CC BY
15
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 616.441.577.112 14.03.06 Фармакология, клиническая фармакология
ВЛИЯНИЕ L-АРГИНИНА И БЛОКАТОРА СИНТЕЗА МОНООКСИДА АЗОТА L-NAME НА СПЕКТР АМИНОКИСЛОТ ПЛАЗМЫ КРОВИ КРЫС ПРИ СУБТОТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА © Разводовский Ю.Е.1, Смирнов В.Ю. 2, Переверзев В.А.3, Максимович Н.Е. 2, Семененя И.Н. 1
1 Государственное предприятие «Институт биохимии биологически активных соединений НАНБеларуси» Республика Беларусь, 230009, Гродно, ул. Бульвар ленинского комсомола,50
2УО «Гродненский государственный медицинский университет», Республика Беларусь, 230009, Гродно, ул. Горького, 80
3Белорусский государственный медицинский университет, Республика Беларусь, 220116, Минск, пр. Дзержинского, 83
Резюме
Цель. Характеристика изменений пула свободных аминокислот и их метаболитов в плазме крови крыс при субтотальной ишемии головного мозга (СИГМ) на фоне введения L-аргинина и ^нитро-L-аргининметилового эфира (L-NAME).
Методика. Эксперимент выполнен на 18 белых беспородных крысах-самках. СИГМ моделировали у 12 крыс путём перевязки обеих общих сонных артерий в течение одного часа. L-аргинин и L-NAME вводили 6 животным внутривенно в дозе 5 мг/кг непосредственно перед перевязкой сонных артерий. Содержание аминокислот и их дериватов в экстрактах плазмы крови определяли методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Результаты. СИГМ индуцировала аминокислотный дисбаланс плазмы крови, проявлением которого явилось повышение уровней целого ряда соединений. Предварительное введение композиции L-аргинина и L-NAME предотвращает рост ряда компонентов аминокислотного фонда плазмы крови (в том числе аспартата, глицина, таурина, аланина и фенилаланина) при субтотальной ишемии головного мозга.
Заключение. Предварительное введение композиции L-аргинина и L-NAME снижает выраженность дисбаланса пула аминокислот и родственных соединений плазмы крови при СИГМ.
Ключевые слова: аминокислоты, плазма крови, субтотальная ишемия головного мозга, L-аргинин, L-NAME
EFFECT OF L-ARGININE AND L-NAME NITRIC OXIDE SECRETIONBLOCATOR
ON THE SPECTRUM OF FREE AMINO ACIDS IN BLOOD PLASMA OF RATS UNDERGOING
SUBTOTAL CEREBRAL ISCHEMIA
Razvodovsky Y.E.1, Smirnov V.Y.2 , Pereverzev V.A.3, Maksimovich N.Ye.2, Semenenya I.N.1
1Institute biochemistry of biologically active substances, 50, Boulevard of Lenin's Komsomol, St., 230009, Grodno, Belarus
2Grodno State Medical University, 80, Gorkogo St., 230023, Grodno, Belarus 3Belarusian State Medical University, 83, Dzerzhinsky Av., 220116, Minsk, 83, Belarus
Abstract
Objective. To estimate the changes in the pool of free amino acids and their derivatives in plasma of rats undergoing subtotal cerebral ischemia (SCI) and treated with L-arginine and L-NAME.
Methods. The experiment was carried out on 18 rats: 12 animals were undergoing bilateral filament occlusion of carotid arteries; L-arginine and L-NAME were administrated to 6 of them. The analyses of free amino acids levels in the blood plasma extracts were carried out by reversed-phase HPLC.
Results. Subtotal cerebral ischemia induced imbalance in the pool of plasma amino acids. Concentrations of several amino acids were elevated after subtotal cerebral ischemia, including aspartate, glycin, taurine, alanine and phenylalanine. Administration of L-arginine and L-NAME partially prevented the imbalance of the amino acids pool, caused by SCI.
Conclusions. Preventive injection of L-arginine and L-NAME alleviate the imbalance in the pool of free amino acids of blood plasma caused by SCI.
Keywords: amino acids, blood plasma, subtotal cerebral ischemia, L-arginine, L-NAME
Введение
Оксид азота является многофункциональным биологическим медиатором, играющим важную роль в поддержании гомеостаза, включая участие в передаче сигнала, контроле гемодинамики, регуляции клеточной пролиферации, процессах воспаления, свободнорадикального окисления [7]. Моделирование дефицита оксида азота с помощью блокатора его синтеза ^нитро^-аргининметилового эфира (L-NAME) приводит к развитию артериальной гипертензии, гипертрофии кардиомиоцитов, увеличению коэффициента эндотелиальной дисфункции [8]. Имеющиеся в настоящее время данные о роли оксида азота при ишемии головного мозга достаточно противоречивы [2].
Предполагается, что генерация NO при ишемии мозга может иметь двоякие последствия, приводя с одной стороны к увеличению мозгового кровотока, повышению антитромбогенных свойств крови [8, 9], а с другой стороны, к усилению повреждения мозга посредством стимуляции глутамат-чувствительных NMDA-рецепторов мозга и индукции глутаматной нейротоксичности [6].
Повреждающие эффекты NO при развитии патологического процесса в условиях ишемии мозга находятся в хрупком равновесии с NO-зависимыми механизмами многоуровневой, многокомпонентной защиты мозга от повреждения [2]. Различия в результатах исследований с использованием доноров и ингибиторов NO могут зависеть от концентраций NO, источника NO, стадии ишемического процесса, в которую используются препараты, а также других факторов [6]. В настоящее время обсуждается вопрос о неоднозначной роли оксида азота, образуемого при участии различных изоформ NOS в ишемическом повреждении головного мозга (ГМ) [9].
Использование неселективных ингибиторов NOS, в частности N-нитро и N-метильных аналогов L-аргинина в качестве возможных нейропротекторов при ишемическом повреждении дало противоречивые результаты. По данным одних авторов, однократное применение ингибитора NOS L-NAME вызывало защитный эффект на модели фокальной ишемии мозга у крыс, проявлявшийся в уменьшении зоны инфаркта [4]. По данным других - использование NG-nitro-L-arginine (50-100 мг/кг интраперитонеально) за 15 ч. до моделирования ишемии головного мозга у крыс оказывало нейропротекторный эффект, что дало основание автору предположить о ключевой роли NO в патогенезе ишемических инсультов [9].
Использование в эксперименте неселективного ингибитора NOS- L-NAME, обладающего необратимым ингибиторным действием в отношении обеих конституциональных изоформ NOS (нейрональной и эндотелиальной) снижало антигипоксическую резистентность экспериментальных крыс с субтотальной ишемией головного мозга, усиливая проагрегационные, провоспалительные и прооксидантные эффекты [2]. Учитывая, что введение селективного ингибитора нейрональной NOS 7-нитроиндазола такого эффекта не вызывало [6], отрицательный эффект L-NАMЕ можно отнести к его ингибирующему эндотелиальную изоформу NOS действию. Противоречивость результатов предыдущих исследований обуславливает актуальность подака факторов, способных оказывать влияние на реализацию эффектов NO.
Целью исследования явилась характеристика изменений пула аминокислот и их метаболитов в плазме крови крыс при субтотальной ишемии ГМ на фоне ведения композиции L-аргинина и L-NAME.
Методика
Эксперименты выполнены на 18 белых беспородных крысах-самках (по 6 животных в каждой группе) массой 180-220 г. Крысам опытных групп моделировали субтотальную ишемию головного мозга (СИГМ) путём перевязки обеих сонных артерий в течение одного часа. Композицию L-аргинина и L-NAME вводили внутривенно в дозе 5 мг/кг непосредственно перед перевязкой общих сонных артерий. Контрольную группу составили ложнооперированные животные, получавшие эквиобъёмное количество изотонического раствора NaCl. Все оперативные манипуляции проводились в условиях внутривенного тиопенталового наркоза (60 мг/кг). После декапитации животных отобранную в гепаринизированные пробирки кровь центрифугировали 15 мин. при 3000 g. К полученной плазме добавляли равный объем среды, содержащей 0,1М хлорную кислоту и 250 мкмоль/л 5-аминовалериановой кислоты в качестве внутреннего стандарта. После центрифугирования (15 мин. при 13000 g и +4°С) полученный супернатант немедленно отбирали.
Спектр определяемых соединений включал, помимо протеиногенных аминокислот, орнитин, цитруллин и ряд их производных (таурин, а-аминобутират и др.). Анализ проводился на хроматографе Agilent 1100 методом обращенно-фазной жидкостной хроматографии [1, 3, 5]. В работе использовались реактивы квалификации не ниже хч.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы R. В случае выполнения условий применимости применялся параметрический дисперсионный анализ с поправкой Тьюки на множественность сравнений (данные для этих переменных представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего). В случае невыполнения этих условий применялся непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса с поправкой Беньямини-Хохберга на множественность сравнений (в таблицах для этих переменных приведены значения медианы и квартилей). Также использовался корреляционный и линейный дискриминантный анализ.
Результаты исследования и их обсуждение
При субтотальной ишемии ГМ наблюдалось повышение уровней аспартата, аспарагина, глутамина, глицина, аланина, фенилаланина, гистидина, треонина, цитруллина, орнитина, аминокислот с разветвлённой углеводородной цепью (АРУЦ), а также ряда производных аминокислот - таурина, а-аминоадипината, 3-метилгистидина, Р-аланина (табл. 1). Таким образом, изменения касались в основном гликогенных аминокислот и носили однонаправленный (в сторону повышения концентраций) характер. Тем не менее, повышения соотношения гликогенных и кетогенных аминокислот не наблюдалось (табл. 2) вследствие более чем двукратного повышения уровня лейцина. Несмотря на рост уровней глицина и таурина (играющих, как известно, роль тормозых нейромедиаторов в ЦНС), соотношение сумм возбуждающих и тормозных соединений в плазме крови не изменялось. Анализ интегральных показателей аминокислотного фонда выявил повышение суммарного пула протеиногенных аминокислот, рост содержания как заменимых, так и незаменимых его компонентов, а также соотношения АРУЦ и ароматических аминокислот (ААК).
Введение композиции L-аргинина и L-NAME предотвращало ряд проявлений аминокислотного дисбаланса, индуцируемого субтотальной ишемией ГМ, в том числе повышение уровней аспартата, глутамина, гистидина, глицина, таурина, аланина, 3-метилгистидина и фенилаланина. В то же время уровни аспарагина, Р-аланина, цитруллина и АРУЦ сохранялись выше нормы. Кроме этого, наблюдалось повышение концентраций серина, гомосерина, треонина, лизина и аргинина (табл. 1). Следствием этих изменений явилось повышение содержания кетогенных аминокислот и отношения заменимых / незаменимых аминокислот в плазме крови (табл. 2). Введение композиции не предотвращало рост суммарного пула протеиногенных АК (в том числе его гликогенных компонентов), а также соотношения АРУЦ и ААК.
Наиболее значимыми показателями в дискриминации групп являлись аргинин, 3-метилгистидин, а-аминоадипиновая кислота (Б-искл >10) и, сравнительно менее значимыми, тирозин, метионин и триптофан (табл. 3). При этом наборе предикторов достигалась высокодостоверная дискриминация между группами (Лямбда Уилкса = 0,00326, Б=27,51, р<10-9).
На рисунке представлено расположение групп на плоскости двух главных компонент. Видно, что наибольшие изменения происходят относительно 1-го корня дискриминантной функции, объясняющей более 78% общей дисперсии. Вдоль этой оси наблюдалась максимальная дискриминация групп «контроль» и «СИГМ + препараты» с одной стороны и группы СИГМ - с другой.
Таблица 1. Концентрация аминокислот и их производных в плазме крови крыс при субтотальной ишемии головного мозга на фоне введения композиции L-аргинина и L-NAME, мкмоль/л
Аминокислоты Контроль СИГМ L-NAME + L-аргинина + СИГМ
Asp 20,8±2,56 45,8±7,15* 29,3±4,15
Glu 155±24,2 228±36,9 203±19,6
Asn 63,1±6,06 97,4±8,94* 91,9±7,85*
Ser 202±27,1 298±37,7 316±26,5*
aAAA 2,27±0,164 4,78±0,882* 5,4±0,463*
Gln 404±68,5 907±111* 573±33,8f
His 63,7±7,17 113±10,7* 96,2±9,79
HSer 11,5 (11,3/14,9) 11,9 (10,7/13,6) 19,6 (16,8/20,2)*f
3-MHis 10,1±1,27 26,1±3,1* 16,1±2,16f
Gly 243±33,7 450±80,1* 256±31
PEA 12±0,895 12,8±1,06 13,9±1,76
Thr 143 (120/166) 266 (211/297)* 640 (379/783)*!
1-MHis 6,1±1,05 6,28±1,24 3,72±0,144
Ctr 60,7±7,87 125±14,5* 136±8,72*
Arg 86,9 (44,9/89,6) 24,2 (3,94/79,5) 298 (190/411)*!
Ans 8,09±1,81 15,5±4,47 8,34±0,823
ßAla 5,61 (5,34/5,72) 7,84 (6,74/25,6)* 8,93 (7,99/9,17)*
Car 8,99±1,4 7,94±1,12 8,64±1,02
Ala 433±70,8 1070±190* 575±63,8f
Tau 280±25,8 468±58,1* 320±23f
GABA 7,57±1,06 6,05±0,283 14,8±4,49
Tyr 54,8±5,14 73,6±8,07 47,3±3,77f
aABA 12,4±2,13 13,3±1,79 13,1±1,04
Val 106±8,95 223±22,4* 276±42,3*
Met 31,1±4,3 47,9±4,39* 47,5±5,22
Trp 44,3 (40,2/51,2) 37,5 (33/42,2) 72 (67,6/81,1)!
Phe 50,8±4,08 95±10,9* 76,6±7,74
Ile 49,6±4,23 117±13,5* 137±22,8*
Leu 80,5±6,08 187±22,7* 213±38,6*
Orn 59,8 (47,8/85) 130 (108/148)* 132 (99,2/287)*
Lys 233±39,1 351±43,3 448±82,8*
Примечание (здесь и в табл. 2): * - р<0,05 при сравнении с контролем; ? - р<0,05 при сравнении с СИГМ
Наибольший вклад в эту компоненту вносили концентрации 3-метилгистидина, аргинина, метионина и триптофана. Группа контроля и СИГМ + препараты дискриминировали только относительно 2-го корня, значение которого в наибольшей степени зависела от тирозина и а-аминоадипиновая кислота. Однако, различия вдоль этой оси имеют меньшую выраженность, т.к. второй корень дискриминантной функции объясняет менее 22% общей дисперсии.
Всё это может свидетельствовать о снижении выраженности дисбаланса пула аминокислот и родственных соединений, индуцированного СИГМ в плазме крови, при предварительном введении композиции L-аргинина и L-NAME.
Таблица 2. Интегральные показатели аминокислотного фонда плазмы крови крыс при субтотальной ишемии головного мозга на фоне введения композиции L-аргинина и L-NAME
Аминокислоты Контроль СИГМ L-NAME + Ь-аргинина + СИГМ
ААК 152 (144/155) 215 (190/236) 203 (190/210)
АРУЦ 236±18,9 527±58* 625±104*
Заменимые 1580±214 3170±464* 2090±161
Незаменимые 803 (684/956) 1530 (1160/1600)* 1910 (1630/2320)*
Гликогенные 1940±243 3770±492* 3350±316*
Кетогенные 314±42,6 538±38,8 661±120*
Нейротрансмиттерные 706±78,3 1200±175* 823±72,5
Возбуждающие 176±25,9 274±42,4 232±23,7
Тормозные 530±56,8 924±135* 591±50|
АРУЦ/ААК 1,53±0,0882 2,57±0,153* 3,09±0,334*
Заменимые/Незаменимые 1,69 (1,65/1,93) 2,06 (1,81/2,12) 1,15 (1,04/1,31)*|
Гликогенные/Кетогенные 5,42 (4,98/5,93) 6,73 (5,23/7,61) 5,77 (4,96/6,27)
Возбуждающие/Тормозные 0,328±0,029 0,299±0,019 0,392±0,0141|
Суммарный пул протеиногенных АК 2380±257 4600±524* 4040±428*
Таблица 3. Результаты дискриминантного анализа. Анализ канонических дискриминантных
функций
Аминокислоты Лямбда Уилкса Частная Лямбда Уилкса Б-искл.(2,10) Р Толерантность
АГЙ 0,0121 0,271 13,47 0,00145 0,406
3-МН1з 0,0313 0,104 43,03 0,0000122 0,216
аААА 0,0115 0,284 12,58 0,00186 0,319
Туг 0,00826 0,395 7,655 0,00963 0,252
Тгр 0,00711 0,459 5,901 0,0203 0,415
Мег 0,00858 0,380 8,157 0,00793 0,218
корень 1 (78.4%)
Рис. Расположение канонических значений дискриминантных функций на плоскости 2-х главных компонент
Выводы
1. Субтотальная ишемия головного мозга крыс индуцирует выраженный аминокислотный дисбаланс плазмы крови, проявляющийся в повышении ряда гликогенных аминокислот, лейцина и таурина.
2. Предварительное введение композиции L-аргинина и L-NAME предотвращает рост ряда компонентов аминокислотного фонда плазмы крови (в том числе аспартата, глицина, таурина, аланина и фенилаланина) при субтотальной ишемии ГМ.
3. Предварительное введение композиции L-аргинина и L-NAME вызывает рост серина, треонина, лизина и аргинина и не предотвращает индуцированный СИГМ рост суммарного пула протеиногенных и гликогенных аминокислот, АРУЦ, а также соотношения АРУЦ и ААК.
4. Предварительное введение композиции L-аргинина и L-NAME снижает выраженность дисбаланса пула аминокислот и родственных соединений плазмы крови при СИГМ.
Литература (references)
1. Барковский Е.В. Бокуть С.Б., Бородинский А.Н. и др. Современные проблемы биохимии. Методы исследований. - Минск: Вышэйшая школа, 2013. - 491 c. [Barkovskiy E.V., Bokun S., Borodinskiy A.N., i dr. Sovremennye problemy biochimii. Metody issledovania. The contemporary problems of biochemistry. Methods of investigation. - Minsk: Highest school, 2013. - 491 p. (in Russian)]
2. Максимович Н.Е. Роль оксида азота в патогенезе ишемических и реперфузионных повреждений мозга. -Гродно, ГрГМУ. - 2004. - 180 с. [Maximovitz N.E. Role oksida asota v patogenese ischemitztskich I reperfusionnych povrezdeniy mosga. Role of nitric oxide in the ischemic and reperfusion demedge to the brain. -Grodno, GrGMU. - 2004. - 180 p. (in Russian)]
3. Смирнов В.Ю., Разводовский Ю.Е., Дорошенко Е.М., Островский С.Ю. Влияние композиции аминокислот с разветвленной углеводородной цепью, триптофана и таурина на обмен аминокислот в экспериментальных моделях алкоголизма // Украинский биохимический журнал. - 2003. - Т.75, №4. - С. 101-107. [Smirnov V.Y., Razvodovsky Y.E., Doroshenko E.M., Ostrovsky S.Y. Ukrainskiy biochimitzeskiy zurnal. Ukrainal biochemical journal. - 2003. - V.75, N4. - P. 101-107. (in Russian)]
4. Kozniewska E., Roberts T.P., Tsuura M., N sup G-Nitro-L-Arginine delays the development of brain injury during focal ischemia in rats // Stroke. - 1995. - V.26(2). - P. 282-288.
5. Maksimovich N.Ye. Tolerance of hypoxic hypoxia in rats with cerebral ischemia treated by NO-synthase modulators // Hypoxia medical. - 2004. - V.1-2. - P. 20-23.
6. Moncada S., Palmer R., Higgs E. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology // Pharmacological Review. - 1991. - N43. - P. 109-142.
7. Razvodovsky Y.E., Troyan E.I., Doroshenko Ye.M. et al. Levels of Free Amino Acids and their Derivatives in the Brain Cortex of Rats During Unilateral Ischemia // International Journal Neroscience and Behavior. -2017. - V.1, N1. - P. 18-21
8. Salter M., Duffy C., Garthwaite J., Strijbos P.J. Substantial regional and hemispheric differences in brain nitric oxide synthase (NOS) inhibition following intracerebroventricular administration of N-nitro-L-arginine (L-NA) and its methyl ester (L-NAME) // Neuropharmacology. - 1995. - N34. - P. 639-649.
9. Trifiletti R. R. Neuroprotective effects of NG-nitro-L-arginine in focal stroke in the 7-day old rat // European Journal of Pharmacology. - 1992. - V.21. - P. 197-198.
Информация об авторах
Разводовский Юрий Евгеньевич - заведующий отделом проблем регуляции метаболизма Института биохимии биологически активных соединений Национальной академии наук, Беларусь. E-mail: razvodovsky@tut.by
Смирнов Виталий Юрьевич - кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь. E-mail: vit_sm@mail.ru
Переверзев Владимир Алексеевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии УО «Белорусский государственный медицинский университет», Беларусь. E-mail Pereverzev2010@mail.ru; PereverzevVA@bsmu.by
Максимович Наталья Евгеньевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь. E-mail: mne@grsmu.by
Семененя Игорь Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, директор Института биохимии биологически активных соединений Национальной академии наук, Беларусь. E-mail: insemenenya@yandex.by
