CC BY
61
удк 581.142:549.25
Э. Р. Кадырова (магистрант) Э. И. Хизбуллина (магистрант) Г. Г. Ягафарова (д.т.н, проф.) И. Г. Мигранова (к.б.н., доц.) Е. Э. Ступак (к.б.н., н.с.) 2
ВЛИЯНИЕ КРАТКОСРОЧНОГО И ДЛИТЕЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС ПРОРОСТКОВ TRITICUM AESTIVUM L.
1 Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра прикладной экологии 450062, г. Уфа ул. Космонавтов, 1, тел. (347)2431737, e-mail: [email protected] 2 Уфимский институт биологии РАН, лаборатория молекулярной и математической генетики 450054, г. Уфа, пр. Октября, 69, e-mail: [email protected]
E. R. Kadyrova E. I. Khizbullina G. G. Yagafarova I. G. Migranova E. E. Stupak 2
EFFECT OF SHORT-TERM AND LONG-LIVED INFLUENCE OF HEAVY METALS ON THE OXIDATIVE STRESS OF TRITICUM AESTIVUM L. SEEDLINGS
1 Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; ph.(347)2431737, e-mail: [email protected]
2 Ufa Institute of Biology of RAS 69, Prospekt Oktyabrya Str, Ufa, 450054, Russia, e-mail: [email protected]
Исследовано действие хронического и кратковременного присутствия эквимолярных концентраций 7п2+, №2+ и Сгб+ в среде на антиоксидан-тную систему проростков мягкой пшеницы (ТтШсыт аез1^ыт Ь.). Показано, что даже кратковременное воздействие небольших концентраций ионов тяжелых металлов вызывает нарушение работы антиоксидантной системы. Концентрации до 0.1 мМ в некоторых случаях оказывают стимулирующее действие, а более высокие концентрации и хроническое воздействие экотоксикантов подавляют перекисьраз-рушающую активность в корнях проростков, в том числе и за счет ингибирования ферментов, входящих в антиоксидантную систему.
Ключевые слова: активные формы кислорода; антиоксиданты; антиоксидантная система; ксенобиотики; окислительный стресс; проростки; пшеница; тяжелые металлы; формирование корневой системы; экотоксиканты.
Присутствие в окружающей среде экоток-сикантов даже в незначительных количествах стало в настоящее время нормой практически для всех современных экосистем. Способность отдельных организмов адаптироваться к изменению компонентного состава среды обитания зависит как от степени токсичности ксенобиотика, его концентрации, экспозиции, так и от Дата поступления 03.04.17
Effect of chronic and short-term presence of equimolar concentration of Zn2+, Ni2+ and Cr6+ in the culture medium on the weak wheat (Triticum aestivum L.) seedlings antioxidant system was studied. It was shown that even short-term influence of heavy metals ion small concentrations causes antioxidant system work violation. 0.1 mM concentration in certain cases have the stimulating effect, but higher concentration and chronic influence of ecotoxicant suppress the peroxide destroying activity in seedlings roots including through inhibition of antioxidant system enzymes.
Key words: antioxidants; antioxidant system; ecotoxicant; formation of root system; heavy metals; oxidative stress; reactive oxygen species; seedling; wheat; xenobiotics.
возможностей самого организма противостоять данного рода воздействиям. В частности, в процессе эволюции выработались следующие механизмы защиты: предотвращение поступления токсикантов в клетку, системы выведения, изолирование поступивших веществ в виде малоактивных метаболических соединений и т.п. В данной работе изучалось функционирование систем, направленных на сни-
жение токсического воздействия поступивших в клетку ксенобиотиков на примере воздействия ионов тяжелых металлов на рост и развитие растений. Тяжелые металлы можно с уверенностью отнести к одним из наиболее опасных экотоксикантов. Подобная характеристика обуславливается их высокой устойчивостью, биологической доступностью, способностью накапливаться в различных органах и токсическими эффектами даже в небольших концентрациях 2'3. По сути, термин «тяжелые металлы» описывает широкую группу веществ, объединенных такими характеристиками, как атомная масса, плотность, токсичность, распространенность в природной среде, степень вовлеченности в природные и техногенные циклы. В настоящее время группа элементов под термином «тяжелые металлы» включает в себя более 40 металлов периодической системы Д.И. Менделеева с атомной массой свыше 50 атомных единиц: V, Сг, Мп, Бе, Со, N1, Си, гп, мо, са, Бп, рь, В1 и др. 4
Тяжелые металлы, подобно другим стрессовым воздействиям, повышают содержание в клетке активных форм кислорода (АФК): гид-роксильного радикала (ОН-), супероксид аниона (О2-), пероксида водорода (Н202). В норме АФК, постоянно образующиеся в клетке в процессе метаболических реакций, оперативно инактивируются антиоксидантной системой, которая состоит из специализированных анти-оксидантных ферментов и низкомолекулярных антиоксидантов 5. При изменении баланса между образованием АФК и активностью ан-тиоксидантной системы в пользу первого, возникает состояние окислительного стресса 6, что приводит к повреждению белков, нуклеиновых кислот, липидов 7. Повреждение липидов не только нарушает мембранные структуры клетки, но и запускает цепную реакцию пере-кисного окисления липидов, приводящую к образованию свободных радикалов. Как правило, степень повреждения зависит от особенностей токсиканта и времени контакта с ним.
В задачу данной работы входило изучение реакции антиоксидантной системы проростков мягкой пшеницы (ТтШеит ав$Июит Ь.) на присутствие в среде культивирования ионов некоторых тяжелых металлов.
Материалы и методы
В работе использовали семена озимой мягкой пшеницы сорта Башкирская 10, предоставленные ФГБНУ Башкирский НИИ сельского хозяйства. Посевной материал обеззаражива-
ли 96%-ным этанолом в течение 1 мин, затем трижды промывали стерильной дистиллированной водой. В экспериментах использовали растворы 2пБО4, №С12 и К2Сг2О7 в концентрации 0.1, 0.5 или 1 мМ.
При исследовании последствий хронического воздействия солей тяжелых металлов на развитие проростков, семена проращивали в соответствующих растворах при 22—23 °С. В качестве контроля использовали дистиллированную воду. Всхожесть определяли по количеству нормально проросших семян на седьмые сутки. К числу нормально проросших, согласно ГОСТ 12038-84, относили проростки, имеющие не менее двух нормально развитых корешков размером более длины семени и росток размером не менее половины его длины с просматривающимися первичными листочками, занимающими не менее половины длины колеоптиля. Перекисьразрушающую активность определяли на четвертые сутки.
Для изучения последствий кратковременного воздействия тяжелых металлов корневую систему четырехсуточных ростков пшеницы, выращенных на дистиллированной воде, помещали в соответствующие растворы солей на 0.5—4 ч. Определение антиоксидантной активности в корнях проростков проводили через 30, 60, 120, 240 мин.
За показатель антиоксидантной активности была принята общая перекисьразрушающая активность в корнях. Использовался колориметрический метод М.А. Королюка, основанный на способности Н202 образовывать с мо-либдатом аммония окрашенный комплекс пероксомолибдата 8. Для определения пере-кисьразрушающей активности использовали экстракт корней, полученный центрифугированием образца при 12000 g в течение 10 мин при 4 оС. К 300 мкл экстракта добавляли 300 мкл 3 мМ Н202, а затем через 1 мин 300 мкл 4%-ного раствора парамолибдата аммония. В контроле смешивали 300 мкл Н202 и 300 мкл парамолибдата, а затем добавляли 300 мкл образца. Изменение содержания пероксида водорода под действием антиоксидантной активности экстракта определяли как разницу между содержанием пероксомолибдата в контроле и образце по поглощению при Э405 на микрофотоколори-метре МКМФ-02, приводя вес образцов к 50 мг.
Результаты и их обсуждение
Существуют данные, что фитотоксич-ность исследуемых нами элементов располагается в ряду Сг6+<гп2+<№2+ 9. Надо сказать,
что в литературе наблюдается довольно большой разброс данных по всхожести пшеницы в присутствии тяжелых металлов, что, вероятно, связано с различием в методах проращивания. Так, показано, что в почве концентрации тяжелых металлов, оказывающие токсичное воздействие, гораздо выше, чем достигаемые в лабораторных условиях 10. В данном исследовании семена проращивались непосредственно в растворе солей, чтобы исключить сорбцию ионов. Результаты воздействия солей хрома, цинка и никеля на всхожесть семян пшеницы в условиях нашего эксперимента представлены в табл. 1
Таблица 1
Всхожесть семян в присутствии различных концентраций солей тяжелых металлов, %
0.1 мМ 0.5 мМ 1 мМ
N1012 60 30 0
гпэси 70 60 20
К2СГ2О7 70 20 0
Падение всхожести во всех случаях было связано с нарушением развития корневой системы проростков, что согласуется с литературными данными о том, что тяжелые металлы накапливаются преимущественно в корнях пшеницы 11. Уже начиная с концентрации солей 0.1 мМ, появлялись проростки длина корней у которых в недельном возрасте не превышала 5 мм. При более высоких концентрациях наблюдались проростки с полностью несформиро-ванной корневой системой. При концентрации солей 1 мМ нормально развитые проростки формировались только на среде, содержащей сульфат цинка, но по скорости роста они в два раза отставали от контрольных. Растворы остальных солей той же концентрации останавливали рост 60% проростков на стадии прокле-вывания, а у проросших отсутствовала корневая система, что приводило в последующем к их гибели. На проклевывание зерновок использованные концентрации растворов солей влияние не оказывали.
Согласно литературным данным, ионы Сг6+,2п2+ и №2+ повышают уровень перекисно-го окисления липидов (ПОЛ) в растениях, что считается показателем развития окислительного стресса, причем степень воздействия металлов на окисление различна. Так, у шпината ионы никеля (0.5 мМ) в большей степени повреждали мембраны, чем ионы цинка в той же концентрации 12. Кроме того, уровень перекис-ного окисления липидов зависит от конкретного растения, например, никель стимулирует ПОЛ в рисе при концентрации 0.2 мМ 9, в то
время как у редиса изменений не наблюдалось и при 1 мМ 6.
Развитие окислительного стресса напрямую связано с работой антиоксидантных систем клетки. В условиях нашего эксперимента хроническое действие растворов 2пБ04, №С12, К2Сг207 приводило к снижению антиоксидан-тной активности экстрактов. В табл. 2 представлен уровень перекисьразрушающей активности в экстрактах корней четырехсуточных проростков, развивающихся в растворах солей. Данные показаны в процентах по отношению к перекисьразрушающей активности проростков, выросших в дистиллированной воде. Интересно, что сульфат цинка, являясь в условиях нашего эксперимента наименее токсичным для роста проростков, практически полностью подавил перекисьразрушающую активность экстракта корней.
Таблица 2 Изменение перикисьразрушающей активности экстрактов корней проростков пшеницы по отношению к контролю, %
0.1 мМ 0.5 мМ 1 мМ
N1012 60 80 0
гпБОд 5 5 0
К2СГ2О7 70 60 0
Результаты экспериментов по влиянию кратковременного воздействия солей на проростки (рис. 1) показали, что под их воздействием скорость разрушения пероксида водорода экстрактами корней проростков в большинстве случаев снижалась на протяжении всего времени наблюдения. Исключение составляли 0.1 мМ раствор №С12 и 0.1—0.5 мМ растворы К2Сг207: в первом перекисьразруша-ющая активность росла на протяжении всего времени наблюдения, во втором повышалась через 30 мин, затем возвращаясь к норме. Ионы цинка снижали скорость разложения пе-роксида водорода экстрактом корней как минимум на 40% уже через 30 мин воздействия и полностью угнетали активность через 1—4 ч в зависимости от их концентрации.
Концентрация активных форм кислорода в клетке контролируется как ферментативными, так и низкомолекулярными антиоксидант-ными системами. Так, у арабидопсиса сеть, кодирующая компоненты антиоксидантной системы, состоит, как минимум, из 152 генов 13. Для эффективного контроля за АФК требуется слаженная работа всех компонентов системы.
Согласно литературным данным, все исследованные нами металлы оказывают влияние на системы образования и утилизации пероксида водорода. Инактивация пероксида водорода в
Рис. 1. Перекись-разрушающая активность экстрактов корней четырехсуточных проростков пшеницы при кратковременном воздействии солей тяжелых металлов: 1 — М1С12; 2 - ЕпБ04; 3 — К2СГ2О7.
клетке обеспечивается иероксидазами, катализирующими восстановление пероксидов, и катала-зой, разрушающей пероксид водорода. Показано, что в низких концентрациях (как правило, меньше 0.05 мМ), тяжелые металлы повышают активность пероксидаз 9' 10. С повышением концентрации металлов работа пероксидаз угнетается. Результаты экспериментов по хроническому воздействию разных концентраций хрома, никеля и цинка неоднозначны и показывают, что в разных условиях работа этих ферментов может как нарушаться, так и поддерживаться на высоком уровне 9' 11' 15. Активность каталазы в присутствии хрома, также стимулируется низкими концентрациями (0.015 мМ) и подавляется высокими 14. При хроническом воздействии на пшеницу наблюдается повышенная активность этого фермента при концентрации хрома 0.1 мМ, в то время как при 0.15 и 0.25 мМ активность снижается 16. Ионы никеля могут как угнетать, так и не оказывать влияние на активность каталазы 9. Воздействие солей цинка (0.1— 0.6 мМ) на проростки полностью угнетает активность каталазы в побеге через 24 ч, а в корнях — через 72 ч 17. Еще один фермент антиоксидант-ной системы, супероксиддисмутаза, образует пе-роксид водорода в процессе инактивации супероксид-аниона. При согласованной работе анти-оксидантных систем образовавшийся Н202 затем инактивируется каталазой и пероксидазой. Обнаружено, что при достижении критических для злаков концентраций тяжелых металлов, ак-
тивность супероксиддисмутазы при хроничес-«-» 1116 18 кой интоксикации растет .
В наших экспериментах кратковременное воздействие 0.1 мМ никеля и хрома, вероятно, приводило к активации каталазы и пероксидазы в этих условиях. Более высокие концентрации, а также хроническое воздействие токсикантов нарушали работу антиоксидантных систем. Истощение систем, инактивирующих пероксид водорода в клетках при хроническом воздействии тяжелых металлов, может быть связано как с общим падением уровня ферментативной активности клеток, так и с повышением содержания супероксид-аниона в клетке. Предполагают, что
супероксид-анион в высоких концентрациях мо-
11
жет инактивировать каталазу , что в сочетании с повышением активности супероксиддисмутазы приводит к накоплению пероксида водорода. Резкое снижение перекись-разрушающей активности под действием цинка, вероятно, связано с нарушением метаболизма железа и непосредственной инактивацией гел-содержащих ферментов избытком цинка в клетке.
Таким образом, в условиях нашего эксперимента, окислительный стресс под действием ионов 2п2+, №2+ и Сг6+ вызван, вероятно, разбалансиров-кой слаженной работы антиоксидантных систем. Развитие окислительного стресса начиналось с момента проникновения ионов в клетку, что со временем проявлялось в перегрузке и угнетении систем инактивации пероксида водорода.
Литература
1. Титов А.Ф., Таланова В.В., Казнина Н.М. Физиологические основы устойчивости растений к тяжелым металлам.— Петрозоводск: Карельский научный центр РАН, 2011.— 71 с.
2. Мамырбаев А.А. Токсикология хрома и его соединений.— Актобе: ТОО «Информационно-полиграфический центр», 2017.— 284 с.
3. Зайнутдинова Э.М., Ягафарова Г.Г. Очистка сточных вод от ионов тяжелых металлов с использованием водных растений // Башкирский химический журнал.— 2013.— Т.20, №3.-С.150-152.
4. Теплая Г.А. Тяжелые металлы как фактор загрязнения окружающей среды // Астраханский вестник экологического образования.— 2013.— №1(23).- С.182-192.
5. Мурзаева С. В. Накопление тяжелых металлов и активность антиоксидантных ферментов в пшенице при воздействии сточных вод // Известия Самарского научного центра РАН.- 2002.- Т.4, №2.- С.260-269.
6. Михайлова И.Д., Егорова И.В., Лукаткин А.С. Окислительные проявления в растениях огурца и редиса при действии ионов никеля // Вестник Мордовского университета.- 2011.- №4.-С.210-211.
7. Загоскина Н.В., Назаренко Н.В. Активные формы кислорода и антиоксидантная система растений // Вестник МГПУ. Серия «Естественные науки».- 2016.- №2(22).- С.9-23.
8. Величко А. К., Соловьев В. Б., Генгин М. Т. Методы лабораторного определения общей перекись разрушающей активности ферментов растений // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского.- 2009.- №14(18).- С.44-48.
9. Hussain M. B., Ali Sh., Azam A., Hina S., Farooq M. A., Ali B., Bharwana S. A., Gill M.B. Morphological, physiological and biochemical responses of plants to nickel stress: A review // Afr. J. Agric. Res.- 2013.- Vol.8(17).- Pp.1596-1602.
10. Бессонова В.П., Иванченко О.Е Накопление хрома в растениях и его токсичность // Питание, биоиндикация, экология.- 2011.- Вып. 16, №2.- С.35-52.
11. Maheshwari R., Dubey R. S. Nickel-induced oxidative stress and the role of antioxidant defence in rice seedlings // Plant Growth Regulation.- 2009.- V.59, №1.- Pp.37-49.
12. Pandey N., Pathak G. C., Pandey D. K., Pandey R. Heavy metals, Co, Ni, Cu, Zn and Cd, produce oxidative damage and evoke differential antioxidant responses in spinach // Braz. J. Plant Physiol.-2009.- V.21, №2.- Pp.103-111.
13. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., Breusegem F. V. Reactive oxygen gene network of plants spinach // Trends Plant Sci.- 2004.-V.9(10).- Pp.490-498.
14. Shanker A. K., Cervantes C., Loza-Tavera H.S. Avudainayagam Chromium toxicity in plants // Environment International.- 2005.- V.31, №5.-Pp.739-753.
15. Солдатова Н.А., Хрянин В.Н. Антиоксидант-ная система защиты растений Cannabis sativa L. при действии соли цинка // Известия ПГПУ
Reference
1. Titov A.F., Talanova V.V., Kaznina N.M. Fiziologicheskie osnovy ustoichivosti rastenii k tiazhelym metallam [Physiological bases of stability of plants to heavy metals]. Petrozovodsk, Karel'skii nauchnyi tsentr RAN Publ., 2011, 71 s.
2. Mamyrbaev A.A. Toksikologiya khroma i ego soedinenii [Toxicology of chromium and its compounds]. Aktobe, «Informatsionno-poligraficheskii tsentr» Publ., 2017, 284 s.
3. Zainutdinova E.M., Iagafarova G.G. Ochistka stochnykh vod ot ionov tiazhelykh metallov s ispol'zovaniem vodnykh rastenii [Wastewater treatment from heavy metal ions using aquatic plants]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2013, vol.20, no.3, pp.150-152.
4. Teplaya G.A. Tiazhelye metally kak faktor zagryazneniya okruzhaiushchei sredy [Heavy metals as a factor of environmental pollution]. Astrakhanskii vestnik ekologicheskogo obrazovaniya [Astrakhan bulletin of environmental education], 2013, no.1(23), pp.182-192.
5. Murzaeva S.V. Nakoplenie tyazhelykh metallov i aktivnost' antioksidantnykh fermentov v pshenitse pri vozdeistvii stochnykh vod [Accumulation of heavy metals and the activity of antioxidant enzymes in wheat under the influence of sewage]. Izvestiya Samarskogo nauchnogo tsentra RAN [Izvestiya of Samara Scientific Center RAS], 2002, vol.4, no.2, pp.260-269.
6. Mikhailova I.D., Egorova I.V., Lukatkin A.S. Okislitel' nye proiavleniya v rasteniyakh ogurtsa i redisa pri deistvii ionov nikelya [Oxidative manifestations in cucumber and radish plants under the action of nickel ions]. Vestnik Mordovskogo universiteta [Bulletin of the University of Mordovia], 2011, no.4, pp.210-211.
7. Zagoskina N.V., Nazarenko N.V. Aktivnye formy kisloroda i antioksidantnaia sistema rastenii [Active forms of oxygen and the antioxidant system of plants]. Vestnik MGPU. Seriya «Estestvennye nauki» [Bulletin of the Moscow City University. Series «Natural Sciences»], 2016, no.2(22), pp.9-23.
8. Velichko A. K., Solov'ev V. B., Gengin M. T. Metody laboratornogo opredeleniya obshchei perekis' razrushaiushchei aktivnosti fermentov rastenii [Methods for the laboratory determination of the total peroxide of the destructive activity of plant enzymes]. Izvestiya PGPU im. V.G. Belinskogo [The Journal of the Penzen State Pedagogical University V.G. Belinsky], 2009, no.14(18), pp.44-48.
9. Khussain M. B., Ali Sh., Azam A., Khina S., Farooia M. A., Ali B., Bkharshchana S. A., Gill M.B. [Morphological, physiological and biochemical responses of plants to nickel stress: A review]. Afr. J. Agric. Res., 2013, vol.8(17), pp.1596-1602.
10. Bessonova V.P., Ivanchenko O.E Nakoplenie khro-ma v rasteniyakh i ego toksichnost' [Accumulation of chromium in plants and its toxicity]. Pitanie, bioindikatsiya, ekologiya [Nutrition, bioindication, ecology], 2011, vol.16, no.2, pp.35-52.
11. Maheshwari R., Dubey R. S. [Nitskel-indutsed okhidative stress and tkhe role of antiokhidant
им В.Г. Белинского,- 2011.- №25,- С.632-634.
16. Subrahmanyam D. Effects of chromium toxicity on leaf photosynthetic characteristics and oxidative changes in wheat (Triticum aestivum L.) // Photosynthetica.- 2008.- V.46(3).- Pp.339-345.
17. D'souza M. R., Devaraj V.R. Induction of oxidative stress and antioxidative mechanisms in hyacinth bean under zinc stress // African Crop Science Journal.- 2012.- V.20, №1.- Pp.17-29.
18. Feigl G., Lehotai N., Molnar A., Ordog A., Rodriguez-Ruiz M., Palma J. M., Corpas F. J., Erdei L., Kolbert Z. Zinc induces distinct changes in the metabolism of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) in the roots of two Brassica species with different sensitivity to zinc stress // Annals of botany.- 2015.- V.116(4).-Pp.613-625.
defentse in ritse seedlings]. Plant Growth Regulation, 2009, vol.59, is.1, pp.37-49.
12. Pandey N., Pathak G. C., Pandey D. K., Pandey R. [Heavy metals, Co, Ni, Cu, Zn and Cd, produce oxidative damage and evoke differential antioxidant responses in spinach]. Braz. J. Plant Physiol., 2009, vol.21, no.2, pp.103-111.
13. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., Breusegem F. V. [Reactive oxygen gene network of plants spinach]. Trends Plant Sci., 2004, vol.9(10), pp.490-498.
14. Shanker A. K., Cervantes C., Loza-Tavera H.S. [Avudainaiagam Chromium tokhitsity in plants]. Environment International, 2005, vol.31, is.5, pp.739-753.
15. Soldatova N.A., Khryanin V.N. Antioksidant-naya sistema zashchity rastenii Cannabis sativa L. pri deistvii soli tsinka [Antioxidant system of plant protection Cannabis sativa L. with the action of a zinc salt]. Izvestiya PGPU im. V.G. Belinskogo [The Journal of the Penzen State Pedagogical University V.G. Belinsky], 2011, no.25, pp.632-634.
16. Subrahmanyam D. [Effects of chromium toxicity on leaf photosynthetic characteristics and oxidative changes in wheat (Triticum aestivum L.)]. Photosynthetica, 2008, vol.46(3), pp.339-345.
17. D'souza M. R., Devaraj V.R. [Induction of oxidative stress and antioxidative mechanisms in hyacinth bean under zinc stress]. African Crop Science Journal, 2012, vol.20, no.1, pp.17-29.
18. Feigl G., Lehotai N., Molnar A., Ordog A., Rodriguez-Ruiz M., Palma J. M., Corpas F. J., Erdei L., Kolbert Z. [Zinc induces distinct changes in the metabolism of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) in the roots of two Brassica species with different sensitivity to zinc stress]. Annals of botany, 2015. vol.116(4), pp.613-625.
