CC BY
77
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
29
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние криогеля желатина на пролиферацию и синтетическую активность
фибробластов в модели эксцизионной раны кожи
А.А. Ергешов 1, З.Ю. Сираева 12, Р.Р. Казакова 1, Р.И. Муллин 3, Д.М. Давлиев 3, А.А. Закирова 13, Т.И. Салихова 1, Е.В. Кузнецова 1, Д.Т. Луонг1, И.Н. Савина 4, Т.И. Абдуллин15
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
3 Республиканская клиническая больница, Казань, Россия
4 Университет Брайтона, Брайтон, Великобритания
5 ООО «Биомедтех КФУ», Казань, Россия
Effect of gelatin cryogel on proliferation and synthetic activity of fibroblasts in excision wound model
A.A. Yergeshov1, Z.Y. Siraeva 12, R.R. Kazakova 1, R.I. Mullin 3, D.M. Davliev3,AA. Zakirova 13, T.I. Salikhova 1, E.V. Kuznetsova 1, D.T. Luong 1, I.N. Savina 4, T.I. Abdullin 15
1 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia
2 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
3 Republic Clinical Hospital, Kazan, Russia
4 University of Brighton, Brighton, UK
5 Biomedtech KFU Ltd., Kazan, Russia
Получен экспериментальный образец криогеля на основе желатина с размером пор 50—150 мкм . По данным конфокальной микроскопии и ЛДГ-теста макропористая структура криогеля способствует миграции и пролиферации фибробластов кожи человека в составе матрикса in vitro . Апробирована модель эксцизионной раны кожи крысы для исследования in vivo эффекта криогеля в форме мембраны Криогель способствует существенному повышению числа фибробластов, а также плотности и упорядоченности синтезируемых коллагеновых волокон в образующейся дерме к 7 сут. раневого процесса . Результаты свидетельствуют о стимулирующем влиянии криогеля желатина на активность фибробластов и обосновывают его применимость в качестве ранозаживляющего средства
Ключевые слова: эксцизионная модель раны, раноза-живляющие средства, биоматериалы, криогели, фибробла-сты, коллаген .
We prepared an experimental sample of gelatin based cryogel membrane with pore size of 50—150 ^m . Confocal microscopy and LDH assay showed that the cryogel macroporous structure promotes migration and proliferation of human skin fibroblasts within the matrix in vitro . To assess in vivo effect of the cryogel an excision wound model in rats was tested The cryogel significantly increases the number of fibroblasts as well as the density and order of produced collagen fibers in the dermis to day 7 of the wound healing process The results suggest the stimulating effect of the gelatin cryogel on fibroblasts activity and demonstrate its potential for skin regeneration
Keywords: excision wound model, wound healing agents, biomaterials, cryogels, fibroblasts, collagen
Введение
Разработка высокоэффективных биоматериалов для лечения ран и ожогов является актуальной задачей для современной медицины и фармацевтики . Несмотря на разнообразие коммерческих раноза-живляющих биоматериалов, последние, по результатам наблюдений практикующих врачей, включая авторов, оказывают незначительное позитивное влияние на процессы регенерации кожи
Для создания тканезамещающих материалов и раневых повязок широко используют полимерные гидрогели благодаря их оптимальным механическим и гидратационным свойствам, биосовместимости [1] и возможности применения для контролируемой доставки биологически активных веществ [2]. Значительное внимание исследователей уделено модулированию биологических характеристик гидрогелей путем изменения пористости материала, оказывающей существенное влияние на диффузионные процессы и миграционный потенциал клеток Перспективными являются гидрогели, получаемые
e-mail: tabdulli@gmail . com
методом криополимеризации различных синтетических и природных молекул — криогели, характеризующиеся разветвленной макропористой структурой [3, 4].
Изучение влияния криогелей на процессы заживления кожных ран различной этиологии представляет интерес для выяснения взаимосвязи структуры и активности биоматериалов, что актуально для разработки на их основе эффективных ранозаживляющих средств
Первичный скрининг биологической активности гидрогелевых биоматериалов проводят с использованием различных in vitro моделей [5], тогда как для проведения доклинических исследований определяющим является выбор оптимальной in vivo модели [6, 7]. Согласно исследованиям последних лет, для оценки влияния биоматериалов на посттравматическую регенерацию кожи предпочтительны модель разреза (рассечения)[8], эксцизионная [5, 7, 9—12] и ожоговая [6, 13, 14] модели . Тестирование проводят, как правило, на крысах [11, 12, 14] или свиньях
[7, 15]; при этом не разработаны единые регламенты, определяющие методологические условия проведения эксперимента [6, 16].
Важным критерием эффективности ранозажив-ляющих биоматериалов является восстановление клеточного состава, волокнистого и аморфного компонентов соединительной ткани кожи (дермы) — одной из наиболее пластичных тканей организма [17, 18]. Развитие грануляционной ткани является ключевой фазой раневого процесса, определяющую роль в котором играют дермальные фибробласты, синтезирующие компоненты межклеточного матрик-са и участвующие в формировании волокон дермы [13, 18], а также регулирующие миграционную, синтетическую и пролиферативную активности других клеток дермы [5, 12].
Целью настоящей работы была оценка влияния экспериментального образца криогеля желатина на синтетическую активность и пролиферацию фибро-бластов в модели эксцизионной раны кожи крыс
водили в соответствии с европейскими нормами по защите лабораторных животных [20]. Предоперационную наркотизацию животных проводили изо-флураном (Abbott Laboratories, Великобритания) с помощью испарителя для ингаляционного наркоза IsoFlo (Eickemeyer, Германия), укомплектованного 5-л концентратором кислорода (DeVilbiss, США).
На депилированной межлопаточной части тела животных вырезали два симметрично расположенных относительно позвоночника участка кожи диаметром (0) 12 мм . Для предотвращения стягивания раны за счет естественного посттравматического закрывания краев [9] края раны ограничивали силиконовыми шинами (внутренний 0 = 12 мм, внешний 0 = 25 мм, толщина 0,5 мм) и фиксировали скобами с помощью степлера для кожи Appose™ ULC 35W (Covidien, США) (рис . 1).
Материал и методы
Получение криогеля желатина и исследование in vitro. Бычий желатин (Gelita, Германия) растворяли в деионизованной воде и автоклавировали в стандартных условиях . Мембраны криогеля толщиной 2 мм получали в асептических условиях посредством сшивки желатина глутаровым альдегидом (Acros Organics, США) в чашках Петри в условиях замораживания, как описано в [4]. Криогели размораживали при комнатной температуре и промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (ФСБ).
Для культивирования клеток использовали материалы и реагенты компании ПанЭко (Россия). Первичные фибробласты кожи человека (ФКЧ) выделяли из кожных эксплантов здоровых доноров и культивировали в стерильных условиях в питательной среде a-MEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 ед ./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при температуре + 37°C в увлажненной атмосфере 5% CO2 [19].
Мембраны криогеля размером 1x1 см помещали на поверхность предварительно выращенного монослоя ФКЧ в 24-луночном планшете и культивировали в течение 3, 6 и 9 сут . Матриксы с ФКЧ переносили в новые лунки планшета, промывали ФСБ и детектировали клетки с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ) на микроскопе LSM 780 (Carl Zeiss, Германия) в присутствии 1 мкМ Hoescht 33342, а также по уровню активности клеточной лактатдегидрогеназы (ЛДГ), определяемой с помощью набора «ЛДГ (UV-кинетический)» (Ольвекс Диагностикум, Россия). Для определения ЛДГ клетки после культивирования в матриксах ли-зировали в ФСБ, содержащем 1% тритон Х-100 и 1 мМ фторида натрия Активность ЛДГ оценивали по изменению оптического поглощения раствора НАДН при 340 нм за 1 мин . , нормализованного по массе матрикса
Эксцизионная модель раневого дефекта кожи. Действие криогеля на миграционную, про-лиферативную и синтетическую активность фибро-бластов in vivo изучали на эксцизионной модели раневого дефекта кожи на 30 крысах-самцах линии Wistar массой 260—280 г (ООО «Питомник» РАМНТ, Россия). Эксперименты с животными про-
Рис. 1. Этап реализации эксцизионной модели травмы кожи: операционное животное с фиксированными шинами (описание в разделе «Материал и методы»)
На поверхность одной раны накладывали мембрану криогеля, на поверхность другой — коммерческий гидрогель Hydrosorb® comfort (Paul Hartmann AG, Германия) . Для поддержания влажной среды в ране шины покрывали адгезивной пленкой Hydrofilm® (Paul Hartmann AG, Германия)
Отбор тканевого материала для проведения гистологических исследований осуществляли по окончании срока наблюдения в каждой группе животных на 3 и 7 сут . после проведения прижизненной перфузии раствором 4% формалина в ФСБ Забор материала проводили путем иссечения скальпелем участка раны с зоны травмы с захватом прилегающей к ране ткани, локализованной под шиной (3 мм от края раны), не затрагивая гиподермы . Тканевые образцы фиксировали в растворе 4% формалина в ФСБ
Качественный и количественный анализ клеточного состава регенерирующей дермы осуществляли методом светлопольной микроскопии на микроскопе AxioObserver Z1 (Carl Zeiss, Германия) с использованием воздушного объектива с увеличением x40 . При идентификации фибробластов учитывали размеры клеток и цитологические особенности строения Подсчет клеток производили при увеличении x40 не менее чем в десяти полях зрения на трех случайным образом отобранных срезах, полученных из одного и того же
участка раны у всех животных в группе. Интенсивность синтетических процессов фибробластов выявляли стандартным методом окрашивания колла-геновых волокон по Ван Гизону [21].
Для статистической обработки результатов применяли t-критерий Стьюдента .
Результаты и обсуждение
Влияние криогеля желатина на активность фибробластов in vitro. Полученный на основе желатина экспериментальный криогель представляет собой гидрогель, характеризующийся наличием крупных (размером 50—150 мкм) взаимопроникающих пор (рис . 2). Подобная макропористая структура способствует диффузии воды и питательных компонентов в составе криогеля . Для изучения процессов миграции ФКЧ, мембрану криогеля культивировали на поверхности монослоя клеток в течение 9 сут. Методом ЛСКМ установлено, что ФКЧ мигрируют из монослоя в матрикс в течение первых 3 сут . культивирования и обнаруживаются как в объеме криогеля, так и на его противоположной поверхности Согласно результатам ЛДГ-теста, количество ФКЧ в матриксе увеличивается линейно пропорционально времени культивирования (рис. 3), что коррелирует с данными микроскопии . Это показывает, что ФКЧ проникают и равномерно заселяют криогель желатина . Подобная инфильтрация матрикса фибробластами не наблюдается при использовании плотных гидрогелей на основе желатина (данные не представлены), по-видимому, вследствие ограниченной диффузии в них питательных и газообразных веществ и затрудненной миграции клеток
Таким образом, макропористый криогель является биосовместимым матриксом, поддерживающим рост фибробластов кожи человека in vitro и, следовательно, представляющим интерес в качестве биоматериала для заживления раневых дефектов кожи
Рис. 2. ЛКСМ-изображение криогеля желатина, полученного в условиях криополимеризации глутаровым альдегидом
0.4
0.3 8 0.2 0.1 0.0
3 6 9
Время (сутки)
Рис. 3. Пролиферация ФКЧ в криогеле желатина по данным ЛДГ-теста. Активность ЛДГ оценивали по изменению оптического поглощения НАДН при 340 нм за 1 мин в пересчете на массу криогеля. Представлены средние значения ± стандартные отклонения
Влияние криогеля желатина на активность фибробластов в модели эксцизионной раны кожи крыс. Криогель желатина и материал сравнения — допущенный к применению гидрогель Hydrasorb® comfort — в форме круглой мембраны (0 = 12 мм) наносили на поверхность двух симметричных эксци-зионных ран кожи крысы (рис . 1) так, как описано в разделе «Материал и методы» .
Анализ срезов, окрашенных гематоксилин-эозином, выявил качественные и достоверные (р<0,05) количественные различия в раневом процессе при использовании исследуемых биоматериалов . Так, при использовании материала сравнения (Hydrosorb® comfort) наблюдалась интенсивная воспалительная реакция вплоть до 7 сут . после травмы, что выражалось в инфильтрации регенерирующей дермы полиморфноядерными лейкоцитами как в области демаркационной линии, так и в центре эксцизион-ной раны с незначительным числом фибробластов, не превышающим 19,2±0,9% (р<0,05) от общего числа клеток (табл . ) . В отличие от материала сравнения, в случае применения криогеля желатина фи-бробласты в значительном числе детектировались на 3 сут . после травмы с последующим переходом в преобладающий клеточный тип, достигая к 7 сут эксперимента в центре раны величины 73,7±3,1% (р<0,05) от общего числа клеток (табл . ).
Для оценки синтетической активности фибробла-стов в регенерирующей дерме и выявления новообразованных волокон соединительной ткани был использован метод окрашивания коллагеновых волокон по Ван Гизону [21]. Как следует из рис. 4, криогель желатина способствует интенсивному образованию грануляционной ткани, характеризующейся существенным количеством более упорядоченных и зрелых коллагеновых волокон, чем при использовании гидрогеля Hydrosorb® comfort .
Рис. 4.
Коллагеновые волокна разной степени зрелости (красные) и низкомолекулярные предшественники в регенерирующей дерме в центре эксцизионной раны:
A, Б — через 3 сут.;
B, Г — через 7 сут.
А, В — Hydrosorb® comfort; Б, Г — криогель желатина; Д — контроль (дерма кожи интактных животных). Окраска: по Ван-Гизону. Толщина среза 7 мкм. Ув. х400
Таблица. Количество дермальных фибробластов в области демаркационной линии и в центре эксцизионной раны на 3-и и 7-е сут. после травмы
Группа животных Число фибробластов, % от общего числа клеток
3 сут. 7 сут.
Демаркационная линия
Hydrosorb® comfort 3,2±0,2* 4,0±0,3*
Криогель желатина 29,2±0,9** 54,2±2,4**
Зона регенерирующей дермы эксцизионной раны
Hydrosorb® comfort 11,7±0,6* 19,2±0,9*
Криогель желатина 64,8±2,9** 73,7±3,1**
Контроль 44,0±2,9
* — различия достоверны между экспериментальными группами животных и контрольной группой при р<0,05; ** — различия между группой животных с применением криогеля желатина достоверны как по сравнению с контрольной группой, так и с Hydrosorb® comfort при р<0,05 .
Согласно предшествующим исследованиям, наиболее значительные морфологические изменения в кожных ранах происходят в течение первых 7 сут . заживления [8, 12, 18, 22]. Результаты показывают, что криогель желатина способствует формированию в регенерирующей дерме кожи сети коллагеновых волокон разной степени зрелости, сопоставимой со структурой интактной кожи, за меньший период времени (рис . 4) . Это коррелирует с преобладанием фи-бробластического дифферона клеток, выявленного при количественной оценке клеточных типов (табл . ).
Известно, что в сосочковом слое (рыхлая волокнистая соединительная ткань) интактной дермы преобладают макрофаги, а в сетчатом слое (плотная волокнистая соединительная ткань) — фибробласты и фиброциты [17]. В совокупности, характеристика клеточного состава в зоне травмы и визуальный анализ срезов, окрашенных по Ван Гизону, свидетельствуют о формировании новообразованной дермы, близкой по структуре к сетчатому слою
Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о том, что криогель на основе желати-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
33
на, обладающий макропористой структурой, способствует ускорению восстановления соединительной ткани в дерме, по-видимому, посредством усиления процессов миграции, пролиферации и синтетической активности фибробластов . Выяснение механизма влияния криогеля на дермальные фибробласты и фазы раневого процесса требует проведения дальнейших исследований . Полученный криогель является перспективной основой создания макропористых матриксов для культивирования клеток человека и регенерации тканей
Благодарности
Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров на 2013—2020 гг. Исследования выполнены с использованием оборудования МДЦ АМ КФУ (директор Осин Ю.Н., оператор Кузнецова С.В.), а также оборудования МЦКП КФУ при поддержке Минобрнауки России (ID RFMEFI59414X0003).
ЛИТЕРАТУРА:
I. Drury J . L . , Mooney D . J . Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications . Biomaterials . 2003; 24: 4337-51.
2 . Gupta R ., Shea J ., Scaife C . et al . Polymeric micelles and nanoemulsions as drug carriers: Therapeutic efficacy, toxicity, and drug resistance . J . Control . Release . 2015; 212: 70-7 .
3 . Lozinsky V . I . , Galaev I .Y ., Plieva F . M . et al . Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest . Trends Biotechnol . 2003; 21: 445-51.
4 . Savina, I . N ., Gun'ko V . M ., Turov V .V . et al . Porous structure and water state in cross-linked polymer and protein cryo-hydrogels . Soft Matter. 2011; 7: 4276-83 .
5 . Gottrup F ., Agren M . S ., Karlsmark T . Models for use in wound healing research: а survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue . Wound Repair and Regen . 2000; 8(2): 83-96 .
6 . Dorsett-Martin W.A. Rat models of skin wound healing: a review . Wound Repair and Regen . 2004; 12(6): 591-9 .
7 . Middelkoop E ., van den Bogaerdt A . J ., Lamme E . N . et al . Porcine wound models for skin substitution and burn treatment . Biomaterials . 2004; 25: 1559-67 .
8 . Vidinsky B ., Gal P ., Toporcer T . et al . Histological Study of the First Seven Days of Skin Wound Healing in Rats . Acta Vet . BRNO . 2006; 75: 197-202 .
9 . Galliano R . D ., Michaels J ., Dobryansky M . et al . Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing . Wound repair and regen . 2004; 12: 485-92 .
10 . Sabol F ., Dancakova L ., Gal P . et al . Immunohistological changes in skin wounds during the early periods of healing in a rat model . Veterinarni Medicina . 2012; 57(2): 77-82 .
II. Wang H . -M ., Chou Y . -T ., Wen Z . -H . et al . Novel Biodegradable Porous Scaffold Applied to Skin Regeneration . PLOS One . 2013; 8 (6): e56330 .
12 . Banerjee P ., Suguna L ., Shanthi C . Wound healing activity of a collagen-derived cryptic peptide . Amino Acids . 2014; 47(2): 317-28 .
13 . Metcalfe A . D ., Ferguson M .W . J . Tissue engineering of replacement skin: the crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration . J . R . Soc . Interface . 2007; 4: 413-37 .
14 . Loo Y. , Wong Y. -C ., Cai E .Z . et al . Ultrashort peptide nanofibrous hydrogels for the acceleration of healing of burn wounds . Biomaterials . 2014; 35: 4805-14 .
15 . Sullivan T ., Eaglstein W . H ., Davis S . C . et al . The pig as a model for human wound healing . Wound Repair and Regen . 2001; 9(2): 66-76
16 . ГОСТ ISO 10993-1-2011. Изделия медицинские . Оценка биологического действия медицинских изделий . Часть 1. Оценка и исследования . http://docs . cntd . ru/document/1200100813 .
17 . Данилов Р . К . Раневой процесс: гистогенетические основы . СПб .: ВМедА им . С . М . Кирова, 2008 . 380 .
18 . Sant'Ana E . M ., Ca?ao C . M ., Gouvea P . et al . Rat skin wound healing induced by alternagin-C, a disintegrin-like, Cys-rich protein from Bothrops alternatus venom . Selistre-de-Araujo Int . W . J . 2011; 8(3): 245-52
19 . Rittie L ., Fisher G . J . Isolation and culture of skin fibroblasts . Methods Mol . Med . 2005; 117: 83-98 .
20 . Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes . Text with EEA relevance, http://eur-lex . europa . eu/ legal-content/EN/TXT/?uri = celex:32010L0063 .
21. Саркисова Д . С . , Перова Ю .Л . Микроскопическая техника: Руководство . М . : Медицина, 1996 . 544.
22 . Gal P ., Kilik M ., Mokry B . et al . Simple method of open skin wound healing model in corticosteroid-treated and diabetic rats: standardization of semi-quantitative and quantitative histological assessments . Veterinarni Medicina 2008; 53(12): 652-9 .
Поступила: 20.10.2015
