CC BY
30
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ТЕРАПИИ МЕДИЦИНСКИМИ ГАЗАМИ
И.А. Хлусов1'3, С.А. Наумов2, М.Ю. Хлусова1
ВЛИЯНИЕ КСЕНОНА IN VITRO НА СОСТОЯНИЕ ЗДОРОВЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ ГИПЕРТЕРМИИ
1 Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Россия;
л
ООО «НК «Биология Газ Сервис», Екатеринбург, Россия;
3Томский политехнический университет, Томск, Россия Хлусов Игорь Альбертович - khlusov63@mail.ru
Резюме: изучен in vitro эффект инертного газа ксенона (Хе) на жизнеспособность здоровых и опухолевых клеток и окислительно-восстановительный баланс клеточных культур при их 24-ч культивировании в гипертермических условиях (43°C). В качестве объекта исследований использовали тимоциты крысы Wistar и мыши Black, клетки перевиваемых мастоцитомы P-815 и аденокарциномы Эрлиха. После барботажа клеточных взвесей (5*106 клеток/мл, объем среды 4 мл) масса Хе во флаконах варьировала в пределах 15-40 мг. В то же время, в бесклеточной среде весовым методом не удалось зафиксировать прибавки массы, обусловленной накоплением газа в системе. Убыль Хе из клеточной взвеси при 24-ч культивировании незначительна и составляет 10% от начального уровня. Хе статистически значимо (Р<0,05) повышает выживаемость тимоцитов в гипертермических условиях. При комфортной температуре (37оС) влияние Хе на здоровые клетки не выражено. Выживаемость клеток мастоцитомы Р-815, но не аденокарциномы Эрлиха, при гипертермическом воздействии в атмосфере ксенона значительно снижается. Цитотоксический эффект ксенона на клетки мастоцитомы Р-815 может быть связан с дисбалансом окислительно-восстановительных процессов (увеличением секреции малонового диальдегида и снижением уровня оксида азота). Способность Хе по-разному влиять на здоровые и опухолевые клетки при гипертермии условиях представляет ценность для разработки новых методов комплексной терапии онкологических заболеваний.
Ключевые слова: тимоциты, мастоцитома P-815, аденокарцинома Эрлиха, барботаж, жизнеспособность, супернатанты, малоновый диальдегид, оксид азота.
Summary: the effects of xenon (Xe) on health and tumor cell viability, and redox balance in the cellular cultures have been studied in vitro during 24-h storage under hyperthermic conditions (43°C). Wistar rat and Black mouse thymocytes, finite mastocytoma P-815 and Ehrlich' adenocarcinoma were used. Following bubbling of cell suspensions (5*106 cell/ml, 4 ml medium), the weight of Xe in flasks was 15-40 mg, whereas in cell-free medium no weight increment due to gas accumulation in the system was detected. The content of Xe in cell suspension slightly decreased over 24-h
culturing (by 10% of initial level). Xe improved significantly (Р<0.05) thymocytes survival during hyperthermal exposure. The effect of Xe was not pronounced at comfortable temperature (37 degrees C).The viability of mastocytoma P-815 but not Ehrlich' adenocarcinoma cells under hyperthermia in Xe atmosphere decreased measurably. Cytotoxic effect of Xe on mastocytoma P-815 culture may be connected with redox imbalance, i.e. increasing malondialdehyde and decreasing nitric oxide concentrations. The capacity of Xe to affect variously health and tumor cell survival under hyperthermia is of great value for the development of new methods for complex therapy of oncologic disorders.
Key words: thymocytes, mastocytoma P-815, Ehrlich' adenocarcinoma, bubbling, viability, supernatants, malondialdehyde, nitric oxide.
Введение
Ксенон (Xe) является газом с минимальной токсичностью, с возможностью растворяться в биологических жидкостях и клеточных мембранах, вариабельным воздействием на обменные [11] и клеточно-молекулярные процессы [10]. Это открывает широкие перспективы его использования в медико-биологической практике, в частности в биотехнологии [9].
С другой стороны, большие надежды в комплексной борьбе с онкологическими заболеваниями возлагаются на метод общей, региональной и локальной гипертермии, связанный с нагреванием организма, пораженного злокачественной опухолью, до температуры 41-45оС, при которой наблюдается преимущественная гибель пораженных клеток [17,18]. Возникающая при этом угроза теплового шока заставляет искать новые анестетики, обладающие значительной наркотической активностью в минимальных дозах, при отсутствии токсичности и стимулирующего влияния на онкологический процесс.
В связи с этим целью исследования было определение in vitro влияния ксенона на жизнеспособность и свободнорадикальные процессы в культуре здоровых и опухолевых клеток мышей в условиях гипертермического воздействия.
Материал и методы исследования
Эксперименты проводились в зимний период с использованием клеточного материала 1 крысы Wistar, 1 мыши-опухоленосителя линии Black (тимоциты; асцитная опухоль Эрлиха) и 1 мыши-опухоленосителя DBA/2 (мастоцитома Р-815) из вивария НИИ фармакологии СО РАМН (Томск). Тимоциты, высоко чувствительные к разнообразным эндогенным и экзогенным индукторам клеточной смерти [5], выделяли, как описано [12].
Для получения взвеси перевиваемых клеток асцитной опухоли Эрлиха либо мастоцитомы P-815 опухолевым мышам линии Black и DBA/2 соответственно в асептических условиях вводили внутрибрюшинно по 5 мл среды RPMI-1640 (Sigma). После 15 массажных движений брюшной полости откачивали асцит и переносили в центрифужные пробирки [3]. Определяли количество и жизнеспособность опухолевых клеток.
Для изучения эффектов Хе при различных температурных режимах осуществляли барбатаж клеточных взвесей. Для воздействия на клетки
применяли ксенон (чистота газа 99,999%) производства ГУДП НИКИЭТ "Техноцентр "Лазерная диагностика и чистые технологии" (г. Заречный).
В асептических условиях клеточные взвеси (5*106 клеток/мл, объем среды 4 мл) подвергали воздействию Хе в полуоткрытой системе (диаметр приводящей иглы больше выводящей). Продувание Хе проводили при давлении 0,025 МПа, температуре 23°С в течении 30 сек. По величине прироста массы до и после пропускания Хе судили о количестве газа, поступившего в систему. Вследствие высокой текучести Хе, в отдельном исследовании изучали его убыль в течение 24 часов с момента продувания клеточной взвеси миелокариоцитов крысы, выделенных из бедренной кости по обычной методике [12]. Для взвешивания образцов использовались равноплечие весы с точностью до 10 "V
Затем клетки культивировали in vitro в 10-мл флаконах в различных температурных режимах (по 3 образца на каждую точку) в течение 24 часов в термостате при температуре 43 °С. Применяли культуральную среду следующего состава: 95 % среды RPMI-1640 (Sigma), 5 % сыворотки крови эмбрионов коровы (ISN), 280 мг/л L-глутамина (Sigma), 50 мг/л гентамицина. Контрольную группу составляла культура клеток, не подвергавшаяся воздействию газа.
После 24-ч инкубации подсчитывали жизнеспособность ядросодержащих клеток в тесте с 0,4 % трипановым синим согласно требованиям ISO 10993-5. Затем клеточную взвесь центрифугировали 10 мин при 500g, собирали кондиционные среды, разливали их в контейнеры объемом 1,5 мл и хранили при -25°С не более 1 месяца. В супернатантах оценивали концентрации малонового диальдегида (МДА) и оксида азота (NO).
Определение концентрации МДА (мМ) проводили в тесте с 0,8 % тиобарбитуровой кислотой по образованию окрашенного комплекса с последующим колориметрированием при длине волны 532 нм [2]. Содержание NO (мМ) в супернатантах контролировали на ИФА-анализаторе при длине волны 550 нм по содержанию нитритов после обработки реактивом Грейса [12]. Концентрацию газа вычисляли по калибровочной кривой, построенной по эталонному образцу нитрита натрия.
Полученные данные подвергались статистической обработке методами вариационной статистики. По результатам экспериментов вычисляли среднюю величину (Х) и ошибку средней (m). Вследствие малого числа наблюдений (n<30) и больших различий распределений признаков от нормального вида, для статистической обработки применяли непараметрические U-критерий Манна-Уитни (Pu) и Т-критерий Вилкоксона (PT). Результаты.
Известно, что Хе обладает высокой текучестью и растворимостью по сравнению с другими инертными газами, способностью фильтроваться через силиконовые слои [4], что может затруднять его применение в биотехнологической практике. В связи с тем, что работа выполнялась на суточных клеточных культурах, было проведено исследование динамики содержания Хе в клеточной взвеси в течение 24 часов (рис.1). Результаты показали, что в изученные сроки убыль Хе оказалась незначительной, масса газа составила 90% от исходного уровня. Скорость падения показателя равнялась 0,12
мг/час, что позволило в дальнейшем использовать в расчетах массу газа в системе в начальный период исследования (1 час после барботажа).
Краткосрочной культивирование тимоцитов крысы в присутствие ксенона, в сравнении с воздухом (контроль), в комфортных условиях жизнедеятельности (37°C) достоверно не влияло на их выживание in vitro (табл.1). В свою очередь, инертный газ в диапазоне концентраций 4-7 мг/мл вызывал статистически значимое повышение (на 8-12 % по сравнению с группой контроля, Pu<0,05) устойчивости здоровых клеток вилочковой железы как крыс, так и мышей, к гипертермии (табл.1).
Рис.1. Динамика убыли ксенона из суспензионной культуры клеток костного мозга мыши. По оси абсцисс - время, ч; по оси ординат - масса газа, мг.
Напротив, жизнеспособность культуры клеток мастоцитомы Р-815, предварительно обработанной ксеноном, снижалась на 13 % по отношению к контролю (Рu<0,05) при воздействии высокой температуры. В случае клеточной культуры опухоли Эрлиха статистически значимого эффекта ксенона не выявлено (табл.1).
Продувание Хе клеточных культур увеличивало (до 261 % от контроля, Pu<0,05) уровень МДА только при гипертермии клеток мастоцитомы Р-815 (табл.2). В других случаях отмечалось уменьшение (более чем в 2 раза; тимоциты крысы, 37°^) или тенденция к снижению показателя (при гипертермии), достигавшая в случае нормальных клеток мышей достоверности согласно Т-критерию Вилкоксона (табл.2).
Таблица 1
Жизнеспособность тимоцитов и опухолевых клеток лабораторных животных после 24-ч культивирования в атмосфере ксенона (опыт) в различных
Жизнеспособность Жизнеспособность (%) клеточных
Группы тимоцитов крысы, % культур мышей в условиях
исследования гипертермии 0 = 43оС)
37ое 43ос тимоциты клетки опухолевых асцитов
Р-815 Эрлиха
контроль 70,0 ± 1,9 15 ± 1,0 35,0 ± 3,3 51,0 ± 4,0 18,0 ± 1,2
п = 6 п = 15 п = 4 п = 6 п = 4
опыт 78,0 ± 3,2 27,0± 50,0 ± 6,8* 38,0± 3,2* 21,0 ± 1,8
п = 6 0,4* п = 15 п = 6 п = 6 п = 6
"Средняя 8,63 4,35 6,80 10,03 6,7
концентрация
ксенона в
системе, мг/мл
Примечание: здесь и далее: контроль - суспензия клеток в воздушной среде, опыт - жидкая взвесь клеток в атмосфере ксенона; (*) - Рu<0,05 согласно Ц-критерию Манна-Уитни; п - число наблюдений; #) - представлены результаты 3-х измерений.
Таблица 2
Уровень малонового диальдегида (мМ) в супернатантах тимоцитов и опухолевых клеток лабораторных животных после 24-ч культивирования в атмосфере ксенона (опыт) в различных температурных режимах, Х±т, Ри, РТ
Культура тимоцитов Клеточные культуры мышей в
Группы крысы условиях гипертермии (1 = 43 о С)
исследовани 37ос 43ос тимоциты клетки опухолевых
я асцитов
Р-815 Эрлиха
контроль 0,979±0,07 0,857± 0,590± 0,244± 0,700±
0 0,159 0,185 0,064 0,245
п = 9 п = 8 п = 5 п = 8 п = 6
опыт 0,456 ± 0,572 ± 0,499± 0,636± 0,397±
0,056* 0,264 0,126# 0,152* 0,137
п = 9 п = 7 п = 7 п = 7 п = 8
Примечание: * - отмечены статистически значимые различия согласно критерию Вилкоксона (РТ).
В то же время, в исследуемых межклеточных жидкостях статистически значимые различия концентраций NO между опытом и контролем не выявлены. Следует отметить высокий уровень вещества (почти 10 мМ) в супернатантах аденокарциномы Эрлиха (табл.3).
Таблица 3
Концентрация оксида азота (мМ) в супернатантах тимоцитов и опухолевых клеток лабораторных животных после 24-ч культивирования в атмосфере ксенона (опыт) в различных температурных режимах, X±m
Культура тимоцитов Клеточные культуры мышей в
Группы крысы условиях гипертермии (t = 43 °C)
исследовани 37°C 43°C клетки опухолевых
я тимоциты асцитов
Р-815 Эрлиха
контроль 5,24 ±0,22 4,05 ± 0,09 0,38 ± 0,31 1,15 ± 0,65 9,89 ± 0,36
n=12 n=11 n=5 n=8 n=6
опыт 4,52 ± 4,36 ± 0,18 1,09 ± 0,28 0,14 ± 0,28 10,03 ±
0,24* n=10 n=8 n=8 0,67
n=10 n=7
Обсуждение
Известна чувствительность к повышенной температуре клеток опухолей, находящихся в S-фазе клеточного цикла [17]. C 80-х годов прошлого столетия [18] и до настоящего времени общая, региональная либо локальная гипертермии в области температур 41-45оС считаются перспективным методом борьбы с онкологическими заболеваниями. Однако, существует проблема высокого процента гибели (до 50 %) опухоленосителей вследствие теплового шока, предупредить последствия которого можно при помощи общей анестезии. Разработка анестетика, сочетающего низкую токсичность, незначительную биотрансформацию с отсутствием стимулирующего влияния на опухолевый рост представляет до сих пор актуальную задачу. В связи с этим инертный газ Хе представляется перспективным средством для общего ингаляционного наркоза в условиях гипертермии онкологических пациентов.
Проведенные исследования позволили установить, что после продувания клеточных взвесей в полуоткрытой системе количество Хе во флаконах, выявленное весовым способом, варьировало в пределах 17-40 мг в объеме 4 мл клеточной взвеси (табл.1). В то же время, в бесклеточной среде не удалось зафиксировать прибавки массы, обусловленной накоплением газа в системе. По-видимому, задержка Хе в жидкой культуре обусловлена его взаимодействием с клеточными и растворенными липидами и белками, поскольку подобное взаимодействие широко представлено в литературе [15,16].
Известно, что Хе обладает высокой текучестью и растворимостью по сравнению с другими инертными газами, способностью фильтроваться через силиконовые слои [4], что может затруднять его применение в
биотехнологической практике. В связи с тем, что работа выполнялась на суточных клеточных культурах, было проведено исследование динамики убыли Хе в закрытой системе (жидкая взвесь клеток, газовая среда, резиновые пенициллиновые пробки) на протяжении 24 часов. Результаты показали незначительную скорость падения концентрации газа в исследуемые сроки (рис.1).
Значительные изменения температуры комфорта, варьирующей в случае культуральных исследований в диапазоне 33-37°С, вызывают нарушения жизнедеятельности клеток [1,7]. Оказалось, что при гипертермии Хе статистически значимо (Рu<0,05) повышал выживаемость здоровых клеток (тимоцитов), но не опухолевых клеток (табл.1).
Одним из основных механизмов гибели (старения) клетки является перекисное окисление липидов (ПОЛ), которое можно зафиксировать. в частности, по накоплению МДА [2]. Ксеноновый барботаж взвеси тимоцитов достоверно снижал (более, чем в 2 раза) концентрацию МДА в супернатантах в условиях температуры комфорта (37°С). Кроме того, отмечалась тенденция к снижению показателя (до 1,5 раз) в условиях гипертермии клеток (табл. 2). Постановка нашего эксперимента предполагает протекторное воздействие на здоровые клетки чистого Хе (в отсутствие больших концентраций кислорода, который вытесняется при барбатаже клеточных культур), подавляющего процессы ПОЛ мембран, вероятно, в результате мембраностабилизирующего действия.
В то же время, в супернатантах клеток перевиваемой мастоцитомы P-815 отмечалось обусловленное совместным воздействием гипертермии и Хе накопление МДА (до 160 % от контроля, Pu<0,05) (табл.2), связанное, вероятно, с инактивацией антиоксидантной защиты опухолевых клеток. Прооксидантное действие Хе на клетки мастоцитомы реализовалось падением их выживаемости в культуре на 13 % (Pu < 0,05) по сравнению с контролем (взвесь клеток в воздушной среде) (табл.1).
Согласно многим исследованиям, ПОЛ мембран тесно связано с продукцией оксида азота [14]. При этом установлена двойственная роль оксида азота [6] как прооксиданта [14], либо в некоторых случаях, как антиоксиданта [20]. Так, NO и O2-, обладая собственным цитотоксическим потенциалом, при взаимодействии образуют пероксинитрит анион (ONOO-) и другие формы реактивных оксидов азота (NO2, NO2-/NOз-), индуцирующих пероксидацию липидов [19].
В этом плане важным является то обстоятельство, что Хе не повышал выживаемость клеток перевиваемой асцитной опухоли Эрлиха (табл.1), гибнущей при гипертермии, по-видимому, по аутокринному механизму вследствие цитотоксического эффекта высоких концентраций межклеточного оксида азота (табл.3). Способность асцитной опухоли Эрлиха активно продуцировать оксид азота отмечена ранее [8].
Однако, NO, высвобождающийся из диэтаноламина и структур, названных Ж>Ш-аты является протектором ПОЛ [20].
Антиоксидантный эффект оксида азота проявляется в низких концентрациях [13]. Тем не менее, влияние Хе на концентрацию NO в жидкой фазе культур клеток
оказалось достаточно мягким (табл.3). Получены первоначальные данные, которые не позволяют делать окончательные заключения о возможности влияния Хе на состояние нормальных клеток через регуляцию продукции оксида азота.
Таким образом, показан in vitro протекторный эффект Хе на иммунокомпетентные клетки (тимоциты), отсутствие влияния либо даже ингибиция опухолевых клеток могут оказаться полезными, наряду с радиационным облучением, химио- и иммунотерапией, гипертермией, в комплексной борьбе с онкологическими заболеваниями.
Различное действие инертного газа на нормальные и опухолевые элементы весьма интересно и требует дальнейшего изучения. Однако, вследствие варьирования содержания газа в системе во всех сериях эксперимента (табл.1) уточнение данного обстоятельства требовало перерасчета показателей на 1 мг ксенона (табл.4).
Таблица 4
Вектор влияния ксенона (% / мг) на показатели в культурах нормальных и
опухолевых клеток мышей в условиях гипертермии
Исследуемые группы
Показатель тимоциты клетки опухолевых асцитов
Р-815 Эрлиха
МАЛОНОВЫИ -0,57 +4,02* -1,62*
ДИАЛЬДЕГИД
ОКСИД АЗОТА +6,80 -2,22* +0,06
ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ +0,54 -0,32* +0,09
КЛЕТОК
Примечание: *) - Pu <0,05 по сравнению с тимоцитами.
Согласно данным табл.4, благородный газ действительно обладает прооксидантным действием на клетки мастоцитомы Р-815, сохраняющие при гипертермии в атмосфере воздуха максимальную жизнеспособность (51 %, табл.1). В расчете на 1 мг массы Хе достоверно (по сравнению с тимоцитами) снижалась жизнеспособность опухолевых элементов вследствие роста уровня МДА (табл.4). В отношении тимоцитов мышей-опухоленосителей, более чувствительных к нагреванию (35 % живых, табл.1), воздействие Хе было прямо противоположным. Тем не менее, для аденокарциномы Эрлиха направленность эффекта Xe оказалась во многом сходной с таковой для тимоцитов (табл.4).
Многообразие путей взаимодействия Хе с клетками может лежать в основе его разнонаправленного влияния на их биохимическую и функциональную активность в различных условиях жизнедеятельности организма, как результат преобладания того или иного механизма клеточных эффектов газа. Полученные нами результаты, помимо научного интереса, обозначают перспективное направление использования благородных газов в онкологии для разработки новых и модернизации уже существующих методов терапии раковых заболеваний.
Выводы
1. Ксенон повышает жизнеспособность культур тимоцитов крыс и мышей-опухоленосителей при 24-часовом культивировании при температуре 43оС. Напротив, выживаемость клеток перевиваемой мастоцитомы Р-815 при гипертермическом воздействии в атмосфере ксенона значительно снижается.
2. Цитотоксический эффект ксенона на клетки мастоцитомы Р-815 при перерасчете на мг массы газа в клеточной системе может быть связан с дисбалансом окислительно-восстановительных процессов (увеличением секреции малонового диальдегида и снижением уровня оксида азота).
3. В условиях гипертермического воздействия цитопротекторный (на тимоциты мышей-опухоленосителей) и цитотоксический (на опухолевые клетки мастоцитомы Р-815) эффекты ксенона в культуре in vitro обусловлены, соответственно, его возможной анти- и прооксидантной активностью.
Список литературы
1. Белоус А.М., Гордиенко Е.М., Розанов Л.Ф. Замораживание и криопротекция. - М., 1987. - 80 с.
2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах - М.,1972 - 252с.
3. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск, 1992. - 273 с.
4. Дамир Е.А., Буров Н.Е., Макеев Г.Н., Джабаров Д.А. Наркотические свойства ксенона и перспективы его применения в анестезиологии // Анестезиология и реаниматология. - 1996. - № 1. - С.71 - 75.
5. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз).-М.,2001.-192 с.
6. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. -М.: Фирма "Слово", 2006.-556 с.
7. Переверзев А.Е.Кроветворные колониеобразующие клетки и физические стресс-факторы. - Л., Наука, 1986. - 172 С.
8. Трофимова Е.С., Бельский Ю.П., Бельская Н.В., Агафонов В.И. Механизм усиления иммуносупрессорных свойств клеток костного мозга при росте карциномы Эрлиха // Бюлл. эксперим. биол. и мед.-2001.-Приложение 1.-С.75-77.
9. Хлусов И.А., Жуков П.Г., Сухих Г.Т. Клеточные эффекты ксенона in vitro в гипотермических условиях // Клеточные технологии в биологии и медицине.-2007.- № 2.-С. 74-77
10. Хлусов И.А., Наумов С.А., Вовк С.М., Корнетов Н.А., Шписман М.Н., Лукинов А.В., Наумов А.В. Влияние ксенона на клетки и рецепторы // Вестник РАМН.-2003.-№ 9.- С.32-37.
11. Хлусов И.А., Наумов С.А., Серебров В.Ю., Локтюшина Б.А. Влияние ксенона на состав и перекисное окисление липидов в головном мозге мышей // Бюллетень СО РАМН.-2003.-№ 4.-С.42-47.
12. Шахов В.П., Хлусов И.А., Дамбаев Г.Ц., Зайцев К.В., Егорова А.Б., Шахова С.С., Загребин Л.В., Волгушев С.А. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей / Под ред. В.В. Новицкого, В.П. Шахова, И.А. Хлусова.-Томск: STT, 2004.-386 с.
13. Kanner J., Harel S., Granit R. Nitric oxide as an antioxidant // Archives of Biochemistry and Biophysics, 289. - 1991. - P.130-136.
14. Kobayashi H., Suzuki T., Saito S., Sato I., Matsusaka N. Toxicological significance and physiological role of nitric oxide // Toxicology&Ecotoxicology News/Reviews. -1997. - Vol.4. - N.1. - P.15-19.
15. Marx T., Kotzerke J., Musati S., Ring C., Schmidt M., Reinelt H., Frobba G. Time constants of xenon elimination after anaesthesia // Applied Cardiopulmonary Pathophysiology. - 2000. - Vol.9. - P.91 - 96.
16. Sauer O., Roth M., Schirmer T., Rummel G., Kratky C. Low-resolution detergent tracing in protein crystals using xenon or krypton to enhance X-ray contrast // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. - 2002. - Vol.58. - Pt1. - P.60 - 69.
17. Shimm D.S., Gerweck U.E. Hyperthermia in the treatment of cancer // Ann. Intern. Med. - 1984. - V.100. - N 5. - P.757 - 759.
18. Short J.G., Turner P.F. Physical hyperthermia and cancer therapy // Proc. IEEE. - 1980. - V.68. - N 1. - P.133 - 142.
19. Sies H., de Groot H. Role of reactive oxygen species in cell toxicity // Toxicology Letters. - 1992. - Vol.64/65. - P.547 - 551.
20. Wink D.A., Cook J.A., Pacelli R., Liebmann J., Krishna M.C., Mitchell J.B. Nitric oxide (NO) protects against cellular damage by reactive oxygen species // Toxicology letters. - 1995. - Vol. 82/83. - P.221-226.
