CC BY
34
УДК 616-092.9
ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАТОВ ПОЛИФЕНОЛОВ ИЗ СЕВЕРНЫХ ЯГОД КЛЮКВЫ, БРУСНИКИ И ЧЕРНИКИ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ КРЫС ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ CCL4
А.Е.Гуляев, Л.В.Коваленко, Е.А.Белова, *З.Т.Шульгау, **Ш.Д.Сергазы, В.В.Столяров
EXPLORING THE ROLE OF CRANBERRY, COWBERRY, BLUEBERRY POLYPHENOLS IN SURVIVAL OF LABORATORY ANIMALS UNDER THE CCL4 INTOXICATION
A.E.Gulyaev, L.V.Kovalenko, E.A.Belova, *Z.T.Shul'gau, **Sh.D.Sergazy, V.V.Stolyarov
Сургутский государственный университет, *Националъный центр биотехнологии (Астана, Казахстан), **Назарбаев Университет (Астана, Казахстан), [email protected]
Проведено исследование с целью выявления цитопротекторного и органопротекторного эффекта экстрактов северных ягод в тесте выживаемости экспериментальных животных при условии жёсткой интоксикации гепатотропным ядом — четыреххлористым углеродом ^Ц. В результате было установлено, что на фоне летального острого отравления четыреххлористым углеродом, введение концентрата полифенолов в виде экстрактов северных ягод (клюквы, брусники, черники) частично обеспечивало выживание животных.
Ключевые слова: экстракт северных ягод, клюква, брусника, черника, полифенолы, антиоксидантная активность, противовоспалительный потенциал, цитопротекторный эффект
A study was conducted to identify the cytoprotective and organoprotective effect of northern berries extracts in the survival test on experimental animals under severe intoxication with hepatotropic venom — carbon tetrachloride CCL4. The concentrate of polyphenols in the form of extracts of northern berries (cranberries, cowberries, blueberries) was administered after the lethal dose of carbon tetrachloride and to some extent it contributed to the survival of laboratory animals.
Keywords: extract of northern berries, cranberries, cowberry, blueberry, polyphenols, antioxidant activity, anti-inflammatory potential, cytoprotective effect
Введение. Дикорастущие ягоды, типичные для Аляски, севера Канады и севера Европы — Клюква (Vacciniumsubgen. Oxycoccus), Брусника
(Vacriniumvitis-idaea), Черника (Vacriniummyrtfflus), а именно их полифенольные компоненты, представляют объект интенсивных исследований в последнее десятилетие. Эти же ягоды типичны и для северных регионов Сибири, но исследования и публикации по ним — малочисленны.
Наиболее полно потенциальные выгоды использования этих ягод были представлены в 2007 году на International Berry Health Benefits Symposium. Исследователи представили достаточно оптимистичные материалы по результатам использования ягод при сердечно-сосудистых заболеваниях, нейродеге-неративных, других заболеваниях, связанных со старением, а также при ожирении и даже при некоторых злокачественных опухолях человека [1].
К настоящему времени предполагают, что отвечают за биологические эффекты ягод разнообразные компоненты фенольного типа, среди которых были выделены следующие: (1) флавоноиды (анто-цианы, флавоны и флавонолы); (2) дубильные вещества; (3) стильбеноиды; и (4) фенольные кислоты [2].
Из всех этих соединений наиболее изученными являются антоцианы (пигменты, отвечающие за красный и темные цвета ягод), которые продемонстрировали антиоксидантную, противовоспалительную и противораковую биологическую активность [3, 4].
Предполагают, что уровень концентрации ан-
тоцианов высок именно в северных дикорастущих ягодах в отличие от культивируемых в Северной Америке [5] а, следовательно, можно ожидать и более выраженной биологической активности. Но сообщений, касающихся биологических свойств северных ягод России, в доступной литературе пока недостаточно для составления сколько-нибудь объективного представления относительно их терапевтического потенциала.
В попытке восполнения данного дефицита мы представляем настоящее сообщение, содержащее данные по внешним проявлениям цитопротекторного и органопротекторного эффекта экстрактов северных ягод в тесте выживаемости экспериментальных животных при условии жёсткой интоксикации гепатотропным ядом — четыреххлористым углеродом
Материалы и методы. Объектом исследования служили экстракты ягод клюквы, черники, брусники, собранных в летне-осенний период 2015 года в Сургутском районе Ханты-Мансийского округа. Начальная стадия обработки включала гомогенизацию ягод 1 кг в 1 л воды при температуре 25°С и фильтрацию через сита. Субстанцию экстрагировали с использованием этанола (0,4 л) при температуре 25° С Этаноловый экстракт пропускали через фильтровальную бумагу и концентрировали при 35°С с использованием роторного испарителя, суспендировали в воде (30 мл), а затем суспендировали с н-гексаном (3*30 мл), чтобы удалить каротиноиды, жиры и воски, в последующем дополнительно разводили в 90 мл
Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier) о Complete + Censored
vi vr u S
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6
o
■-ё 0.5
o p
o
e
vi it
al
lu
m
u
C
0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 -0.1
8
Time
10
12
14
16
V. myrtillus V. oxycoccus V. vitis-idea Control
Рис. 1. Кривые выживаемости экспериментальных животных после воздействия СС14 на фоне приёма экстрактов северных ягод (У.тугИИиБ — черника, V. ОхусоссиБ — клюква, У.уШБ^аеа — брусника)
спирта для селективного извлечения флавонолов, ан-тоцианов и проантоцианидинов. Водно-спиртовой экстракт концентрировали выпариванием в вакууме (7 g) в роторном испарителе в течение 60 мин с целью устранения спирта. Стандартизацию проводили по общему фенольному числу — 10 мг/мл.
В каждом случае был описан полифенольный состав водно-спиртовых экстрактов ягод. Анализ содержания фенольных соединений проводился методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием хроматографа Agilent 1290 Infinity. Разделение в градиентном режиме осуществлялось на колонке ZORBAXRRHDSB-C18 2.1 х 100 мм, 1.8 мкм.
Идентификация фенольных соединений проводилась в соответствии с временами удерживания и спектрами поглощения соответствующих аналитических стандартов [5-7].
Дизайн исследования. Оценивали способность экстрактов полифенолов клюквы, брусники и черники влиять на выживаемость лабораторных животных при остром токсическом гепатите. С этой целью острый токсический гепатит (жёсткий вариант) вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения 50% масляного раствора четыреххлористого углерода в дозе 400 мг/кг массы тела животного [8]. В качестве экспериментальных животных использовали 40 самцов крыс Wistar массой тела от 200,0 до 220,0 г. Крыс содержали в вентилируемых пластиковых клет-
ках (по 4 головы в клетке) в стандартных условиях вивария при температуре окружающей среды 22±1°С с 12-часовым циклом свет/темнота, контролируемой влажности и принудительной циркуляции воздуха. Животные были случайным образом разделены на четыре группы (рандомизация) по 10 животных в каждой: № 1 (контрольная группа) — в течение 5 дней до введения CCl4 и в течение 5 дней после введения CCl4 крысам внутрижелудочно с помощью зонда раз в сутки вводили физиологический раствор 0,5 мл; № 2 — в течение 5 дней до введения CCl4 и в течение 5 дней после введения CCl4 крысам внутрижелудочно с помощью зонда раз в сутки вводили экстракт клюквы 0,5 мл; № 3 — в течение 5 дней до введения CCl4 и в течение 5 дней после введения CCl4 крысам внутри-желудочно с помощью зонда раз в сутки вводили экстракт брусники 0,5 мл; № 4 — в течение 5 дней до введения CCl4 и в течение 5 дней после введения CCl4 крысам внутрижелудочно с помощью зонда раз в сутки вводили экстракт черники 0,5 мл. Экстракты ягод стандартизовали таким образом, чтобы введённое количество было эквивалентно дозе 50 мг фенольных веществ на 1 кг массы животного.
Во всех случаях период наблюдения — 14 дней с ежедневной регистрацией гибели животных. При проведении настоящего исследования учитывали должные принципы обращения с экспериментальными животными, изложенные в European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimentation and other
0
2
4
6
Scientific Purposes, N 123 of 18 March 1986 и Protocol of Amendment to the European Convention for the Protection of Vertebrate Animais used for Experimental and other Scientific Purposes, Strasbourg, 22 June 1998 [9]. На выполнение данной работы было получено разрешение локального Биоэтического комитета Медицинского института Сургутского университета.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ STATISTICA 8.0 (StatSoft. Inc.). Полученные результаты представлены в виде «среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения». Нормальность распределения показателей оценивали с использованием критерия Shapiro-Wilk's W-test. Межгрупповые отличия оценивали непараметрическим критерием Gehan'sWilcoxonTest [10].
Результаты и обсуждение. Наше исследование фокусировалось на оценке результатов кратко -временного применения экстрактов северных ягод до и после воспроизведения летальной интоксикации CCl4. Результаты исследования выживаемости животных и динамика гибели крыс в условиях настоящего эксперимента представлены на рис. 1.
Судя по кривым выживаемости животных, принимавших экстракты черники, клюквы и брусники, они очевидно отличны от кривой выживаемости контрольных животных (p = 0,00018; p = 0,00961; p = 0,00619 соответственно по критерию Гехана (Gehan's Wilcoxon Test). Как видно, в группе контроля через сутки после введения CCl4 наблюдали гибель 5 животных, через 2 суток гибель составила 8 животных, через 3 суток гибель составила 9, через 4 суток наблюдали гибель всех 10 крыс. В группе, получавшей концентрат полифенолов клюквы, через сутки после введения тетрахлорметана наблюдали гибель 1 животного, через 2 суток погибли ещё 2 крысы, через 3 суток ещё 1, к 4 суткам к числу погибших добавилась ещё одна крыса, остались живы 5 животных, которые продолжали жить на всем протяжении наблюдения за ними, период наблюдения составил 2 недели. В группе использования экстракта брусники была следующая динамика гибели животных: на 2 сутки погибло 3 крысы, на 4 сутки — ещё 3 крысы, далее без изменений на протяжении 2 недель оставались живы 4 крыс. В группе использования экстракта черники: на 4 сутки погибли 3 крысы, на 5 сутки ещё 1 крыса, остальные были живы в течение 2 недель наблюдения.
Обобщая результаты этого эксперимента, можно утверждать, что использованная модель интоксикации крыс четыреххлористым углеродом даёт 100% летальность в контрольной группе. Но, если крысам вводили экстракт клюквы, то летальность на протяжении периода наблюдения составила 50%, если вводили экстракт брусники, то летальность была 60%, а при использовании экстракта черники этот показатель был 40%. Т.е., при использовании экстрактов северных ягод летальность вследствие интоксикации CCl4 ни в одном случае не составила 100%, а колебалась между 40% и 60%. Это даёт основание говорить о протективном эффекте полифенольных экстрактов, цитопротекторном или органопротектор-ном.
Тетрахлорметан является наиболее известным гепатотоксином, применяемым для моделирования заболеваний печени [11]. Он подвергается микросо-мальному окислению при участии цитохрома Р-450 с образованием электрофильныхалкилирующихинтер-медиатов и свободных радикалов, способных индуцировать перекисное окисление липидов и модифицировать биомолекулы в результате ковалентного связывания с ними. Это сопровождается развитием тяжелого поражения печени с проявлениями синдромов цитолиза, холестаза, мезенхимального воспаления, жировой дистрофии и печеночно-клеточной недостаточности. В больших дозах, использованный в настоящем эксперименте, СС14 вызывает полиорганную недостаточность, приводящую к гибели экспериментальных животных [12-14]. Именно этот эффект мы получили в условиях нашего эксперимента в контрольной группе животных.
Известно, что в патогенезе острого токсического поражения печени вследствие воздействия CCl4 большое значение отводится окислительному стрессу [15, 16]. При оксидативном стрессе, в первую очередь, наблюдается сдвиг про-антиоксидантного равновесия в сторону усиления прооксидантной составляющей, снижение резервов мобилизации антиокси-дантной защиты, что сопряжено с нарушением энергообеспечения клетки, детоксикационных механизмов, активацией апоптоза, провоспалительных цито-кинов [17]. Окислительный стресс инициирует нарушения, связанные с кровоснабжением печени (повреждение эндотелия сосудов и синусоидов печени с изменением выработки оксида азота, ухудшение реологических свойств крови, состояния микроциркуляторного русла), что усугубляет течение патологического процесса. Высокое содержание полифенольных веществ, установленное нами для экстрактов клюквы, брусники и черники, предположительно, вносит определяющий вклад в механизм цитопротекторного действия исследованных нами субстанций, поскольку все компоненты обладают выраженной подавляющей активностью в отношении свободных радикадов и стимулируют анти-оксидантные системы организма. Антирадикальные и антиоксидантные свойства полифенолов, присутствующих в экстрактах клюквы, брусники черники, описаны однозначно и многократно [18-21].
Аналогичных работ, анализирующих выживаемость крыс при отравлении CCl4 на фоне введения экстрактов клюквы, брусники или черники, в доступной литературе нам найти не удалось. Но имеется некоторое количество доказательств возможности получения гепатопротекторного эффекта для ягод, содержащих проантоцианидины. Так, при кормлении крыс ягодами черники (0,6г/10 г) в течение 21 дня или голубики в течение 35 дней определено в печени увеличение SOD (супероксиддисмутаза) и уменьшение MDA (малоновый диальдегид), рост субпопуляций Т-лимфоцитов CD3 + и CD4 +, увеличение экспрессии Nrf2, HO-1, and Nqo1, факторов транскрипции, отвечающих за выраженность антиоксидативной реакции, что может быть основой гепатопротекции [22]. Для клюквы установлено наличие антиокси-дантного и гепатопротекторного потенциала, реали-
зуемого в защите от повреждения митохондрий крыс при остром (0,8 г/кг, однократная инъекция) или хроническом (1,6 г/кг, раз в две недели повторные инъекции в течение 30 дней) отравлении CC14. Введение в корм крысам клюквы (7 мг/кг) эффективно снижало токсические эффекты CC14, что выражалось в нормализации АЛТ и концентрации билирубина, предотвращении накопления мембранных продуктов пере-кисного окисления липидов в печени крыс, что в целом обеспечивало сохранение митохондриальной ультраструктуры [23].
Таким образом, у крыс на фоне летального острого отравления четыреххлористым углеродом, введение концентрата полифенолов в виде экстрактов северных ягод (клюквы, брусники, черники) частично обеспечивало выживание животных. Одним из возможных механизмов выявленного протекторного действия концентрата полифенолов северных ягод мы считаем антиоксидантный и цитопротекторный эффекты флавоноидов, входящих в состав исследуемых экстрактов. Полученные данные позволяют сделать вывод о целесообразности дальнейшего экспериментального исследования концентратов полифенолов северных ягод в качестве перспективного цитопро-текторного средства.
Авторы статьи выражают признательность сотрудникам National Laboratory Astana, Назарбаев Университета за консультативную и методическую помощь.
1. Seeram N.P. Berry fruits: compositional elements, biochemical activities, and the impact of their intake on human health, performance, and disease // J. Agric. Food Chem. 2008. Vol. 56. P. 627-629.
2. Madrigal-Santillan E. et al. Investigation on the protective effects of cranberry against the DNA damage induced by benzo[a]pyrene // Molecules. 2012. Vol. 17. P. 4435-4451.
3. Neto C.C. Cranberry and its phytochemicals: a review of in vitro anticancer studies // J. Nutr. 2007. Vol. 137. P. 186S-193S.
4. Manganaris G.A., Goulas V., Vicente A.R., Terry L.A. Berry antioxidants: small fruits providing large benefits // J. Sci. Food Agric. 2014. Vol. 94(5). P. 825-833.
5. Grace M.H., Esposito D., Dunlap K.L., Lila M.A. Comparative analysis of phenolic content and profile, antioxidant capacity, and anti-inflammatory bioactivity in wild Alaskan and commercial Vaccinium berries // J. Agric. Food Chem. 2014. Vol. 62(18). P. 4007-4017.
6. Latti A.K., Riihinen K. R., Jaakola L. Phenolic compounds in berries and flowers of a natural hybrid between bilberry and lingonberry (Vaccinium x intermediumRuthe) // Phytochemistry. 2011. Vol. 72. Р. 810-815.
7. Zheng W., Wang S.Y. Oxygen Radical Absorbing Capacity of Phenolics in Blueberries, Cranberries, Chokeberries, and Lingonberries // J. Agric. FoodChem. 2003. Vol. 51. Р. 502509.
8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. члена-корреспондента РАМН, профессора Р.У.Хабриева. М.: Медицина, 2005. 832 с.
9. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimentation and other Scientific Purposes, N 123 of 18 March 1986 [Электр. ресурс]. URL: http://worldanimal.net/council.html (дата обращения: 01.03.2018).
10. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л.: Наука. 1963. 151 с.
11. Венгеровский А.И., Маркова И.В. Доклиническое изуче-
ние гепатозащитных средств // Ведомости Фармакологического Комитета. 1999. № 2. С. 9-12.
12. Мышкин В.А., Ибатуллина Р.Б., Бакиров А.Б. Поражения печени химическими веществами. Уфа, 2007. 177 с.
13. Adams E.M., Spencer H.C., Rowe V.K. et al. Vapor toxicity of carbon tetrachloride determined by experiments on laboratory animals // AMA Arch. Ind. Hyg. Occup. Med. 1952. Vol. 6. P. 50-66.
14. Abraham P., Wilfred G., Gathrine S.P. Oxidative damage to the lipids and proteins of the lungs, testis and kidney of rats during carbon tetrachloride intoxication // Clin. Chem. Acta. 1999. Vol. 289. P. 177-179.
15. Меньщикова Е.Б. [и др.] Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. Новосибирск: АРТА, 2008. 284 с.
16. Буеверов А.О. Оксидативный стресс и его роль в повреждении печени // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2002. N° 4. С. 21-25.
17. Марков Х.М. Оксидантный стресс и дисфункция эндотелия // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2005. № 4. С. 5-9.
18. Nardi G.M. et al. Anti-inflammatory Activity of Berry Fruits in Mice Model of Inflammation is Based on Oxidative Stress Modulation // Pharm. Research. 2016. Vol. 8 (Suppl 1). P. 42-49.
19. Umeno A. et al. Antioxidative and Antidiabetic Effects of Natural Polyphenols and Isoflavones // Molecules. 2016. Vol. 21(6). pii: E708. doi: 10.3390/molecules21060708.
20. Hagymasi K., Egresi A., Lengyel G. Antioxidants--antioxidative stress: facts and questions // Orv. Hetil. 2015. Vol. 156(47). P. 1884-1887.
21. Ariga T. The antioxidative function, preventive action on disease and utilization of proanthocyanidins // Biofactors. 2004. Vol. 21(1-4). P. 197-201.
22. Wang Y.P. et al. Effect of blueberry on hepatic and immunological functions in mice // HepatobiliaryPancreat. Dis. Int. 2010. Vol. 9. P. 164-168.
23. Cheshchevik V.T. et al. Rat liver mitochondrial damage under acute or chronic carbon tetrachloride induced intoxication: protection by melatonin and cranberry flavonoids // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2012. Vol. 261. P. 271-279.
References
1. Seeram N.P. Berry fruits: compositional elements, biochemical activities, and the impact of their intake on human health, performance, and disease. J. Agric. Food Chem., 2008, vol. 56, pp. 627-629.
2. Madrigal-Santillan E. et al. Investigation on the protective effects of cranberry against the DNA damage induced by benzo[a]pyrene. Molecules, 2012, vol. 17, pp. 4435-4451.
3. Neto C.C. Cranberry and its phytochemicals: a review of in vitro anticancer studies. J. Nutr., 2007, vol. 137, pp. 186S-193S.
4. Manganaris G.A., Goulas V., Vicente A.R., Terry L.A. Berry antioxidants: small fruits providing large benefits. J. Sci. Food Agric., 2014, vol. 94(5), pp. 825-833.
5. Grace M.H., Esposito D., Dunlap K.L., Lila M.A. Comparative analysis of phenolic content and profile, antioxidant capacity, and anti-inflammatory bioactivity in wild Alaskan and commercial Vaccinium berries. J. Agric. Food Chem., 2014, vol. 62(18), pp. 4007-4017.
6. Latti A.K., Riihinen K. R., Jaakola L. Phenolic compounds in berries and flowers of a natural hybrid between bilberry and lingonberry (Vaccinium x intermediumRuthe). Phytochemistry, 2011, vol. 72, pp. 810-815.
7. Zheng W., Wang S.Y. Oxygen Radical Absorbing Capacity of Phenolics in Blueberries, Cranberries, Chokeberries, and Lingonberries. J. Agric. FoodChem., 2003, vol. 51, pp. 502509.
8. Khabriyev R.U., ed. Rukovodstvo po eksperimental'nomu (doklinicheskomu) izucheniyu novykh farmakologicheskikh veshchestv [Guidelines for experimental (preclinical) study of new pharmacological substances]. Moscow, 2005. 832 p.
9. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimentation and other Scientific Purposes, N 123 of 18 March 1986. Available at: http://worldanimal.net/council.html (accessed: 01.03.2018).
10. Belen'kiy M.L. Elementy kolichestvennoy otsenki farmakologicheskogo effekta [Elements of a quantitative assessment of the pharmacological effect]. Leningrad, 1963. 151 p.
11. Vengerovskiy A.I., Markova I.V. Doklinicheskoye izucheniye gepatozashchitnykh sredstv [Preclinical study of hepatoprotective agents]. Vedomosti Farmakologicheskogo Komiteta, 1999, no. 2, pp. 9-12.
12. Myshkin V.A., Ibatullina R.B., Bakirov A.B. Porazheniya pecheni khimicheskimi veshchestvami [Liver lesions caused by chemicals]. Ufa, 2007. 177 p.
13. Adams E.M., Spencer H.C., Rowe V.K. et al. Vapor toxicity of carbon tetrachloride determined by experiments on laboratory animals. AMA Arch. Ind. Hyg. Occup. Med., 1952, vol. 6, pp. 50-66.
14. Abraham P., Wilfred G., Gathrine S.P. Oxidative damage to the lipids and proteins of the lungs, testis and kidney of rats during carbon tetrachloride intoxication. Clin. Chem. Acta, 1999, vol. 289, pp. 177-179.
15. Men'shchikova E.B. [i dr.] Okislitel'nyy stress: Patologicheskiye sostoyaniya i zabolevaniya [Oxidative stress: pathological conditions and diseases]. Novosibirsk, 2008. 284 p.
16. Buyeverov A.O. Oksidativnyy stress i ego rol' v povrezhdenii pecheni [The role of oxidative in liver diseases]. Rossiyskiy zhurnal gastroenterologii, gepatologii,
koloproktologii, 2002, no. 4, pp. 21-25.
17. Markov Kh.M. Oksidantnyy stress i disfunktsiya endoteliya [Oxidative stress and dysfunction of the endothelium]. Patologicheskaya fiziologiya i eksperimental'naya terapiya, 2005, no. 4, pp. 5-9.
18. Nardi G.M. et al. Anti-inflammatory Activity of Berry Fruits in Mice Model of Inflammation is Based on Oxidative Stress Modulation. Pharm. Research., 2016, vol. 8 (Suppl 1), pp. 42-49.
19. Umeno A. et al. Antioxidative and Antidiabetic Effects of Natural Polyphenols and Isoflavones. Molecules, 2016, vol. 21(6), pii: E708. doi: 10.3390/molecules21060708.
20. Hagymâsi K., Egresi A., Lengyel G. Antioxidants--antioxidative stress: facts and questions. Orv. Hetil., 2015, vol. 156(47), pp. 1884-1887.
21. Ariga T. The antioxidative function, preventive action on disease and utilization of proanthocyanidins. Biofactors, 2004, vol. 21(1-4), pp. 197-201.
22. Wang Y.P. et al. Effect of blueberry on hepatic and immunological functions in mice. HepatobiliaryPancreat. Dis. Int., 2010, vol. 9, pp. 164-168.
23. Cheshchevik V.T. et al. Rat liver mitochondrial damage under acute or chronic carbon tetrachloride induced intoxication: protection by melatonin and cranberry flavonoids. Toxicol. Appl. Pharmacol., 2012, vol. 261, pp. 271-279.
