CC BY
42
УДК 591.1:591.2:612.3:616-092
ВЛИЯНИЕ КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ НА ХОЛИНЕРГИЧЕСКУЮ РЕГУЛЯЦИЮ СОКРАЩЕНИЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ МЫШИ В МОДЕЛИ СИНДРОМА РАЗДРАЖЕННОГО КИШЕЧНИКА
Шайдуллов И.Ф. - ассистент, Хаертдинов Н.Н. - к.б.н., доцент, Шарафутдинова Д.Н. - аспирант, Порфирьев А.Г. - к.б.н., доцент, Абдулхаков С.Р. - к.м.н., доцент, Каримова Р.Г. - д.б.н., профессор, Ситдикова Г.Ф. - д.б.н., профессор
ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»
Ключевые слова: синдром раздраженного кишечника, висцеральная гиперчувствительность, короткоцепочечные жирные кислоты, М- и Н-холинорецепторы, сокращения толстой кишки
Keywords: irritable bowel syndrome, visceral hypersensitivity, short-chain fatty acids, M and N-cholinergic receptors, colon contractility
Синдром раздраженного кишечника (СРК) это функциональное расстройство желудочно-кишечного тракта, которое характеризуется хронической
абдоминальной болью, дискомфортом, вздутием живота и нарушениями в работе кишечника [7]. Механизмы развития СРК до конца не выяснены, а этиологические факторы включают висцеральную гиперчувствительность, нарушения
эпителиальной проницаемости и моторики желудочно-кишечного тракта, умеренное воспаление, дисбиоз, и, как следствие, изменения в оси кишечник-мозг [6, 7]. Перистальтика желудочно-кишечного тракта и секреция слизи, а также чувствительность к механическим или химическим сенсорным стимулам могут быть изменены вследствие нарушений в энтеральной нервной системе [4, 9, 11]. Данные последних лет указывают на значительную роль микробиоты кишечника и ее метаболитов в развитии СРК [6]. Короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК) образуются кишечными бактериями в результате ферментации пищевых волокон преимущественно в
проксимальном отделе толстой кишки, где их концентрации у человека достигают 70140 мМ [1]. Помимо обеспечения кишечного гомеостаза и регуляции водно-электролитного баланса КЖК принимают участие в регуляции моторики [3, 5, 10, 12].
Однако, роль КЖК в развитии двигательной дисфункции при СРК практически не изучена.
Целью нашей работы было проанализировать висцеральную
гиперчувствительность, морфологию
стенки толстой кишки и уровень КЖК в модели пост-воспалительной СРК у мыши. Кроме того, исследовано влияние КЖК на холинергическую регуляцию сокращений препарата толстой кишки мыши при СРК.
Материал и методы исследований. Эксперименты проводились на самцах белых лабораторных мышей в соответствие с Директивой Совета Европейских сообществ (24 ноября 1986 года; 86/609/ЕЕС) и одобрены Локальным этическим комитетом КФУ (протокол № 8 от 05.05.2015). Модель СРК была индуцирована у мышей путем интраректальной инфузии 1 % уксусной кислоты в возрасте Р10-Р21, что вызывает умеренное воспаление и впоследствии приводит к висцеральной
гиперчувствительности у взрослых животных [2]. Гиперчувствительность толстой кишки мышей оценивали в баллах по шкале интенсивности брюшного сгибательного рефлекса (БСР) в ответ на расширение толстой кишки [16].
Для гистологического анализа образцы толстой кишки фиксировали в 10 % формалине и обрабатывали с
использованием стандартного протокола. Залитые парафином ткани разрезали на срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. Окрашенные препараты оценивались слепым методом двумя независимыми исследователями.
КЖК определяли в образцах кала (1 г) с помощью газожидкостного хроматографического анализа (Agilent, США). В качестве стандартов использовались коммерческие уксусная, пропионовая и масляная кислоты. Анаэробный индекс (Ai) рассчитывали в относительных единицах (о. е.) по формуле: Ai = EC3, C4/C2, где C2 - ацетат, C3 - пропионат и C4 - бутират. Общий уровень КЖК представлен как сумма всех концентраций кислот и изокислот в мкг/г.
Сократительная активность
сегментов проксимального отдела толстой кишки мыши регистрировалась в изометрических условиях с
использованием 4-канальной системы для изолированных органов (Biopac, США). В течение всего эксперимента сегмент толстой кишки омывался аэрированным раствором Кребса. Регистрировали сократительную активность, вызванную
Гистологический анализ стенки толстой кишки не выявил различий в морфологии между двумя группами. Существенных структурных повреждений тканей толстой кишки при СРК не наблюдалось. Таким образом, в используемой нами модели
поствоспалительной СРК умеренное воспаление в толстой кишке, индуцируемое в ранний постнатальный период, приводит к висцеральной гиперчувствительности у взрослых животных без морфологических изменений стенки толстой кишки [2, 14].
Анализ содержания КЖК и изо-кислот в фекалиях мышей показал
аппликацией карбахолина (1 мкМ) -неспецифического агониста М- и Н-холинорецепторов, бетанехола (100 мкМ) - агониста М-холинорецепторов и эпибатидина (10 мкМ) - специфического агониста Н-холинорецепторов. Оценивали максимальную амплитуду сокращения до и после применения КЖК в контрольной группе и группе с моделью СРК.
Статистический анализ проводился методами непараметрического и параметрического анализа с
использованием программного
обеспечения OriginPro (OriginLab, США). Использовали парный ^критерий Стьюдента или тест ANOVA для множественных сравнений, чтобы определить статистические различия для независимых выборок.
Результат исследований. Нами было обнаружено, что в ответ на растяжение толстой кишки при объемах 0,35 и 0,5 мл показатели БСР в опытной группе были значительно выше, чем в контрольной группе (Р<0,05), что указывает на висцеральную
гиперчувствительность в модели СРК у мышей (Таблица 1).
повышение уровней уксусной,
пропионовой, масляной и изовалериановой кислоты в образцах от мышей группы с моделью СРК (Рисунок 2). Кроме того, наблюдалось повышение общего уровня изо-кислот с 0,07±0,01 мкг/г в контрольной и до 0,1±0,01 мкг/г в группе мышей с моделью СРК (п=5, P<0,05). Повышение уровней пропионовой и масляной кислот может указывать на активацию условно-патогенной флоры и строгих анаэробов [1]. На это же указывает и снижение значения анаэробного индекса с -0,35±0,05 о.е. в контрольной группе до -0,44±0,05 о.е. при СРК (п=5, P<0,05). Согласно литературным
Таблица 1 - Показатели брюшного сгибательного рефлекса в ответ на растяжение толстой кишки мышей контрольной и СРК групп_
Группы n Объем растяжения, мл
0,1 0,25 0,35 0,5 0,65
Контроль 6 0,29±0,11 0,86±0,15 1,77±0,18 2,8±0,12 3,64±0,09
СРК 6 0,5±0,07 1,07±0,09 2,67±0,08* 3,86±0,2* 3,94±0,28
*P<0,05 - относительно контрольной группы
данным у пациентов с СРК также наблюдали высокие концентрации КЖК одновременно с повышением
представителей микрофлоры,
продуцирующих ацетат, пропионат и бутират (Veillonella и Lactobacillus) [1, 8,
13].
а Контроль б СРК
Рисунок 1 - Гистологические образцы стенки толстой кишки у мышей контрольной группы (а) и мышей с моделью СРК (б) в возрасте P45. Срезы окрашены гематоксилином и эозином
Рисунок 2 - Уровень КЖК в фекалиях мышей контрольной и СРК групп. Концентрации уксусной, пропионовой и бутановой кислот в фекалиях контрольных мышей и мышей с СРК (а). Концентрация изобутановой (Ю4), изовалериановой (Ю5) и изокапроновой (Ю6) кислот в фекалиях контрольной и СРК групп (б). *Р<0,05 - относительной показателей контрольной группы
Далее проанализировано влияние КЖК на холинергические механизмы регуляции сокращения препарата толстой кишки в контроле и при моделировании СРК. Известно, что М-холинорецепторы являются первичной мишенью действия ацетилхолина, активация которых вызывает сокращения гладкомышечных клеток. Кроме того, ацетилхолин активирует Н-холинорецепторы,
экспрессирующиеся на энтеральных нервах и усиливающие энтеральную
нейротрансмиссию [15]. Добавление агонистов М- и Н-холинорецепторов вызывало резкое увеличение тонуса сегмента кишки: амплитуды сокращений, вызванные карбахолином, бетанехолом и эпибатидином составили 1,85±0,11 г (п=6), 1,95±0,15 г (п=10) и 1,21±0,25 г (п=6), соответственно (Рисунок 3). Инкубация
препаратов в ацетате, пропионате или бутирате натрия приводила к значительному снижению амплитуды эпибатидин-вызванных препарата, что
об ингибирующем на Н-холинорецепторы
карбахолин и сокращений свидетельствует действии КЖК
нервных окончаниях (Рисунок 3). При этом бутират натрия обладал наиболее выраженными эффектами на
сократительную активность. В условиях СРК эффекты КЖК на карбахолин и эпибатидин вызванные сокращения не проявлялись (Таблица 2).
экспрессирующиеся на энтеральных
Рисунок 3 - Влияние КЖК на амплитуду вызванных карбахолином, бетанехолом и эпибатидином сокращений сегмента толстой кишки мыши контрольной группы. Оригинальные записи вызванных карбахолином (КХ) (а), бетанехолом (в) и эпибатидином (д) сокращений проксимального отдела толстой кишки мыши до и после инкубации бутановой кислоты (10 мМ). Стрелкой указано время начала аппликации веществ. Амплитуда вызванных карбахолином (б; 1 мкМ), бетанехолом (г) и эпибатидином (е) сокращений толстой кишки до (белый) и после инкубации в ацетате натрия (10 мМ; светло-серый), пропионате натрия (10 мМ; серый) и бутирате натрия (10 мМ; черный). *Р<0.05 - относительно исходных значений амплитуды вызванных сокращений
Таблица 2 - Эффекты КЖК на амплитуду вызванных карбахолином, бетанехолом и эпибатидином сокращений препарата толстой кишки мыши в модели СРК._
Агонисты холинорецепторов
карбахолин бетанехол эпибатидин
Исходные значения 1,41±0,06 0,93±0,16 1,39±0,14
Ацетат натрия 1,09±0,05 0,92±0,04 1,13±0,1
Пропионат натрия 1,22±0,07 0,86±0,07 1,28±0,11
Бутират натрия 1,07±0,05 0,81±0,1 0,99±0,18
*P<0,05 - относительно контрольной группы
Заключение. Таким образом, в модели пост-воспалительной СРК у мышей наблюдалась висцеральная
гиперчувствительность без
морфологических изменений стенки толстой кишки. Анализ содержания КЖК в фекалиях выявил повышение
концентраций уксусной, пропионовой, масляной и общего уровня изокислот, что согласуется с литературными данными об изменении уровня КЖК у пациентов с СРК [8, 13]. Анализ влияния КЖК на вызванные активацией М- и Н-холинорецепторов сокращения препарата толстой кишки показал, что КЖК подавляют ответы, вызванные аппликацией карбахолина и эпибатидина, не влияя на ответы, вызванные аппликацией бетанехола. Эти данные указывают на то, что эффекты КЖК опосредуются через Н-холинорецепторы энтеральных нервных окончаний, усиливающих энтеральную
нейротрансмиссию [15]. В условиях СРК ингибирующие эффекты КЖК не проявлялись, что, по-видимому, может быть связано с изменением экспрессии или регуляции активности ионных каналов и рецепторов, отвечающих за
сократительную активность, что может быть одним из факторов усиления моторики при СРК. Работа поддержана грантом РФФИ №19-315-90084.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бельмер, С. В. Короткоцепочечные жирные кислоты в лечении функциональных заболеваний кишечника у детей: теоретическое обоснование и практическое применение / С. В. Бельмер, М. Д. Ардатская, А. Н. Акопян. - Москва: Прима Принт, 2015. - 48 с.
2. Al-Chaer, E. D. A new model of chronic visceral hypersensitivity in adult rats induced by colon irritation during postnatal development / E. D. Al-Chaer, M. Kawasaki, P. J. Pasricha // Gastroenterology - 2000. -Vol. 119 - N. 5 - P. 1276-1285.
3. Cherbut, C. Motor effects of short-chain fatty acids and lactate in the gastrointestinal tract / C. Cherbut // Proceedings of the Nutrition Society. - 2003. -Vol. 62 - N. 1 - P. 95-99.
4. Chey, W. Y. Colonic motility abnormality in patients with irritable bowel syndrome exhibiting abdominal pain and diarrhea / W. Y. Chey, H. O. Jin, M. H. Lee, S. W. Sun, K. Y. Lee // American Journal of Gastroenterology - 2001. - Vol. 96 - N. 5 - P. 1499-1506.
5. Dass, N. B. The relationship between the effects of short-chain fatty acids on intestinal motility in vitro and GPR43 receptor activation / N. B. Dass, A. K. John, A. K. Bassil, C. W. Crumbley [et al.] // Neurogastroenterology and Motility. - 2007. -Vol. 19 - N. 1 - P. 66-74.
6. Drossman, D. A. AGA technical review on irritable bowel syndrome / D. A. Drossman, M. Camilleri, E. A. Mayer, W. E. Whitehead // Gastroenterology. - 2002.
- Vol. 123 - N. 6 - P. 2108-2131.
7. Enck, P. Irritable bowel syndrome / P. Enck, Q. Aziz, G. Barbara, A. D. Farmer [et al.] // Nature Reviews Disease Primers - 2016.
- Vol. 2 - P. 1-24.
8. Gargari, G. Fecal Clostridiales distribution and short-chain fatty acids reflect bowel habits in irritable bowel syndrome / G. Gargari, V. Taverniti, C. Gardana,
C. Cremon [et al.] // Environmental Microbiology. - 2018. - Vol. 20 - N. 9 - P. 3201-3213.
9. Gwynne, R. Synaptic Transmission at Functionally Identified Synapses in the Enteric Nervous System: Roles for Both Ionotropic and Metabotropic Receptors / R. Gwynne, J. Bornstein // Current Neuropharmacology. - 2007. - Vol. 5 - N. 1 -P. 1-17.
10. Ono, S. Short-chain fatty acids d e c r e as e the frequency of spontaneous contractions of longitudinal muscle via enteric nerves in rat distal colon / S. Ono, S. I. Karaki, A. Kuwahara // Japanese Journal of Physiology. - 2004. - Vol. 54 - N. 5 - P. 483493.
11. Peiris, M. Peripheral Kv7 channels regulate visceral sensory function in mouse and human colon / M. Peiris, J. R. F. Hockley,
D. E. Reed, E. S. J. Smith, D. C. Bulmer, L. A. Blackshaw // Molecular Pain. - 2017. -Vol. 13 - P. 1-16.
12. Shaidullov, I. F. Short chain fatty acids and colon motility in a mouse model of
irritable bowel syndrome / I. F. Shaidullov, D. M. Sorokina, F. G. Sitdikov, A. Hermann [et al.] // BMC Gastroenterology. - 2021. -Vol. 21 - N. 1 - P. 1-12.
15. Tobin, G. Muscarinic receptor subtypes in the alimentary tract / G. Tobin, D. Giglio, O. Lundgren // Journal of Physiology and Pharmacology. - 2009. - Vol.
O. Demir, F. Simsek, Y. C. Kaplan [et al.] // Indian Journal of Pharmacology - 2016. - Vol. 48 - N. 4 - P. 424-429.
13. Sun, Q. Alterations in fecal short-chain fatty acids in patients with irritable bowel syndrome: A systematic review and meta-analysis / Q. Sun, Q. Jia, L. Song, L. Duan // Medicine (United States) - 2019. -Vol. 98 - N. 7.
16. Yang, B. Changes of cytokine levels in a mouse model of post-infectious irritable bowel syndrome / B. Yang, X. Zhou, C. Lan // BMC Gastroenterology. - 2015. -Vol. 15 - N. 1 - P. 1-7.
60 - N. 1 - P. 3-21.
14. Temiz, T. K. Effect of nitrergic system on colonic motility in a rat model of irritable bowel syndrome / T. K. Temiz,
ВЛИЯНИЕ КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ НА ХОЛИНЕРГИЧЕСКУЮ РЕГУЛЯЦИЮ СОКРАЩЕНИЙ ПРЕПАРАТА ТОЛСТОЙ КИШКИ МЫШИ В МОДЕЛИ СИНДРОМА РАЗДРАЖЕННОГО КИШЕЧНИКА
Шайдуллов И.Ф., Хаертдинов Н.Н., Шарафутдинова Д.Н., Порфирьев А.Г., Абдулхаков С.Р.,
Каримова Р.Г., Ситдикова Г.Ф.
Резюме
Синдром раздраженного кишечника (СРК) относится к многофакторным заболеваниям, одним из симптомов которого является нарушение двигательной функции кишечника. Целью нашей работы был анализ влияния КЖК на сокращения сегмента проксимального отдела толстой кишки мыши, вызванных активацией рецепторов ацетилхолина, при моделировании СРК. Мыши в модели СРК продемонстрировали висцеральную гиперчувствительность, при этом гистологический анализ ткани толстого кишечника не выявил значительных отличий в двух группах. Анализ КЖК показал значительное увеличение концентраций уксусной, пропионовой и масляной кислот в фекалиях мышей СРК группы. При исследовании холинергической регуляции сократительной активности сегмента толстой кишки было выявлено, что в контроле бутират натрия, пропионат натрия и ацетат натрия приводили к угнетению сократительных ответов, вызванных карбахолином - неспецифическим агонистом М- и Н-холинорецепторов и эпибатидином - специфическим агонистом Н-холинорецепторов, при этом ответ на аппликацию бетанехола - агониста М-холинорецепторов не изменялся. В условиях моделирования СРК ингибиторные эффекты КЖК на сокращения, вызванные карбахолином и эпибатидином, не проявлялись. Полученные данные свидетельствуют о том, что в поствоспалительной модели СРК мыши наряду с увеличением уровня КЖК, изменяются их эффекты на сократительную активность толстого кишечника, что может быть одним из факторов усиления моторики при СРК.
EFFECTS OF SHORT-CHAIN FATTY ACIDS ON THE CHOLINERGIC REGULATION OF COLONIC MOTILITY IN A MICE MODEL OF IRRITABLE BOWEL SYNDROME
Shaidullov I.F., Khaertdinov N.N., Sharafutdinova D.N., Porfiriev A.G., Abdulkhakov S.R.,
Karimova R.G., Sitdikova G.F.
Summary
Irritable bowel syndrome (IBS) refers to a multifactorial disease, one of the symptoms of which is an impaired colon motility. The aim of our work was to analyze the effect of SCFAs on the contraction of the proximal mouse colon specimens, caused by the activation of acetylcholine receptors, in the model of IBS. Mice with a model of IBS showed visceral hypersensitivity, while histological analysis of their colon tissues did not reveal significant differences from the control group. The SCFAs level analysis showed a significant increase in the concentrations of acetic, propionic, and butyric acids in the feces of mice from the IBS group. In study of cholinergic regulation of the contractile activity of the colon segment, it was found that in control sodium butyrate, sodium propionate and sodium acetate decreased contractile responses caused by carbachol, a nonspecific agonist of M- and N-cholinergic receptors and epibatidine, a specific agonist of N-cholinergic receptors. However, SCFAs did not affect the response evoked by bethanechol, an agonist of M-cholinergic receptors. At the same time, we did not observe the inhibitory effects of SCFAs on the contractions induced by carbachol and epibatidine. The obtained data indicate that in the postinflammatory IBS model of a mouse, along with an increase in the level of SCFAs, their effects on the colon contractility were significantly impaired, which may be one of the factors of increased motility in IBS.
