CC BY
153
УДК 579.222
ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ ЭНЗИМАТИЧЕСКОЙ СРЕДЫ НА БИОСИНТЕЗ ТРИПТОФАНА
С. М. Шульга А. Ф. Ткаченко
Е. А. Тигунова ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики»
Н. Е. Бейко НАН Украины, Киев
А. И. Хоменко
Е-mail: Shulga5@i.ua
Проведен поиск штамма-продуцента триптофана среди бактериальных культур из «Коллекции штаммов микроорганизмов и линий растений для пищевой и сельскохозяйственной биотехнологии» Института пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины. Отобран продуцент триптофана Corynebacterium glutamicum Т-3, который накапливает 4 г/дм3 триптофана в культуральной жидкости. Исследовано влияние источников углерода на синтез триптофана. Наибольшая активность синтеза триптофана выявлена при использовании мелассы. Рассмотрено участие в биосинтезе триптофана некоторых его предшественников: индола, индолпировиноградной кислоты, индолмолочной кислоти; смесей: индол + L-серин, индол + L-цистеин, индол + DL-аланин. Внесение предшественников синтеза триптофана в среду стимулирует его накопление в культуральной жидкости. Показана возможность получения триптофана экономически доступным способом при условии замены в среде дорогостоящих предшественников на более дешевое сырье — мелассу.
Ключевые слова: триптофан, Corynebacterium glutamicum Т-3, биосинтез, аминокислоты.
Одним из наиболее перспективных методов получения аминокислот является их синтез с помощью микроорганизмов. Таким способом были получены аминокислоты, синтез которых из предшественников является экономически целесообразным. Примером может быть получение аспарагиновой кислоты из фумарата, а также аминокислот, синтез которых из-за отсутствия предшественников у природных микроорганизмов не наблюдается [1-3].
Получение триптофана из предшественников представляет собой направленный и регулируемый процесс биосинтеза. Наиболее эффективным способом является синтез триптофана дрожжами из антраниловой кислоты, однако он имеет определенные недостатки. Значительная токсичность не позволяет вводить ее в среду в количестве, необходимом для экономически целесообразного синтеза триптофана, а почасовое введение усложняет процесс.
Целью работы был поиск продуцента триптофана среди бактериальных культур и определение условий увеличения продуктивности его синтеза.
Материалы и методы
Объектом исследований служили бактерии Corynebacterium glutamicum штаммов Т-1, Т-2, Т-3, из «Коллекции штаммов микроорганизмов и линий растений для пищевой и сельскохозяйственной биотехнологии» Института пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины.
Культуры хранили на мясопептонном агаре (мясопептонный бульон с 2% агара). Культивирование бактерий проводили на обогащенном мясопептонном агаре (состав: мясопептонный бульон — 100 см3, глюкоза — 0,1 г, дрожжевой экстракт — 0,25 г, агар — 2%) при 30 °С в течение суток, после чего переносили клетки из расчета 15 млн КОЕ/см3 среды в стерильные колбы объемом 100 см3 с 30 см3 жидкой среды следующего состава (г/ дм3): глюкоза — 20, (ЫН4)2804 — 20, КН2Р04 — 1, MgSO4•7H2O — 1, солодовый экстракт — 10, мел — 1. Культивирование бактерий осуществляли в шейкере-инкуба-торе ВЮ8АЫ Е8-20 (Латвия) при 240 об/мин и температуре 30 °С в течение 24 ч.
Для определения влияния различных источников углеводов и биологически активных веществ на синтез триптофана бактерии выращивали на энзиматической среде основного состава (г/дм3): пептон — 10, дрожжевой экстракт — 5, хлористый натрий — 5, сульфат аммония — 0,5. В среду вносили соответствующее количество исследуемых веществ в зависимости от поставленной задачи (г/дм3): мелассы — 2-20; сахарозы — 20; глюкозы — 20; индола — 0,15-0,5; серина — 0,3; индолпировиноградной кислоты — 0,5; индолмолочной кислоты — 0,5; смесей (в соотношении соответственно): индол + L-се-рин (1:2); индол + L-цистеин (1:2); индол + DL-аланин (1:2).
Качественные показатели мелассы определяли по ГОСТ 30561-98. Для исследований была взята меласса с такими показателями (%): сухие вещества — 81,2; сахароза — 50; доброкачественность (соотношение количества сахара к сухим веществам) — 61,6; рН — 6,8.
Количественный и качественный состав аминокислот мелассы устанавливали с помощью аминокислотного анализатора ААА 400 (Чехия).
После выращивания, по истечении 1-7 сут, клетки осаждали центрифугированием и в культуральной жидкости выявляли триптофан методом тонкослойной хроматографии на пластинках Силуфол UV-254 (Чехия).
Статистическая обработка была сделана с помощью программы Microsoft Excel. Все опыты проводились в 3 повторах.
Результаты и обсуждение
Из исследуемых штаммов C. glutamicum Т-1, Т-2, Т-3 наиболее продуктивным оказался штамм Т-3. При одинаковых условиях культивирования штаммы Т-1 и Т-2 синтезировали триптофан в концентрациях 1,2 и 2,0 г/дм3 соответственно, а штамм Т-3 — 4 г/дм3 (рис. 1).
Все дальнейшие исследования проводили со штаммом Т-3.
В работе [4] показано, что микроорганизмы, накапливающие триптофан в культуральной жидкости, могут осуществлять этот процесс при использовании его предшественников. Штамм C. glutamicum Т-3 синтезировал триптофан из индолпировиноград-ной кислоты и из других производных индола (табл. 1).
Рис. 1. Синтез триптофана С. glutamicum штаммами Т-1, Т-2, Т-3
(в качестве контроля использовали чистую среду, данные достоверны по отношению к контролю)
Таблица 1. Синтез триптофана из различных предшественников
(в качестве контроля использовали чистую среду, данные достоверны по отношению к контролю)
Выход Индол Индолпирови-ноградная кислота (ИПК) Индолмо-лочная кислота (ИМК)
г/дм3 среды 0,282 0,215 0,185
% от введенного предшественника 57,8 43,9 38,3
Относительно более высокая интенсивность синтеза триптофана наблюдалась при внесении в среду индола (0,282 г/дм3) в сравнении с его производными — ИПК и ИМК (концентрация триптофана 0,215 г/дм3 и 0,185 г/дм3, соответственно). Выход триптофана при внесении в среду индолилпиро-виноградной кислоты оказался выше по сравнению с индол ил мол очной. Возможно, в данном случае оксикислота (индолилмо-лочная) сначала подвергалась дегидратации с образованием своего кетоаналога (индо-лилпировиноградной кислоты), а последний путем восстановительного аминирования превращался в триптофан.
Внесение отдельных дополнительных аминокислот в среду в разной степени активирует синтез триптофана [5, 6].
Нами исследовано влияние серина, а также цистеина и аланина (аминокислот с близкими молекулярными структурами) на биосинтез триптофана. Аминокислоты были взяты в избытке по отношению к индолу, чтобы «сдвинуть» реакцию в сторону образования триптофана.
Таблица 2. Влияние аминокислот на синтез триптофана
(в качестве контроля использовали чистую среду, данные достоверны по отношению к контролю)
Выход Индол Индол + L-серин (1:2) Индол + L-цисте-ин (1:2) Индол + DL-аланин (1:2)
г/дм3 среды 0,285 0,320 0,311 0,284
% от введенного предшественника 57,9 64,3 61,3 57,8
Из результатов, представленных в табл. 2, следует, что серин и, в меньшей степени, цистеин увеличивали выход триптофана. Это можно объяснить тем, что необходимое количество серина (или цистеина) поступает из внутриклеточного аминокислотного пула, поэтому его избыток приводит к повышению интенсивности синтеза триптофана. Аланин практически не ускорял синтез триптофана. Полученные результаты подтверждают предположение авторов [5, 6]
о стимулирующем действии аминокислот на синтез триптофана.
Источником энергии, необходимой для жизнедеятельности микроорганизмов, могут быть различные углеродсодержащие соединения, главными из которых являются углеводы. Ранее в работах [6-8] показано, что на синтез триптофана помимо приведенных выше факторов оказывали влияние и источники углерода. Для оптимизации процесса биосинтеза триптофана необходимо было подобрать определенный источник углерода.
При культивировании продуцента на различных углеводах (рис. 2) установлено, что при оптимальных условиях выращивания накопление биомассы и синтез триптофана находятся в прямой зависимости и не зависят от используемого источника углерода.
При внесении одинакового количества углеводов (20 г/дм3) наибольшее накопление биомассы и триптофана наблюдается на среде с мелассой (для биомассы — 16 г/дм3, для триптофана — 7,7 г/дм3). Наименьшие показатели накопления биомассы и синтеза триптофана были на среде с глюкозой — 11,4 г/дм3 и 7,4 г/дм3, соответственно.
Это можно обьяснить тем, что меласса представляет собой комплексную среду, состоящую из разных природных компонентов. Состав мелассы в основном представлен сахарозой (45-50%), несахарами — органическими (безазотистыми и азотсодержащи-
о р
Меласса
Биомасса
Триптофан
Сахароза Источник углерода
Глюкоза
Рис. 2. Влияние источника углерода на синтез биомассы и триптофана
(в качестве контроля использовали чистую среду, данные достоверны по отношению к контролю)
ми) и неорганическими (зольными веществами) соединениями, ростовыми веществами и аминокислотами [8, 9], которые и являются источниками энергии для жизнедеятельности бактерий C. glutamicum.
На размножение и физиологическую активность бактерий влияет не только источник углевода, но и его количество.
Для определения минимального содержания мелассы в среде с целью интенсификации синтеза биомассы нами были проведены исследования по влиянию концентрации введенной мелассы и установлено оптимальное содержание ее в среде (рис. 3).
4 6 8 10 12 14 16 18
Концентрация мелассы, г/дм3
Рис. 3. Влияние концентрации введенной мелассы на синтез биомассы
(в качестве контроля использовали чистую среду, данные достоверны по отношению к контролю)
Динамика синтеза биомассы с использованием различных концентраций мелассы в среде показывает, что увеличение количества вносимой мелассы от 2 г/дм3 до 10 г/дм3 приводит к повышению прироста биомассы до 16 г/дм3. С увеличением концентрации
мелассы свыше 10 г/дм3 синтез биомассы снижался. Это можно объяснить тем, что повышенное содержание углеводов, солей и сухих веществ в среде ингибирует размножение бактерий. Определено, что оптимальное количество вносимой в среду мелассы — 10 г/дм3. При этом накапливалось максимальное (16 г/дм3) количество биомассы.
В наших опытах добавление в среду аминокислот и предшественников синтеза триптофана приводило к увеличению накопления его в среде (табл. 1 и 2). Качественный и количественный аминокислотный состав исследуемой мелассы приведен в табл. 3.
Таблица 3. Качественный и количественный состав аминокислот мелассы
Аминокислота Количество
% мг/г сухих веществ
Лейцин 0,75 9,0
Изолейцин 0,92 11,0
Фенилаланин 0,34 4,0
Валин 0,22 3,0
Метионин 0,34 4,0
Триптофан 0,25 3,0
у-Аминомасляная кислота 1,35 17,0
Тирозин 0,75 9,0
Пролин Следы Следы
Аланин 1,1 14,0
Треонин 0,22 3,0
Глицин 0,35 4,0
Глутаминовая кислота 1,22 15,0
Серин 1,6 20,0
Аспарагиновая кислота 0,35 4,0
Аргинин Следы Следы
Гистидин Следы Следы
Лизин Следы Следы
Цистин Следы Следы
Присутствие в мелассе таких аминокислот, как серин, цистин и аланин, дает возможность заменить введение этих предшественников в среду мелассой, что и было показано в наших исследованиях.
Исследовано влияние состава аминокислот мелассы на продуктивность синтеза триптофана. В качестве контроля была использована среда с чистой сахарозой и предшественниками синтеза триптофана индолом и серином. Полученные результаты представлены на рис. 4.
Предшественники, вносимые в среду
Рис. 4. Синтез триптофана на разных средах
(данные достоверны по отношению к контролю)
Сравнение среды, содержащей сахарозу, со средой, в которую внесена меласса в присутствии предшественников триптофана, показало, что присутствие мелассы в этих средах ингибирует синтез триптофана.
Более высокая активность синтеза триптофана наблюдалась при введении только мелассы. В меньшей мере увеличивала выход триптофана смесь (серин + индол + сахароза). Наименьшее количество триптофана накапливалось в среде со смесью (серин + индол + меласса), т. е. дополнительное введение в среду предшественников триптофана ингибирует процесс его синтеза, а меласса содержит достаточное количество индола и серина для синтеза триптофана и не требует их дополнительного внесения в среду.
Таким образом, проведенные исследования показали, что триптофан может быть получен экономически доступным способом при условии замены в среде дорогостоящих и нестойких предшественников синтеза триптофана на более дешевое сырье — мелассу.
ЛИТЕРАТУРА
1. Umbarger H. E. Amino acid biosynthesis and its regulation // Annu. Rev. Biochem. — 1978. — V. 47. — P. 533-606.
2. Lessard P., Guillouet A. S., Willis L. B., SinskeyA J. Corynebacteria, brevibacteria / The encyclopedia of bioprocess technology: fermentation, biocatalysis and bioseparation. — V. 2, New Vork, NY: John Wiley and Sons, 1999. — P. 729-740.
3. Mateus R. D., Alves S. S., Regalo Da Fonseca M. M. Kinetics of L-Tryptophan Production from Indole and L-Serine Catalyzed by Whole Cells with Tryptophanase Activity // J. of Bioscienece and Biotechnology. — 2004. — V. 97, N 5. — P. 289-293.
4. Рубань Е. Л., Верховцева М. И., Суворов Н. Н. Биосинтез триптофана из индола и его производных дрожжами и Escherichia coli // Прикл. биохим. микробиол. — 1975. — Т. 1, Вып. 1. — С. 74-78.
ВПЛИВ КОМПОНЕНТІВ ЕНЗИМАТИЧНОГО СЕРЕДОВИЩА НА БІОСИНТЕЗ ТРИПТОФАНУ
С. М. Шульга, А. Ф. Ткаченко,
О. О. Тігунова, Н. Є. Бейко,
А. І. Хоменко
ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки» НАН України, Київ
E-mail: Shulga5@i.ua
Здійснено пошук штаму-продуцента триптофану серед бактеріальних культур «Колекції штамів мікроорганізмів і ліній рослин для харчової та сільськогосподарської біотехнології» Інституту харчової біотехнології і геноміки НАН України. Відібрано продуцент триптофану Corynebacterium glutamicum Т-3, що накопичує 4 г/дм3 триптофану в культуральній рідині. Досліджено вплив джерел вуглецю на синтез триптофану. Найбільшу активність синтезу триптофану виявлено за використання меляси. Розглянуто участь у біосинтезі триптофану деяких його попередників: індолу, індолпіровино-градної кислоти, індолмолочної кислоти та сумішей: індолу з L-серином, індолу з L-цис-теїном, індолу з DL-аланіном. Внесення попередників синтезу триптофану в середовище стимулює його накопичення в культуральній рідині. Показана можливість отримання триптофану економічно доступним способом за умови зміни в середовищі високовартісних попередників на дешевшу сировину — мелясу.
Ключові слова: триптофан, Corynebacterium glutamicum Т-3, біосинтез, амінокислоти.
5. Ogiew J. On the synthesis of tryptophan by certain bacteria and on the nature of indole formation // J. Path. Bact. — 2000. — V. 23. — P. 224-226.
6. Ikeda M., Katsumata R. Hyperproduction of tryptophan by Corynebacterium glutamicum with the modified pentose phosphate pathway // PWS Publishing Co., Boston, MA. — 1999. — P.86-98.
7. Lee S. Y. Chang H. N. High cell density cultivation of Escherichia coli W using sucrose as a carbon source // Biotechnol. Let. — 1993. — V. 15, N 9. — P. 971-974.
8. Shasaltaneh M. D., Fooladi J., Moosavi-Nejad S. Z. L-tryptophan production by Escherichia coli in the presence of Iranian can molasses // J. Paramed. Sci. — 2010. — V. 1, N 2. — P. 19-24.
9. Atiyeh H, Duvnjak Z. Production of fructose and ethanol from cane molasses using Saccharomyces cerevisiae ATCC 36858 // Acta Biotechnol. — 2003. — V. 23, N 1. — P. 37-48.
INFLUENCE OF ENZYMATIC MEDIUM COMPONENTS ON TRYPTOPHAN BIOSYNTHESIS
S. M. Shulga, A. F. Tkachenko,
O. O. Tigunova, N. E. Beyko,
A. I. Khomenko
State organization «Institute of Food Biotechnology and Genomics» of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: Shulga5@i.ua
Bacterial cultures out of «Collection microorganism’s stains and plants line for food and agriculture biotechnology» of the Institute of Food Biotechnology and Genomics of NAS of Ukraine have been studied. The tryptophan producer stains Corynebacterium glutamicum T-3, which produced 4 g/dm3 of tryptophan in cultural liquid were studied. Influence of some carbon source on tryptophan biosynthesis was observed. The most activity of tryptophan biosynthesis with molasses was shown. It was considered some tryptophan precursors in biosynthesis: indole, indolepyruvic acid, indolelactic acid; the following mixtures: indole + L-serine, indole + L-cysteine, indole + DL-alanine. Application of tryptophan synthesis precursors to medium stimulates tryptophan accumulation in cultural liquid. Possibility to receive economically available tryptophan was shown provided that these expensive precursors were exchanged for cheaper source, namely molasses.
Key words: tryptophan, Corynebacterium glutamicum T-3, biosynthesis, amino acids.
