CC BY
247
Биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2008, № 1, с. 77-80
УДК 579. 582. 28
ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ СРЕДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ФЕНОЛОКСИДАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ МИКРОМИЦЕТОВ TRICHODERMA VIRIDE И TRICHODERMA LIGNORUM
© 2008 г. Е.С. Лазарева, В.Ф. Смирнов, И.В. Стручкова
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
annbril@bio.unn.ru
Поотупиоа в редаоцию 23.01.2008
Проведена сравнительная оценка фенолоксидазной активности микромицетов Trichoderma viride Pers. BKM F-1117 и Trichoderma lignorum (Tode) Harz. T 90 при их росте на жидких питательных средах с добавлением опилок древесины дуба, фунгицида беномила и этанола. Установлено, что фенолок-сидазная активность обоих видов изменяется сходным образом: добавление опилок или этанола повышает, а беномила понижает данный показатель.
Коючевые ооова: фенолоксидазная активность, Trichoderma lignorum (Tode) Harz. T 90.
В настоящее время активно исследуются фе-нолоксидазы микроскопических грибов. Проблема представляет интерес в связи со значительной ролью этих ферментов в биодеградации лигнина, детоксикации ксенобиотиков, межорга-низменных взаимодействиях, а также в морфогенезе микромицетов [1, 2]. Фенолоксидазами называют медьсодержащие оксидоредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции фенольных соединений [3].
Фенолоксидазы представителей рода Trichoderma изучены очень слабо, несмотря на то, что многие виды этого рода широко распространены и известны как активные биодеструкторы древесины и материалов на ее основе. Рядом авторов предполагается активное участие фенолоксидаз триходерм в биодеструкции лигнина, однако их роль в данном процессе в настоящее время окончательно не установлена.
Малоизученным остается также вопрос о регуляции продуцирования фенолоксидаз у три-ходерм при влиянии таких факторов, как компоненты питательной среды, фунгициды и др. [4, 5]. В литературе имеются данные о том, что уровень секреции этого фермента во внеклеточную среду очень сильно зависит от вида гриба и условий культивирования и может варьировать как между видами, так и в пределах одного вида [6]. Обсуждаются также возможные пути регуляции фенолоксидазной активности рядом химических веществ, способных оказывать влияние на различных уровнях продуцирования фермента [7].
Целью нашей работы было исследование фенолоксидазной активности двух видов рода
Trichoderma при добавлении в среду культивирования этанола, опилок древесины дуба и фунгицида беномила.
Материалы и методы
Объектом исследования служили штаммы микромицетов Trichoderma viride Pers. BKM F-1117 и Trichoderma lignorum (Tode) Harz. Т 90.
Культуры грибов выращивались на обедненной питательной среде (ОПС), содержащей минеральные компоненты по Чапеку-Доксу и сахарозу (1.0 г/л) в качестве источника углерода. Также использовались модифицированные питательные среды - ОПС с дубовыми опилками (1г/л), ОПС с этиловым спиртом (0.2 и 0.02%), ОПС с фунгицидом беномилом (Ы-[1-(бутил-карбамоил) бензо-имидазолил - 2]-о-метил-карбамоил). Фунгицид добавляли в среду на третьи сутки культивирования до конечной концентрации в среде (0.000025-0.00005%).
Культивирование проводилось в колбах Эр-ленмейера на качалках (200 об./мин, t°= = 27 + 2°С). На 14-е сутки культуральную жидкость (КЖ) отделяли от мицелия путем фильтрования и использовали для исследования [8]. Эксперимент проводили в трех биологических повторностях.
Активность фенолоксидазы измеряли фотометрически по окислению пирокатехина при Апах = 410 нм, рН реакционной смеси 7.2.
Результаты измерений выражали в условных единицах (у.е.). За единицу активности принимали приращение оптической плотности в 1 мл
реакционной смеси за 1 минуту, в пересчете на 1 г вносимого белка. Концентрацию белка в КЖ определяли по Лоури [9].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Количество продуцирования экстрацеллю-лярных ферментов микромицетами может регулироваться на разных уровнях, причем этот показатель может сильно изменяться под действием различных компонентов среды [1, 2, 10].
Для фенолоксидазы показано, что ее продукция повышается, предположительно за счет активации синтеза фермента на транскрипционном уровне, в присутствии фенольных компонентов [11]. Ароматическими индукторами фе-нолоксидаз являются продукты разложения лигнина [12], гваякол, вератровая кислота [13], 2,5-ксилидин, лигносульфонаты [6].
Кроме веществ, оказывающих воздействие на экспрессию генов фенолоксидаз, установлены соединения, которые могут изменять активность экстрацеллюлярной фенолоксидазы каким-либо косвенным путем, например воздействуя на транспорт фермента внутри мицелия или на его выход из гифы. К таким соединениям относится ряд неионогенных ПАВ, некоторые спирты и фунгициды [6, 14, 15].
В нашем эксперименте в качестве компонентов, потенциально обладающих способностью изменять фенолоксидазную активность, были выбраны опилки древесины дуба, фунгицид беномил и этанол. Результаты исследований представлены на рис. 1.
Дубовые опилки служили моделью промышленного лигноцеллюлозного материала. Этот компонент среды, с одной стороны, являлся для микромицета дополнительным источником углерода, с другой - содержал фенольные соединения, препятствующие повреждению древесины грибами в природных условиях.
В присутствии дубовых опилок происходило увеличение фенолоксидазной активности T. viride приблизительно в 3 раза, а у T. lignorum в 8 раз по сравнению с контролем. Подобное индуцирующее действие ароматических компонентов на фенолоксидазу грибов ранее наблюдали 8еЬее1 и др., которые показали, что активация исследуемого фермента происходит на уровне транскрипции [16]. Наблюдаемое возрастание активности фермента, вероятно, объясняется индукцией фенолоксидазы под действием фенольных компонентов древесины дуба.
С целью изучения влияния фунгицида бено-мила на фенолоксидазную активность исследуемых грибов он вводился в среду культивирования в минимальной фунгицидной (0.00005%) и в сублетальной (0.000025%) концентрациях, которые были установлены предварительно.
ЕЭТ уіг^е НТ Ііепогит
контроль опилки беномил 0.000025% беномил 0.00005% этанол 0.02% этанол 0.2%
Условия культивирования
Рис. 1. Фенолоксидазная активность Т.ут<1е и Т. %погат при разных условиях культивирования (14-е сутки роста)
Присутствие беномила в сублетальной концентрации у T. viride снижало фенолоксидазную активность примерно в 2 раза. У T. lignorum выраженную реакцию на добавление фунгицида в данном случае зафиксировать не удалось в связи с изначально низким ее уровнем в контроле. Двукратное увеличение концентрации беномила полностью подавляло активность фе-нолоксидазы обоих микромицетов. Беномил -соединение, широко используемое в цитологических исследованиях как специфический ингибитор функции микротрубочек. В связи с этим можно предположить, что беномил снижает активность экстрацеллюлярной фенолокси-дазы триходерм за счет ингибирования связанного с микротрубочками транспорта везикул с ферментом или за счет уменьшения количества апексов как мест основного выхода ферментов во внеклеточную среду.
Следует, однако, отметить, что уменьшение количества апексов (т.е. степени разветвленно-сти гиф) возможно также за счет воздействия на транспорт везикул, только с другим содержимым - с ферментами и предшественниками, необходимыми для построения новой клеточной стенки. Поэтому оба объяснения напрямую связаны с везикулярным транспортом, а процессы, упоминаемые в них, могут происходить одновременно.
Этанол первоначально был добавлен нами в среду культивирования в качестве контроля на действие спиртового раствора беномила в аликвотном соотношении, однако в ходе измерений было замечено, что микромицеты, выращенные на таких средах, обладали повышенным уровнем фенолоксидазной активности: у T. viride он был выше в 2.8 раза, а у T. lignorum - в 5 раз по сравнению с контролем, поэтому для дальнейшего изучения действия этого компонента на активность исследуемого фермента его концентрация была десятикратно увеличена. При этом уровень фенолоксидазной активности T. lingo-rum возрос еще в 1.8 раза. T. viride в этом случае также проявляла тенденцию к увеличению активности фенолоксидазы.
Механизм действия этанола на фенолокси-дазную активность микромицетов в настоящее время до конца не установлен, однако имеются сведения о его сильной активирующей способности в отношении фенолоксидазы [6, 14, 15]. В дальнейшем планируется подробное изучение данного явления. Сравнение реакции двух видов триходерм на введение дубовых опилок, бено-мила и этанола показало, что фенолоксидазная активность обоих видов изменяется сходным образом: добавление опилок или этанола повышает, а беномила понижает данный показатель, в
то же время T. viride - часто встречающийся биодеструктор промышленных лигноцеллюлоз-ных материалов - на любой из применявшихся сред проявлял более высокий уровень фенолок-сидазной активности, чем T. lignorum — известный антагонист фитопатогенных грибов, участвующий в биодеградации лигноцеллюлоз в значительно меньшей степени.
Список литературы
1. Claus H. Laccases: structure, reactions, distribution // Micron. 2004. V. 35. P. 93-96
2. Baldrian P. Purification and characterization of laccase from the white-rot fungus Daedalea quercina and decolorization of synthetic dyes by the enzyme // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. V. 63. P. 560-563.
3. Duran N., Esposito E. Potential applications of oxidative enzymes and phenoloxidase-like compounds in wastewater and soil treatment // Appl. Cat. B: Environ. 2000. V. 28. P. 83-99.
4. Holker U., Dohse G., Hofer M. Extracellular laccases in ascomycetes Trichoderma atroviride and Tricho-derma harzianum // Folia Microbiol. 2002. V. 47. P. 423-427.
5. Kiiskinen L.-L., Ratto M., Kruus K. Screening for novel laccase-producing microbes // J. Appl. Microbiol. 2004. V. 97. P. 640-646.
6. Lomascolo A., Record E., Heproel I. et al. Overproduction of laccase by a monocaryotic strain of Pycnoporus cinnabarinus using ethanol as inducer // J. Appl. Microbiol. 2003. V. 94. P. 618-624.
7. Mansur M. Differential gene expression in the laccase from I-62 // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. № 2. P.771-774.
8. Методы экспериментальной микологии / Под ред. В.И. Билай. Киев: Наукова думка, 1982. 550 с.
9. Досон P, Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. 464 с.
10. Assavanig A., Amornikittiecharoen B., Ek-paisal N. et al. Isolation, characterization and function of laccase from Trichoderma // Appl. Microbiol and Bio-technol. 1992. V. 38. № 2. P. 198-202.
11. Бабицкая В.Г. Грибы - эффективные деструкторы лигноцеллюлозных субстратов: их морфологическая и физиолого-биохимическая характеристика // Микология и фитопатология. 1993. Т. 27. № 5. С. 38-44.
12. Гукасян Г.С. Влияние лигнина на рост и ти-розиназную активность грибов, представителей рода Aspergillus // Биохимия. 1999. Т. 64. Вып. 2. С. 274- 278.
13. Леонтьевский Л.А, Позднякова Н.Н., Мясо-
едова Н.М., Головлева Л.А. Изучение физико-химических и каталитических свойств оксидазы-1 из гриба Panus tigrinus и лакказы из гриба Coriolus versicolor // Биохимия. 1996. Т. 61. № 10.
С. 1785-1792.
14. Lee I.-Y., Jung K.-H., Lee C.-H., Park Y.-H. Enhanced production of laccase in Trametes versicolor by the addition of ethanol // Biotechnol. Letters. 1999. V. 21. P. 965-968.
15. Crowe J. D., Olsson S. Induction of laccase activity in Rhizoctonia solani by antagonistic Pseudomonas fluorescence strains and range of chemical treatments // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 2088-2094.
16. Scheel T., Hofer M., Ludwig S., Holker U. Differential expression of manganese peroxidase and lac-case in white-rot fungi in the presence of manganese or aromatic compounds // Appl. Microbial. Biotechnol. 2000. V. 54. P. 686-961.
INFLUENCE OF CULTURE MEDIUM COMPONENTS ON PHENOLOXIDASE ACTIVITY OF MICROMYCETES TRICHODERMA VIRIDE AND TRICHODERMA LIGNORUM
E.S. Lasareva, V.F. Smirnov, I. V. Struchkova
A comparative evaluation of phenoloxidase activity of micromycetes Trichoderma viride Pers. BKM F-1117 and Trichoderma lignorum (Tode) Harz. T 90 has been carried out at their growth on liquid nutrient media with addition of oak sawdust, fungicide benomyl and ethanol. It has been shown that phenoloxidase activity of both micromycetes varies in a similar way: it increases with the addition of sawdust or ethanol, and decreases when benomyl is added.
