CC BY
13
УДК 577.121.7:577.121.9:602.9:616-003.96:616092.19:616-092.9:616.61-003.93
ВЛИЯНИЕ КОСТНОМОЗГОВЫХ МЕЗЕНХИ-МАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПОЧЕЧНОЙ ТКАНИ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ СТРЕССЕ
Демьяненко1 Е.В., Грызунова2 Г.К., Усай2 Л.И.
1ГУ ЛНР «Луганский государственный медицинский университет имени Святителя Луки», г. Луганск, Украина 2ФГАОУВО Первый московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский университет), г. Москва, Российская Федерация
Аннотация. Известно, что почки крайне чувствительны к действиям различных факторов, но в то же время они являются ключевыми элементами системы адаптации. В последние годы активно изучается возможность применения клеток с высоким пролиферативным потенциалом для коррекции различных состояний, в основе которых лежат ишемические явления. Для этих целей оптимальным считается применение костномозговых мезенхимальных стволовых клеток (МСК). С целью оценки эффективности применения МСК на послестрессовые изменения в почках исследовались показатели функциональной активности почечной ткани крыс -суточного диуреза, концентрации креатинина и мочевины сыворотки крови и мочи, скорости клубочковой фильтрации (СКФ), канальцевой реабсорбции (КР). Отмечалось резкое изменение функциональной активности почек после 24-часовой иммобилизации: увеличение суточного диуреза, повышение концентраций мочевины и креатинина сыворотки крови на фоне уменьшения этих показателей веществ в моче животных, снижение скорости клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции. Исследованием установлено, что в группе животных, получавших клеточную терапию, восстановление показателей функциональной активности почечной ткани происходило в более короткие сроки по сравнению с животными контрольной группы, что может свидетельствовать об активации под действием МСК процессов репарации в тканях внутренних органов, что делает этот метод лечения перспективным для дальнейшего изучения.
Ключевые слова: креатинин, мочевина, канальцевая реаб-сорбция, стресс, мезенхимальные стволовые клетки._
EFFECT OF BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS ON THE FUNCTIONAL PARAMETERS OF THE RAT RENAL TISSUE DURING EXPERIMENTAL STRESS
Demianenko1 E.V., Gryzunova2 G.K., Usay2 L.I.
'Lugansk state medical university named after St. Luke, Lugansk, Ukraine
2First Moscow state medical university named after I.M. Seche-nov, Moscow, Russian Federation
Annotation. It is known that the kidneys are extremely sensitive to the actions of various factors, but at the same time they are key elements of the adaptation system. In recent years, the possibility of using cells with a high proliferative potential for the correction of various conditions based on ischemic phenomena has been actively studied. For these purposes, the use of bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) is considered optimal. In order to assess the effectiveness of MSC in post-stress changes in the kidneys, indicators of the functional activity of the renal tissue of rats — daily diuresis, serum creatine and urea concentrations of serum and urine, glomerular filtration rate (GFR), and tubular reabsorption (CR) were studied. A dramatic change in the functional activity of the kidneys after 24-hour immobilization was noted: an increase in daily diuresis, an increase in the concentrations of urea and serum creatinine against the background of a decrease in these indicators of substances in the urine of animals, a decrease in glomerular filtration rate and tubular reabsorption. The study found that in the group of animals that received cell therapy, recovery of functional activity indicators of the renal tissue occurred in a shorter time compared with animals in the control group, which may indicate activation under the influence of MSCs of repair processes in the tissues of internal organs, which makes this treatment method promising forfurther study.
Key words: creatinine, urea, glomerular filtration, tubular reabsorption, stress, mesenchymal stem cells.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
[1] Биохимические критерии острого и хронического стресса при иммобилизации крыс / А.И. Гурская, Е.А. Отвалко, Н.М. Яцковская, А.А. Чиркин // Веснж ВДУ. 2017. № 1 (98). С. 61-65.
[2] Тупикин В.Д., Родзаевская Е.Б., Уварова Н.А. Гисто-функциональная характеристика кортикальных и околомозговых нефронов почки при реакции на экспериментальный стресс // Известия Саратовского университета, Серия «Химия, Биология. Экология». 2013. Т. 13. Вып. 4. С. 58-65.
[3] Оценка влияния метаболического синдрома, андро-генного дефицита и стресса на развитие хронической болезни почек и печени у самцов белых крыс / Греков Е.А., Кирпатовский В.И., Голованов С.А., Дрожжева В.В., Казаченко А.В. // Экспериментальная и клиническая урология. 2012. № 4. С. 8-13.
[4] Стволовые клетки в комплексном лечении хронической почечной недостаточности (аналитический обзор) / Б.А. Каюпов, С.С. Сапарбаев, С.К. Уалиева, Ж.А. Касымова // Клиническая медицина Казахстана. 2014. T. 1. N 31. C. 7-16.
[5] Кирпатовский В .И. Возможности клеточной терапии в восстановлении нарушенной функции органов мочеполовой системы // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2016. № 1 (56). С. 60-67.
[6] Souza D.B., Silva D., Silva C.M.C. Effects of Immobilization Stress on Kidneys of Wistar Male Rats: A Morpho-metrical and Stereological Analysis // Kidney Blood Press Res. 2011. 34. Р.424-429. DOI: 10,1159/000328331
[7] Spees J.L., Lee R.H., Gregory C.A. Mechanisms of mes-enchymal stem/stromal cell function // Stem Cell Research & Therapy. 2016. 7. Р. 125. DOI: 10,1186/s13287-016-0363-7
Введение. Известно, что действие стрессорных факторов различной природы приводит к гипоксии органов и тканей, которая в свою очередь вызывает активацию свободнорадикальных процессов, развитие ок-сидантного стресса, интенсификацию процессов апоптоза [1, 6]. В виду тесной функциональной связи между надпочечниками, которые первыми реагируют на стрессовые воздействия, и почками в ответные компенсаторно-приспособительные реакции вовлекаются все отделы нефрона [2]. Это подтверждает немаловажную роль почек в становлении системы адаптации организма [2, 6]. Многочисленными исследованиями установлено, что длительные воздействия факторов чрезвычайной интенсивности приводит к изменениям гистоструктуры почек: увеличению площади почечных телец и просвета капсулы Шумлянского-Боумена, дистрофическим изменениям эпителиоцитов почечных канальцев [2, 6]. При этом ведущая патогенетическая роль повреждения паренхимы почек принадлежит перекисному окислению липидов мембран клеток и цитотоксическому действию монооксида азота [1, 2,
REFERENCES
[1] Biohimicheskie kriterii ostrogo i hronicheskogo stressa pri immobilizacii krys / A.I. Gurskaja, E.A. Otvalko, N.M. Jackovskaja, A.A. Chirkin // Vesnik VDU. 2017. № 1 (98). p. 61-65.
[2] Tupikin V.D., Rodzaevskaja E.B., Uvarova N.A. Gisto-funkcional'naja harakteristika kortikal'nyh i okolomo-zgovyh nefronov pochki pri reakcii na jeksperimental'nyj stress // Izvestija Saratovskogo universiteta, Serija «Himija, Biologija. Jekologija». 2013. T. 13. Vyp. 4. p. 58-65.
[3] Ocenka vlijanija metabolicheskogo sindroma, androgen-nogo deficita i stressa na razvitie hronicheskoj bolezni pochek i pecheni u samcov belyh krys / Grekov E.A, Kir-patovskij V.I., Golovanov S.A., Drozhzheva V.V., Kaza-chenko A.V. // Jeksperimental'naja i klinicheskaja urologija. 2012. № 4. p. 8-13.
[4] Stvolovye kletki v kompleksnom lechenii hronicheskoj pochechnoj nedostatochnosti (analiticheskij obzor) / B.A. Kajupov, S.S. Saparbaev, S.K. Ualieva, Zh.A. Kasymova // Klinicheskaja medicina Kazahstana. 2014. T. 1. N 31. C. 7-16.
[5] Kirpatovskij V.I. Vozmozhnosti kletochnoj terapii v voss-tanovlenii narushennoj funkcii organov mochepolovoj sis-temy // Voprosy rekonstruktivnoj i plasticheskoj hirurgii. 2016. № 1 (56). p. 60-67.
[6] Spees J.L., Lee R.H., Gregory C.A. Mechanisms of mesenchymal stem/stromal cell function // Stem Cell Research & Therapy. 2016. 7. R. 125. DOI: 10,1186/s13287-016-0363-7
[7] Souza D.B., Silva D., Silva C.M.C. Effects of Immobilization Stress on Kidneys of Wistar Male Rats: A Morpho-metrical and Stereological Analysis // Kidney Blood Press Res. 2011. 34. R.424-429. DOI: 10,1159/000328331
3]. Чувствительным индикатором действия факторов стресса являются показатели функциональной активности почек. Постоянное повышение частоты встречаемости заболеваний почек ставит перед медиками задачи не только постижения механизмов развития почечной патологии, но и поиска новых инновационных методов лечения. Одним из таких методов является трансплантация мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга [4, 5, 7], которые способны дифференцироваться в тканевые элементы, стимулировать регенерацию и восстановливать поврежденные клеточные структуры путем ситнеза цитокинов и факторов роста [4, 5, 7].
Таким образом целью нашего исследования было изучение показателей функциональной активности почечной ткани крыс (суточного диуреза, концентрации креатинина и мочевины сыворотки крови и мочи, скорости клубочковой фильтрации (СКФ), канальцевой реабсорбции (КР) при экспериментальном стрессе после введения мезенхимальных стволовых клеток.
Материалы и методы. Экспериментальная часть работы выполнена на базе лаборатории кафедры медицинской химии ГУ «Луганский государственный университет имени Святителя Луки». После прохождения двухнедельного карантина в качестве объекта исследования были выбраны 250 половозрелых самцов нелинейных крыс-альбиносов. Все манипуляции проводились с учетом принципов гуманности в соответствии с положениями «Европейской конвенции по защите прав лабораторных животных, используемых для научных целей». С целью получения клеточной культуры МСК после предварительной наркотизации дека-питировали взрослых лабораторных крыс, из полостей длинных трубчатых костей которых питательной средой ИГЛА-МЕМ («Биолот», Россия) вымывали клетки костного мозга. Клетки помещали в специальные флаконы из культурального пластика («CORNING», США), культивировали в питательной среде ИГЛА-МЕМ («Биолот», Россия) с L-глютамином, 10% телячьей эмбриональной сывороткой («Биолот», Россия) и двумя антибиотиками в течение 14 суток при 37° С условиях СО2-инкубатора со сменой среды 1 раз в 5 дней. Культуру фенотипировали непрямым иммуно-флюоресцентным методом с помощью моноклональ-ных антитела к СД 73, СД 105, СД 44, СД 90 и СД 54. В качестве модели экспериментального стресса применяли однократную иммобилизацию животных в индивидуальных фиксирующих камерах. Были сформированы три группы животных: I группа (интактная) состояла из здоровых животных (n=28), которые не
Динамика некоторых показателей функциональной
билизационного стр
подвергались каким-либо воздействиям. II группа (контрольная) включала в себя крыс (п=90), которые были подвержены 24-часовой иммобилизации и через 1 час после нее получали внутривенно по 1мл стерильного физиологического раствора. III группа (экспериментальная) состояла из крыс, которым через 1 час после окончания иммобилизации внутривенно вводили по 5 106 МСК. Для сбора суточного количества мочи животных помещали в обменные клетки на 1, 3, 7, 14, 21 и 30 сутки наблюдения. Стандартными методами в моче определяли концентрацию креатинина и мочевины. Предварительно наркотизированных эфиром крыс выводили из эксперимента путем декапитации на 1, 3, 7, 14, 21 и 30 сутки исследования. Производили забор крови для получения сыворотки, в которой на биохимическом анализаторе определяли содержание мочевины и креатинина. Рассчитывали скорость клу-бочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции воды. Данные обрабатывали программой 10.0» Достоверность различий между группами оценивали по критерию Манна - Уитни. Достоверно значимыми считали отклонения при р <0,05. Данные представлялись в виде медианы и интерквартильного размаха.
Результаты. Исследованием установлено, что показатели функциональной активность почек существенно меняются после 24-часовой иммобилизации (Таблица 1).
Таблица 1
вности почечной ткани после 24-часового иммо-и введения МСК
Показатель Группа Интактные значения Срок наблюдения после иммобилизации (сутки)
1 3 7 14 21 30
Суточный диузер (мл) II 7,1 [6,5; 7,6] 8,8** [8,4; 9,2] 9,6** [8,9; 10,1] 9,1** [8,6; 9,6] 8,5** [8,1; 8,8] 7,4 [6,8; 7,6] 7,2 [6,6; 7,8]
III 8,4** [8; 8,9] 9,4** [8,9; 10,1] 8** ## [7,5; 8,4] 7,4## [6,9; 8] 7,4 [6,8; 7,9] 7,1 [6,6; 7,9]
Креатинин крови (мкмоль/л) II 71,825 [62,245; 5,035] 88,92** [76,35; 97,16] 92,21** [80,05; 120,52] 76,43* [72,43; 82,86] 75,43 [69,73; 81,02] 75,12 [66,94; 77,6] 71,23 [62,1; 73,98]
iii 84,15** [82,26; 91,19] 92,4** [83,75; 99,8] 73,03* # [70,09; 75,02] 72,61 [71,14; 82,51] 71,12 [61,6; 74,9] 70,62 [65,12; 74,51]
Креатинин мочи (мкмоль/л) II 1876 [1772; 1978,5] 1423** [1363; 1541] 1109** [1002; 1183] 1262** [1172; 1304] 1462** [1398; 1517] 1927 [1792; 1976] 1917 [1809; 1987]
iii 1421** [1342; 1572] 1096** [1012; 1179] 1489*** [1448; 1543] 1806## [1772; 1848] 1852 [1764; 1946] 1862 [1795; 1973]
Мочевина крови (ммоль/л) II 6,045 [5,14; 6,925] 8,41** [8,21; 9,31] 9,33** [8,47; 10,06] 8,67** [7,33; 9,63] 7,71 [6,47; 8,41] 6,44 [5,21; 8,57] 6,31 [5,51; 6,73]
III 8,12** 8,47** 7,26* # 6,76# 6,21 6,08
[7,4; 9,12] [7,77; 9,64] [6,73; 8,32] [6,38; 7,31] [4,87; 7,43] [5,03; 6,56]
Мочевина мочи (ммоль/л) II 323,285 [293,614; 377,775] 276,36** [252,534; 304,173] 214,873** [186,794; 239,853] 236,124** [221,318; 252,834] 274,985** [268,362; 298,637] 304,612 [294,839; 332,096] 342,723 [296,582; 371,816]
,,, 269,498** [244,213; 293,218] 204,775** [182,973; 231,642] 279,624" ## [271,568; 294,857] 314,758## [298,912; 340,427] 328,427 [292,847; 365,185] 356,372 [294,134; 372,972]
СКФ (мл/мин) II 0,133 [0,125; 0,141] 0,098** [0,075; 0,107] 0,083** [0,076; 0,088] 0,098** [0,093; 0,103] 0,115** [0,106; 0,119] 0,132 [0,122; 0,134] 0,133 [0,129; 0,146]
,,, 0,096** [0,085; 0,1] 0,081** [0,075; 0,091] 0,11" # [0,1; 0,116] 0,126# [0,121; 0,135] 0,137 [0,129; 0,144] 0,133 [0,126; 0,143]
КР (%) II 96,239 [95,933; 96,642] 93,685** [91,668; 94,292] 91,855** [91,341; 92,275] 93,599** [92,984; 94,27] 94,784** [94,406; 95,243] 96,132 [95,868; 96,394] 96,39 [96,076; 96,722]
iii 93,559** [93,235; 93,996] 92,313** [90,897;9 2,722] 95,02" ## [94,658; 95,165] 96** [95,883; 96,059] 96,148 [95,609; 96,805] 96,184 [96,067; 96,645]
Показатели креатинина в сыворотке крови у контрольных крыс достигли своего максимального значения на 3 сутки наблюдения и достоверно превысили интактные показатели на 28,36%. У животных опытной группы этот показатель на 3 сутки мониторинга был наиболее высоким и статистически не отличался от показателей группы контроля. С 7 суток исследования отмечалось медленное снижение уровня креати-нина как в контрольной, так и в экспериментальной группе, при этом к 30 сутками во второй группе уровень креатинина достиг интактных цифр, в то время как в третьей группе цифры креатинина сыворотки крови не отличались от исходных значений уже с 14 суток.
Показатели мочевины сыворотки крови на 3 сутки наблюдения превысили интактные значения на 54,34% в контрольной группе и на 40,1% в экспериментальной. При этом в последующие сутки отмечалось более выраженное снижение показателя в сыворотке крови крыс, получавших клеточную терапию, по сравнению с контрольными значениями в результате чего показатели мочевины у опытных крыс достигали интактных значений на 21 сутки мониторинга.
Показатели мочевины и креатинина мочи в контрольной группе были ниже интактных значений в 1 сутки на 14,5% и 24,15% соответственно, на 3 сутки -на 33,53% и 40,88%, с 7 суток в группе № 2 уровни мочевины и креатинина мочи постепенно повышались, однако были достоверно ниже интактных цифр: на 7 сутки на 26,96% и 32,73% соответственно, на 14 сутки - на 14,94% и 22,07%. У крыс, леченных МСК, на 1 и 3 сутки наблюдения показатели мочевины и креатинина мочи статистически не отличались от аналогичных показателей группы контроля, а на 7 сутки достоверно
превышали контрольные показатели соответственно на 18,42% и 17,99%, на 14 сутки - соответственно на 14,46% и 23,53%.
Полученные результаты о динамике креатинина и мочевины в сыворотке крови и моче могут свидетельствовать о нарушении азотовыделительной функции почек при стрессовом воздействии [1, 3].
При этом суточный диурез увеличился на 1 и 3 сутки как во второй (на 23,94% и 35,21%), так и в третьей группе (на 18,31% и 32,39%). У контрольных крыс суточный диурез увеличился на 7-е сутки на 28,17%, на 14-е - на 19,72%, а у крыс, получавших МСК, он был ниже контрольных значений на 7 сутки на 12,09%, на 14 сутки - на 12,94%. Что касается скорости клубочко-вой фильтрации и канальцевой реабсорбции, то у контрольных животных эти показатели были ниже интактных в 1 сутки на 26,315% и 2,65% соответственно, на 3-и сутки - на 37,6% и 4,56%, на 7-е сутки - на 26,315% и 2,74%, на 14-е сутки - на 13,53% и 1,51%. У экспериментальных животных показатели СКФ превышали контрольные значения на 7-е сутки на 12,245%, на 14-е сутки - на 9,57%. Значения канальцевой реабсорбции у крыс, леченных МСК, на 7-е сутки повысились на 1,52%, а на 14-е - на 1,28% по сравнению с контрольными значениями.
Полученные экспериментальные данные указывают на более выраженные нарушения фильтрационной способности почек на фоне иммобилизационного стресса, что приводило к умеренной гиперазотемии. Умеренное изменение диуреза можно объяснить снижением канальцевой реабсорбции воды. При этом изменение канальцевой реабсорбции воды при стрессовых воздействиях было незначительным. Опытным путем было установлено положительное влияние
---■—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 49 ~
мезенхимальных стволовых клеток на функциональные показатели почечной ткани на разных сроках постиммобилизационного периода. Более быстрые темпы восстановления показателей функциональной активности почек косвенно подтверждают регенераторные эффекты мезенхимальных стволовых клеток, которые, вероятно, реализуются через гуморальные факторы путем регуляции внутриклеточных сигнальных систем, а также путем модуляции ангиогенеза и влияния на микроокружение ткани восстанавливаемого органа [4, 5, 6, 8]. Все это делает мезенхимальные стволовые клетки привлекательными для дальнейших исследований с целью замещения поврежденных клеток и их структур и восстановления функций тканей и органов при различных патологических процессах.
Выводы. Установлено, что острая иммобилизация приводит к ухудшению показателей функциональной активности почечной ткани, что проявляется снижением скорости клубочковой фильтрации и каналь-цевой реабсорбции на фоне повышения суточного диуреза и нарастания креатинина и мочевины в сыворотке крови.
Применение аллогенных мезенхимальных стволовых клеток после острой иммобилизации способствовало более быстрому восстановлению функциональных показателей почек до интактных цифр у крыс экспериментальной группы по сравнению с контролем, что делает применение клеточной терапии перспективным для дальнейшего изучения.
