м пассажах продолжительность культивирования три-хомонад достигала 15-20 суток.
Микроскопический контроль материала проводился ежедневно. Для этого использовались нативные препараты и препараты, окрашенные раствором метиленового синего, которые изучались с помощью микроскопа "Jenava" при 1000-кратном увеличении. Микрофотографии изготавливались с помощью цифровой камеры-окуляра "Scopetek DCM35". Подсчет клеток Tr. vaginalis осуществлялся методом кратных разведений, который ранее не использовался для этого объекта.
ПЦР и ее модификация использовалась для изучения влияния излучений на геном трихомо-над в культивируемом материале, подвергнутом лазерному и КВЧ-излучениям.
Инокуляционный материал брали у мужчин с предполагаемым клиническим диагнозом "три-хомониаз" путем соскоба из уретры желобоватым зондом. Для обогащения инокулята вводили в уретру 5-7 мл раствора Рингера-Локка для смыва ее содержимого. Материал брался в утреннее время до мочеиспускания.
В качестве источников лазерного, СВЧ-и КВЧ-излучений применяли широко распространенные физиотерапевтические аппараты: "Узор-А-2К", "Луч-4", "Явь-1". Интенсивность, длина волны, а также экспозиция соответствовали таковым при физиотерапевтических процедурах при лечении больных урогенитальным трихомо-ниазом.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
После первого сеанса облучения культуры импульсным лазерным излучением наблюдалось 5-кратное увеличение числа трихомонад в 1 мл среды - с 200 до 1 000 (табл. 1). В последующие дни их количество постепенно возрастало и после 5-го облучения (на 6-й день культивирования) достигало максимального значения - 5 000 клеток в 1 мл среды.
Лазерное воздействие привело к резкому снижению подвижности трихомонад: после 3-го облучения еще сохранялась подвижность, после 4-го - полностью утрачивалась. Движение на одном месте возобновилось после 5-го облучения одновременно с изменением формы клеток на округлую.
С 1-го по 4-е облучение форма клеток Tr. vaginalis оставалась типичной грушевидной, а после 5-го, помимо типичных форм, в нативных и окрашенных препаратах стали встречаться круглые (рис. 1).
Для воздействия на культуру КВЧ-излучения с помощью аппарата "Явь-1" использовали параметры, применяемые для лечения больных урогенитальным трихомониазом: длина волны -7,1 мм, частота - (42194±10) МГц, время воздействия - 10 и 15 мин.
После 2-го сеанса воздействия КВЧ-излучения наблюдалось увеличение количества клеток в 10 раз (табл. 2). Их максимальное количество отмечено после 4-го сеанса - 4 000 на 1 мл среды. После 1-го и 2-го облучений форма клеток оставалась типичной (грушевидной), после 3-го, помимо типичных форм, появились округлые клетки; после 5-го - большинство клеток Tr. vaginalis приобрели круглую форму (рис. 2). Отмечено, что подвижность трихомонад при КВЧ-обработке материала прекращается после 2-го облучения.
Таблица 1
Влияние импульсного лазерного излучения на морфологию и жизнеспособность Tr. vaginalis
в культуре in vitro
День культивирования Повтор-ность облучения Кол-во пробирок, шт. Кол-во клеток в 1 мл среды, шт. Форма клеток Поведенческая активность
1 0 10 200 Грушевидная,типичная Активное движение
2 1 10 1000 Грушевидная,типичная Активность резко снизилась до полного отсутствия движения
3 2 10 2000 Грушевидная,типичная Движение по кругу или на одном месте
4 3 10 2000 Грушевидная,типичная Движение по кругу или на одном месте
5 4 2 2000 Грушевидная,типичная Неподвижны
8 3000 Грушевидная,типичная Неподвижны
6 5 2 3000 Круглая Движение на одном месте
8 5000 Круглая Движение на одном месте
Рис. 1. Атипичная форма Tr. vaginalis после воздейст- Рис. 2. Округлая форма Tr. vaginalis после обработки вий импульсного лазерного излучения культуры КВЧ-излучением
Таблица 2
Влияние КВЧ-излучений на морфологию и жизнеспособность Tr. vaginalis в культуре in vitro
День культивирования Кратность облучения Кол-во пробирок Кол-во клеток в 1 мл среды Форма Активность
1 0 10 200 Грушевидная, типичная Активное движение
2 1 10 200 Грушевидная,типичная Активное движение
3 2 7 2000 Грушевидная,типичная Неподвижны
3 1000 Грушевидная,типичная Неподвижны
4 3 10 2000 Грушевидная, круглая Неподвижны
5 4 10 4000 Грушевидная, круглая Неподвижны
6 5 10 3000 Круглая Неподвижны
Рис. 3. Электрофореграмма ДНК облученной и необ-
лученной культур Tr. vaginalis: 1 - физиотерапевтические дозы КВЧ-излучения; 2 - физиотерапевтические дозы магнитно-лазерного излучения; 3 - не-облученная культура; 4 - чистая среда Vagicult; К+ - положительный контроль амплификации ДНК
Массовая гибель трихомонад в вариантах с КВЧ-облучением также отмечена на 7-й день облучения.
ПЦР-анализ контрольной культуры трихомонад (без облучения) и культур, обработанных лазерным и КВЧ-облучением, показал присутствие в этих вариантах ДНК Tr. vaginalis.
При 5-кратном облучении СВЧ и в течение 6 суток культивирования клетки трихомо-нады сохраняли типичную грушевидную форму (табл. 3). Количество клеток в 1 мл среды
после 1-го облучения увеличилось в 15 раз. Последующие два облучения также сопровождались кратным увеличением числа клеток. Максимальное их количество наблюдалось после 3-го облучения - 9 000 клеток в 1 мл среды. Однако, несмотря на высокий темп размножения, подвижность клеток исчезала уже после 1-го облучения, сохранялись лишь движения жгутика. Начиная с 4-го сеанса облучения темп размножения клеток снижается.
Таблица 3
Влияние СВЧ-излучений на морфологию и жизнеспособность Tr. vaginalis в культуре in vitro
День культивирования Кратность облучения Кол-во пробирок Кол-во клеток в 1 мл среды Форма клеток Активность
1 0 10 200 Грушевидная (типичная) Активное движение
2 1 10 3000 Грушевидная Неподвижны
3 2 10 6000 Грушевидная Неподвижны
4 3 10 9000 Грушевидная Неподвижны
5 4 7 5000 Грушевидная Неподвижны
3 3000 Грушевидная Неподвижны
6 5 10 3000 Грушевидная Неподвижны
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Все виды использованных в работе излучений в терапевтических дозах способствовали значительному увеличению количества клеток по сравнению с необлученными культурами. Это указывает на стимуляцию пролиферации Tr. vaginalis лазерным, СВЧ- и КВЧ-излучениями. В то же время облучение культуры урогенитальной три-хомонады приводило к изменению формы простейших: они приобретали округлую атипичную форму. Вероятно, это результат модификацион-ной изменчивости, индуцированной излучением. В связи с тем, что полиморфность трихомонад сильно затрудняет диагностику трихомониаза, то полученные данные представляют интерес для дальнейшего исследования возможности влияния использованных в работе видов излучений на морфологию возбудителя физиотерапевтическими методами.
2. Использованные виды облучений приводят к потере активной подвижности трихомонад, которая не является свидетельством снижения их жизнеспособности, поскольку клетки сохраняли способность к интенсивному размножению. Мы полагаем, что это связано с воздействием излучений на гидрогеносомы, выполняющие функции митохондрий.
3. Молекулярно-генетические исследования культур после обработки всеми видами излучений показали наличие в ДНК Tr. vaginalis как при физиотерапевтических дозах, так и при высоких дозах облучения. Это свидетельствует о том, что
различные дозы излучений не оказывают мутагенного действия на видоспецифические прай-мерные сайты ДНК. Выявленная in vitro стимуляция лазерным, СВЧ- и КВЧ-излучениями обозначила проблему пересмотра отношения к этим физиотерапевтическим методам лечения трихо-мониаза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гамалея Н. Ф. // Лазеры в эксперименте и клинике. - М.: Медицина, 1972. - С. 256-260.
2. Голант М. Б. // Биофизика - 1989. - Т. 34, вып. 2. - С. 339-348.
3. Дмитриев Г. А. // Cons. med. - 2005. - Т. 7, № 3.
4. Ильин И. И., Туранова Е. Н. // Венерические болезни: Руководство для врачей / Под ред. О. К. Шапошникова - М.: Медицина, 1980. - С. 422-440.
5. Клячкин Л. М., Виноградова М. Н. // Физиотерапия. - М.: Медицина, 1995. - С. 231-236.
6. Козлюк А. С., Козлюк В. А. // ИППП. - 2001. -№ 6. - С. 26-28.
7. Копылов В. М. // Урогенитальный трихомониаз. Актуальные вопросы диагностики и лечения: Пособие для врачей. - М.: Медицина, 2001. - С. 22-23.
8. Лабораторная диагностика мочеполового трихомониаза (пособие для врачей-лаборантов) / В. Н. Бед-нова, Г. А. Дмитриев, М. М. Васильев и др. - М.: Медицина, 1997. - С. 3-7.
9. Madico G, Quinn Т.О., Rompalo A,, et al. // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36, № 11. - Р. 3205-3210.
10. Petrin D., Deldaty K., Bhatt R., et al. // Clin. Microbiol. Rev. - 1998. - №11. - P. 300-317.
11. Ryu J. S., Chung H. L., Min D. Y., et al. // Yonsei
Med. J. - 1999. - Vol. 40, № 1. - Р. 56-60.
12. Trichomonas vaginalis in vaginal discharges //
Ann. Trop. Med. Parasitol. Р. 437-440.
1997.
2007
Vol. 19, № 6. -
