CC BY
54
Literatura
1. Vikipediya. Biotekhnologiya. [Elektronnyjy resurs] - Rezhim dostupa: https://ru.wikipedia.org/wiki/ Biotekhnologiya (data obrashcheniya: 17.01.2019).
2. Nikul'nikov V. S. Biotekhnologiya v zhivotnovodstve: ucheb. posobie dlya studentov vuzov. -M.: KolosS, 2007. - 534 s.
3. Bremel R.D., Yom H.C., Bleck G.T. Alteration of milk composition using molecular genetics // J. Dairy Sci. - 1989. - V. 72. - R. 2826-2833.
4. Fadiel A., Anidi I., Eichenbaum K. Farm animal genomics and bioinformatics: an update // Nucleic Acids Research. - 2005. - V. 33 - P. 6308-6318.
5. Kompleksnaya programma razvitiya biotekhnologij v Rossijskoj Federacii na period do 2020 goda (ot 24 aprelya 2012g. № 1853p-P8) [Elektronnyj resurs] - Rezhim dostupa: http://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/70068244 (data obrashcheniya: 28.01.2019).
6. Zhigachev A.I., Ernst A. O nakoplenii gruza mutacij v porodah krupnogo rogatogo skota pri intensivnyh tekhnologiyah vosproizvodstva i uluchsheniya po celevym priznakam: o novyh podhodah k ocenke plemennogo materiala, uglublennogo geneticheskogo analiza rezul'tatov selekcii na osnove dostizhenij biotekhnologii // Sel'skohozyajstvennaya biologiya. - 2008. - № 6. - S. 25-32.
УДК 636.52/.58:579.62:571.27 DOI 10.24411/2078-1318-2019-11107
Аспирант А.В. ДУБРОВИН
(ФГБОУ ВО СПбГАУ, ООО «БИОТРОФ+», dubrovin@biotrof.ru)
Канд. биол. наук Л.А. ИЛЬИНА (ФГБОУ ВО СПбГАУ, ООО «БИОТРОФ+», ilina@biotrof.ru) Канд. ветеринар. наук О.Б. НОВИКОВА (ВНИВИП - филиал ФНЦ «ВНИТИП» РАН, ksuvet@mail.ru)
ВЛИЯНИЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ НА ОСНОВЕ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ НА ЯИЧНУЮ ПРОДУКТИВНОСТЬ И ИММУННЫЙ ОТВЕТ КУР-НЕСУШЕК ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ЭПИЗООТИЧЕСКИМ ШТАММОМ SALMONELLA ENTERITIDIS
Известно, что здоровье и продуктивность птицы во многом зависят от состояния пищеварительной системы. У сельскохозяйственных животных и птиц слизистая оболочка кишечника формирует большую поверхность контакта с внешней средой и представляет собой основные ворота для проникновения антигенов [1]. Одна из наиболее распространённых инфекционных болезней в птицеводстве в Российской Федерации - это сальмонеллез, вызываемый бактериями рода Salmonella. Данный микроорганизм также нередко ассоциируется со вспышками болезней пищевого происхождения и у людей [2]. Патологический процесс, вызванный некоторыми видами сальмонелл, инициирует у макроорганизма экспрессию генов, в том числе цитокинов (IL-1ß, IL-6, IL-17, IL-22), которые составляют основу системы врожденного иммунитета и способствуют развитию воспалительной реакции. Важную роль в контроле сальмонеллеза играют также антимикробные пептиды дефензины [3], которые подразделяются на два основных класса: а-дефензины и ß-дефензины. У птиц были обнаружены только ß-дефензины, аналогами которых являются галлинацины: Gal-1, Gal-1a, Gal-2, Gal-4 и др. [4]. Известно, что дефензины обладают антимикробными свойствами в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, грибов и ряда вирусов [5] и способны стимулировать приобретенный иммунный ответ против патогенов. Однако целостного представления о формировании иммунного ответа у птицы в ответ на поражение патогенными сальмонеллами до сих пор не сформировалось.
В последние годы научно доказано [6,7], что достойной альтернативой применению антибиотиков могут стать эфирные масла и препараты на их основе. Один из таких примеров - кормовая добавка Интебио®, основанная на смеси натуральных эфирных масел, которые в
составе препарата обладают антимикробной активностью, антиоксидантным действием и противовоспалительным эффектом. Применение данной кормовой добавки позволяет снизить или даже полностью исключить использование антибиотиков. Масла, входящие в состав кормовой добавки, препятствуют возникновению респираторных заболеваний, уменьшают падеж птицы.
Цель исследований было изучение влияния кормовой добавки на основе смеси эфирных масел Интебио® на яичную продуктивность и иммунный статус кур-несушек.
Материалы, методы и объекты исследования. Экспериментальная часть исследования проходила в условиях вивария ВНИВИП - филиала ФНЦ ВНИТИП РАН, где был поставлен опыт на взрослых курах-несушках с применением кормовой добавки на основе эфирных масел Интебио®.
Исследуемая птица - взрослые куры-несушки кросса Ломанн Белый возрастом более 300 дней в количестве 40 голов содержались с разделением на группы-аналоги: контрольная и опытная. Обе группы содержались в идентичных условиях, с одинаковыми условиями кормления и поения. Вся птица вместе с основным рационом получала кормовой антибиотик Стафак-110, при этом опытная группа также получала кормовую добавку Интебио® с первого дня опыта. Через 3 недели после начала опыта половина поголовья каждой группы была заражена эпизоотическим штаммом S. enteritidis в количестве 5*108 КОЕ в грудную мышцу, после чего было произведено дальнейшее разделение на группы: контроль, зараженный контроль, опыт, зараженный опыт. Спустя сутки после заражения проводился отбор проб тканей слепых отростков (n=3) на дальнейшее лабораторное исследование. Ежедневно проводился контроль веса яиц.
Лабораторное исследование проводилось в молекулярно-генетической лаборатории компании ООО «БИОТРОФ+». Тотальная РНК из образцов была выделена с помощью набора Aurum Total RNA («BioRad», США) согласно инструкции производителя. При помощи набора iScript RT Supermix («BioRad», США) была проведена реакция обратной транскипции для получения кДНК на матрице РНК. Реакция амплификации проводилась при помощи набора SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix («BioRad», США) согласно протоколу производителя. Список праймеров представлен в таблице.
Таблица. Праймеры для оценки экспрессии генов иммунитета
Ген Действие Праймеры
СХС К60 Хемокин. Участвует в передаче сигналов F: AGACTCATTCCAAGTTCATCCA R: TTTGTTCTTTGCTTTAGGATGC
Gal-10 Бета-дефензины птицы. Дефензины -катионные пептиды иммунной системы. F: GCTCTTCGCTGTTCTCCTCT R: CCCAGAGATGGTGAAGGTG
IL6 Интерлейкины. Сигнальные молекулы. F: AGGACGAGATGTGCAAGAAGTTC R: TTGGGCAGGTTGAGGTTGTT
b- Actin Бета-актин. Гены домашнего хозяйства (контроль) F: ATTGTCCACCGCAAATGCTTC R: AAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC
Расчет относительной экспрессии был произведен при помощи метода 2 -ДДС (Ь^ак & Schmittgen, 2001). В качестве референсного гена был выбран ген белка Ь-Асйп.
Результаты исследования. На протяжении опыта в целом средний вес яиц был наиболее высоким в опытной группе, получавшей кормовую добавку на основе смеси эфирных масел.
Среди зараженных групп пик снижения яичной продуктивности был отмечен через 2 дня после заражения. Средний вес яиц в опытной заражённой группе в день пика снижения яйценоскости упал на 5,6% в сравнении с опытной интактной группой. В то же время в заражённой контрольной группе упал на 10% в сравнении с контрольной интактной группой. В среднем после заражения в обеих группах вес яиц упал на 3% в сравнении с интактными аналогами. Стоит отметить, что в контрольной группе значительно чаще, чем в опытной, отмечались случаи расклева яиц.
70 68 66 64 62 60
Контроль Зараженный контроль
Опыт
Зараженный опыт
Рис. 1. Средний вес яиц (г) в течение недели после заражения птицы
Через сутки после заражения птицы уровень экспрессии генов, участвующих в иммунном ответе, различался в зависимости от группы. Результаты исследования экспрессии в тканях слепых отростков кур-несушек показаны на рис. 2. Данные демонстрируют уровень экспрессии генов относительно контрольной интактной группы.
Рис. 2. Уровень относительной экспрессии генов, связанных с иммунитетом, в слепых отростках
кур-несушек через сутки после заражения
Интерлейкин 6 (IL6) - это противовоспалительный цитокин (относится к сигнальным молекулам). Основная функция сигнальных молекул - привлечение дополнительных лейкоцитов из кровооборота к месту инфекции, чтобы повысить сопротивление эпителиальных клеток инфекции. Отмечается, что в контрольной зараженной группе уровень экспрессии гена интерлейкина 6 был ниже, чем в интактной, при этом в опытной зараженной группе уровень экспрессии данного гена был более, чем в 1,5 раза выше, в сравнении с контрольной группой без заражения.
Галлинацин 10 (Gal-10) - это бета-дефензин, играет жизненно важную роль во врожденном иммунном ответе на бактериальные инфекции. Иммунные клетки используют дефензины для уничтожения бактерий, поглощённых при фагоцитозе. Бета-дефензины обнаруживаются в лейкоцитах и эпителиальных клетках. Экспрессия гена галлинацина 10 во всех трех группах была ниже уровня контроля, однако в опытной зараженной группе экспрессия была более, чем в 2 раза выше, в сравнении с контрольной зараженной группой.
К60 - хемокин, группы СХС, участвующий в передаче сигналов между иммунными клетками. Экспрессия хемокина группы СХС К60 в контрольной зараженной группе был в 7 раз выше по сравнении с контролем без заражения. При этом экспрессия в опытной группе была выше в 14 раз в интактной группе и в 15 раз - в зараженной группе.
Наблюдения показали, что уровень экспрессии противовоспалительного цитокина ГЬ-6 и бета-дефензина 0а1-10, используемого для уничтожения антигенов, в опытной группе без заражения был ниже, чем в контрольной группе, при этом значительно выше контрольной группы был уровень экспрессии хемокина СХС К60, участвующего в передаче сигналов между иммунными клетками. Также было отмечено, что экспрессия всех исследованных генов в опытной зараженной группе была выше, чем в контрольной зараженной группе. Полученные данные могут свидетельствовать, что при применении кормовой добавки на основе эфирных масел организм, не подверженный заражению, находился в более стабильном состоянии с признаками более высокой готовности к иммунному ответу, а спустя сутки после заражения эпизоотическим штаммом enteritidis наблюдался более эффективный запуск иммунного ответа. О более стабильном состоянии кур, получавших кормовую добавку, также свидетельствовал более высокий средний вес яиц как в зараженной, так и незараженной группах.
Выводы. Таким образом, данные результаты могут свидетельствовать об иммуномодулирующих свойствах кормовой добавки, так как под её воздействием наблюдался более эффективный запуск иммунитета. Было обнаружено, что добавление в рацион кур-несушек кормовой добавки на основе эфирных масел приводило к повышению иммунной резистентности и увеличению среднего веса яиц. Иммунный ответ у птицы, получавшей кормовую добавку, при заражении был более выраженным, а снижение яичной продуктивности было менее выраженным.
Исследование выполнено при поддержке гранта Правительства Российской Федерации № 14. W03.31.0013.
Литература
1. Лаптев Г. Кормление животных и микрофлора // Животноводство России. - 2010. - № 2. -С. 56-57.
2. Mughini-Grass L., Enserink R., Friesema I., Heck M., Duynhoven Y., Pelt W. Risk factors for human salmonellosis originating from pigs, cattle, broiler chickens and egg laying hens: a combined case-control and source attribution analysis // PLoS ONE. - 2014 - Vol. 9(2). - P. 1-9.
3. Akbari M.R., Haghighi H.R., Chambers J.R., Brisbin J., Read L.R., Sharif S. Expression of antimicrobial peptides in cecal tonsils of chickens treated with probiotics and infected with Salmonella enterica Serovar Typhimurium // Clinical and Vaccine Immunology. - 2008 - №15 -P. 1689-1693.
4. Lynn D.J., Higgs R., Loyd, A.T., O'farrelly C., Herve-Grepinet V., Nys Y., Brinkman F.S., Yu P.L., Soulier A., Kaiser P., Zhang G. and Lehrer R.I. Avian beta-defensin nomenclature: a community proposed update // Immunology Letters. - 2007. - №110. - P. 86-89.
5. Ganz T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity // Nature Reviews Immunology. -2003 - №3. - P. 710-720.
6. Крюков В.С., Глебова И.В. Антибактериальное действие эфирных масел лекарственных растений (обзор) // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2017. - №3. - С. 5-25.
7. Yang Ch, Kabir Chowdhury M.A., Yongqing Hou, Joshua Gong. Phytogenic Compounds as Alternatives to In-Feed Antibiotics: Potentials and Challenges in Application // Pathogens - 2015. - Vol. 4. - P. 137-156.
Literatura
1. Laptev G. Kormlenie zhivotnyh i mikroflora // ZHivotnovodstvo Rossii. - 2010. - № 2. -S. 56-57.
2. Mughini-Grass L., Enserink R., Friesema I., Heck M., Duynhoven Y., Pelt W. Risk factors for human salmonellosis originating from pigs, cattle, broiler chickens and egg laying hens: a combined case-control and source attribution analysis // PLoS ONE. - 2014 - Vol. 9(2). - P. 1-9.
3. Akbari M.R., Haghighi H.R., Chambers J.R., Brisbin J., Read L.R., Sharif S. Expression of antimicrobial peptides in cecal tonsils of chickens treated with probiotics and infected with Salmonella enterica Serovar Typhimurium // Clinical and Vaccine Immunology. - 2008 - №15 -P. 1689-1693.
4. Lynn D.J., Higgs R., Loyd, A.T., O'farrelly C., Herve-Grepinet V., Nys Y., Brinkman F.S., Yu P.L., Soulier A., Kaiser P., Zhang G. and Lehrer R.I. Avian beta-defensin nomenclature: a community proposed update // Immunology Letters. - 2007. - №110. - P. 86-89.
5. Ganz T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity // Nature Reviews Immunology. -2003 - №3. - P. 710-720.
6. Kryukov V.S., Glebova I.V. Antibakterial'noe dejstvie efirnyh masel lekarstvennyh rastenij (obzor) // Problemy biologii produktivnyh zhivotnyh. - 2017. - №3. - S. 5-25.
7. Yang Ch, Kabir Chowdhury M.A., Yongqing Hou, Joshua Gong. Phytogenic Compounds as Alternatives to In-Feed Antibiotics: Potentials and Challenges in Application // Pathogens - 2015. - Vol. 4. - P. 137-156.
