CC BY
25
СЕРИЯ «БИОЛОГИЧЕСКИЕ НА УКИ»
УДК 582.232.2:579.222:546.55
Л.М. Батыр
ВЛИЯНИЕ КООРДИНАЦИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕДИ (II) НА
СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКА И ОЛИГОПЕПТИДОВ В БИОМАССЕ ЦИАНОБАКТЕРИИ SPIRULINA PLATENSIS CNM-CB-02
Институт Микробиологии и Биотехнологии, Академии Наук Молдовы
Введение. Цианобактерии являются одной из самых древних групп организмов на Земле, и в ходе эволюции разработали различные механизмы для использования источников энергии. Эта группа прокариот стала важным объектом изучения в микробиологии и фикобиотехнологии, благодаря ценному биохимическому составу, интенсивным процессам обмена веществ, значительному темпу роста, высокой продуктивности и возможности управлять процессом культивирования [1, 2, 3].
Цианобактерии служат в качестве исходного материала для пищевой и фармацевтической промышленности, животноводства и растениеводства, косметики и парфюмерии, в связи с высоким содержанием белка, аминокислот, липидов, полиненасыщенных жирных кислот, витаминов, ферментов, каротиноидов, хлорофилла, фикобилипротеинов, полисахаридов, гормональные вещества, антибиотики и других веществ с ярко выраженным биологическим действием. Одним из видов цианобактерий, который привлекает внимание многих специалистов, является Spirulina platensis [2, 3, 4, 5, 6].
Биомасса спирулины содержит более 100 важных биологически активных веществ, 70% высококачественного белка с незаменимыми аминокислотами, полиненасыщенные жирные кислоты, богатое разнообразие витаминов и минералов, которая успешно используется в пищевой и фармацевтической промышленности [2, 3, 6, 7].
Спирулина имеет широкий диапазон положительного воздействия на организм человека и животных, такие как компенсация дефицита витаминов и минералов, восстановление и нормализация метаболизма печени, обладает антитоксическим эффектом, помогает избавиться от токсинов, стимулирует иммунную систему, уменьшает содержание сахара и холестерина в крови, и служит средством профилактики атеросклероза [2, 3, 4].
Проведенные в последние годы исследования показали, что регулирование содержания биологически активных веществ, входящих в состав биомассы различных цианобактерий и микроводорослей, можно управлять с помощью физических и химических агентов. Из химических соединений координационные соединения металлов составляют отдельную группу в отношении регуляции роста и развития микроорганизмов, и стимуляторов биосинтетических процессов [2].
52
Многочисленные исследование, проведенные в последние годы, показали возможность использования координационных соединений Zn(II), Co(II), Fe(II), Fe(III), Mn(II) для культивирования различных микроорганизмов (грибы, бактерии, дрожжи). В результате были получены повышенные количества различных биологически активных веществ и разработаны новые способы и модели производства биомассы микроорганизмов с высоким содержанием биологически активных веществ [7, 8].
Исследование биологической роли меди представляет интерес, так как этот элемент входит в состав белков и некоторых ферментов таких как, цитохромоксидаза, уриказа, алдолаза, каталаза, супероксиддисмутаза, церулоплазмин, допамин B-гидроксилаза, лизилоксидаза, тирозиназа и моноаминоксидаза, участвует в метаболизме углеводов и синтезе витаминов комплекса А и В, а также обладает бактерицидными, противогрибковыми и антиканцерогеными свойствами [2, 5].
В больших количествах медь наряду с цинком и железом токсична, её токсичность зависит от таких факторов, как рН, окислительновосстановительного потенциала, температуры, влажности, а также от взаимодействия с другими ионами [2].
Результаты исследований, описанные в литературе о влиянии соединений меди на рост и развитие цианобактерий и микроводорослей, подчеркнули тот факт, что в ответ на стресс, вызванный присутствием высоких концентраций меди, цианобактерии и микроводоросли проявляют различные механизмы защиты клеток [9, 10, 11].
Таким образом, при культивировании зеленых водорослей Scenedesmus sp. и Scenedesmus obliquus в присутствии меди, было установлено снижение роста и развития культуры, снижения содержания белка, углеводов и фотосинтетических пигментов, а также взаимодействия с пептидными связями гистонов [10, 11].
Представляют интерес научные исследования, связанные с изменениями качества и количества белков в биомассе спирулины, полученной при культивировании в присутствии высоких концентраций меди. Они имеют большое значение для получения новых данных о синтезе новых белковых компонентов, в ответ на стрессовую реакцию вызванной повышенной концентрацией меди.
Механизмы регулирования синтеза белков определяются различными факторами, в том числе и высокой адаптивностью цианобактерии к изменениям химического состава культуральной среды. Важным аспектом в физиологии цианобактерии Spirulina platensis является способность адаптироваться к изменениям условий окружающей среды. Так в случае высоких концентраций тяжелых металлов спирулина способна оброзовать металло-органические комплексы и изменить химический состав [3, 4].
Результаты проведенных исследований о влиянии меди на цианобактерию Spirulina platensis показали, что при концентрации 0,05 - 0,2 мг/л Cu(II) увеличивается содержание внутриклеточного пролина и
53
супероксиддисмутазы в результате окислительного стресса, вызванного присутствием высоких концентраций меди в культурной среде [12].
Учитывая двойную роль меди в качестве важного элемента, но в то же время токсичного, микроорганизмы, включая цианобактерию Spirulina platensis, обладают механизмами для поддержания концентрации внутриклеточной меди на уровне, который не мешает поддержанию нормального гомеостаза и не представляет риск токсичности [12].
Таким образом, целью исследования являлось изучение влияния координационных соединений Cu(II) на содержание белка и пептидов в биомассе цианобактерии Spirulina platensis CNM-CB-02.
Материалы и методы. Объектом исследования послужила цианобактерия Spirulina platensis, хранящаяся в Национальной Коллекции Непатогенных Микроорганизмов Института Микробиологии и Биотехнологии АН РМ. В качестве стимуляторов содержания белка и пептидов в биомассе цианобактерии Spirulina platensis были использованы координационные соединения Cu(II), добавляемые в среду культивирования в концентрации 2, 4 и 6 мг/л на 2-ой день культивирования (таблица 1).
Культивирование спирулины осуществлялось в колбах Эрленмейера, по 100 мл биомассы спирулины, при температуре 30-320C, освещении 3000 люкс в течение 7 дней.
Координационные соединения были синтезированы сотрудниками лаборатории «Неорганической и физической химии», МГУ и любезно предоставлены член-корреспондентом, профессором Аурелианом Гуля.
Содержание белка определяли по методу Lowry [13].
Определение олигопептидов (до 10kDa) определяли по методу Lowry [13] с использованием трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Для этого, к исследуемому образцу добавляется 20% - ный раствор ТХУ (1:1), после 10 минутного перемешивания проба центрифугируется при 5000 оборотов/мин. К 0,1 мл надосадочной жидкости добавляется 0,4 мл дистиллированной воды и 2 мл смеси реагента А и В (в соотношении 49:1, где А - 2% карбонат натрия в 0,1 N гидроксид натрия; реагент В - 0,5% сульфата меди в 1,0%-ом растворе цитрата натрия), и через 10 мин добавляются 0,2 мл реактива Фолина. После 30 мин измеряется плотность раствора при длине волны 750 нм. Содержание олигопептидов в % определяли по формуле: Е750^10^0,32^100%/м
Е750 - экстинкция при 750 нм
10 - разбавление
0,32 - коэффициент, рассчитанный из калибровочного графика, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин
м - масса пробы (мг/мл)
Результаты и обсуждение. По литературным данным содержание белка в биомассе спирулины определяется физико-химическими параметрами культивирования и физиологическим состоянием культуры. Повышенное содержание белка отмечено в лаг фазе, со старением культуры уменьшается количество и качество белка.
54
Таблица 1 - Координационные соединения Cu(II)
Координационные соединения Структура лиганда
[Cu(Li-H)NO3] °zN \0/ O N°3 ' ( Cu'-g — N \
[Cu(Li-H)CH3COO] °/""l
[Cu(L2-H)CH3COO] °^CNuNH
[Cu(L3-H)CH3COO] °СНз ©CJ-H
[Cu(L4-H)CH3COO] °^) H^CCuNH
[Cu(L-H)Cl] c‘ /°H
[Cu(L-H)Br] Br r^1^°Cu°H /°H
[Cu(L2-H)NO3] N°3 H^CCu-°%v°H
При культивировании цианобактерии Spirulina platensis в присутствии новых координационных соединений Cu(II) было установлено, что синтез белков и олигопептидов ингибируется (рисунок 1).
Таким образом, при добавлении координационных соединений Cu(II) в питательную среду при концентрациях 2, 4 и 6 мг/л содержание белка уменьшается с увеличением их концентрации.
Для большинства металлокомплексов Cu(II) при их концентрации 2 мг/л содержание белка остается практически на уровне контроля или превышает на 18% при добавлении соединения [Cu(L2-H)NO3]. С увеличением концентрации соединениях до 6 мг/л, содержание белка в биомассе спирулины снижается на 28% по сравнению с контролем. Снижение содержания белка в биомассе происходит как ответ на стресс, вызванный высокими концентрациями меди.
55
Рисунок 1 - Содержание белков и олигопептидов в биомассе спирулины, культивируемой в присутствии координационных соединений Cu(II): 1. [Cu(Li-H)NO3], 2. [Cu(Li-H) CH3COO], 3. [Cu(L2-H)CH3COO], 4. [Cu(L3-H)CH3COO], 5. [Cu(L4-H)CH3COO],
6. [Cu(L-H)Cl], 7. [Cu(L-H)Br], 8. [Cu(L2-H)NO3]
В результате проведённых исследований также видно, что содержание олигопептидов в биомассе уменьшается с ростом концентраций большинства соединений меди, за исключением соединения [Cu(L1-H)NO3], [Cu(L-H)Br] и [Cu(L2-H)NO3] при добавлении которых наблюдается увеличение содержания олигопептидов. Максимальным эффектом обладает [Cu(L-H)Br], так как при концентрации 2 и 6 мг/л содержание олигопептидов по сравнению с контролем увеличивается на 59 и 37%, соответственно. Подавление синтеза олигопептидов в биомассе спирулины наблюдается при культивировании в присутствии координационных соединений [Cu(L1-H)CH3CQQ], [Cu(L2-H)CH3COO] и [Cu(L3-H)CH3COO] при их концентрации 2-6 мг/л, где содержание олигопептидов уменьшается на 16 - 25%. Можно сделать вывод, что на содержание пептидов оказывает влияние не только сама медь, но и лиганд.
Заключение:
1. Новые координационные соединения меди, используемые в этом исследовании в концентрации 4 - 6 мг/л, показывают ингибирующий эффект на синтез белка, а содержание белка зависит от природы соединения и его концентрации. Для большинства металлокомплексов Cu(II) при их концентрации 2 мг/л содержание белка остается практически на уровне контроля или превышает на 18% при добавлении соединения [Cu(L2-H)NO3].
3. Максимальное содержание олигопептидов наблюдается при культивировании спирулины в присутствии координационного соединения [Cu(L-H)Br], которое содержит атом брома в составе лиганда и при концентрации 2 и 6 мг/л, синтез олигопептидов увеличивается на 59 и 37%, соответственно.
56
Литературные источники:
1. Perez L., Abraham C. //Rev Cubana Hem Inm Hem. 2002. vol.18. Nr. 2.
2. Rudic V. et al. //Ficobiotehnologie. Chisinau, 2007. 364 p.
3. Ciumac D. Autoref. al tezei de dr in §t. biologice. Chisinau, 2008. 26 p.
4. Zosim L. Autoref. al tezei de dr in §tiinfe biologice. Chisinau, 2007. 22 p.
5. Hernandes E., Olguin E. //Environl Technol. 2002. Vol.23. p.1369-1377.
6. Mazo G., Savvin S. //Information Newsletter. 2002. Vol.27. p.138;
7. David S., Bivol C., Rudic V. //Analele §t. ale USM. 2005. P.241-243;
8. Zaretskaia E., Gmoshinskii I. //Vopr. Pitan. 2004. Vol.73. Nr.1. P.45-53.
9. Masatoshi U., Satoshi T. //Physiol Plantarum. 2007. Vol.131. P.519-526.
10. Stefanie K., Knauer K. //Journal of Phycology. 2008. Vol.44. Nr.2. P.311-319.
11. Wilde K., Stauber J. //Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2006. P.174-185
12. Deng L., Zhu X., Wang X. //Biodegradation. 2007. Vol.18. P.393-402.
13. Lowry O.H., Rosebrough N.J. //Journal Biol. Chem. 1951. P.265.
L.M. Batir
THE EFFECT OF COORDINATION COMPOUNDS OF Cu(II) ON THE CONTENT OF PROTEINS AND PEPTIDS IN BIOMASS OF CYANOBACTERIUM SPIRULINA
PLATENSIS CNM-CB-02
Institute of Microbiology and Biotechnology Academy of Sciences of Moldova
Summary
The modification of proteins and peptides contents in spirulina biomass at the cultivation in the presence of new coordination compounds of Cu(II) has been determined. The proteins and peptides contents obtained from the spirulina biomass cultivated in the presence of coordination compounds of Cu(II) is modified significantly from the control and depends on the concentration and the nature of ligand of the compounds. The maximum content of peptides 12,33% is absolutely dry biomass, was obtained by the administration of the coordinative compound [Cu(L-H)Br].
57
