CC BY
33
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ
Влияние комплексных бактериальных препаратов на оксидантные функции полиморфно-ядерных лейкоцитов крови доноров
Е.А.Усанова1, С.В.Чаусова1, О.Ю.Филатов2, О.В.Красюк2, Б.А.Ефимов3, Ю.В.Балякин1
1Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова, кафедра общей патологии медико-биологического факультета, Москва (зав. кафедрой — проф. Ю.В.Балякин);
2Московский государственный медико-стоматологический университет, кафедра патофизиологии лечебного факультета, Москва (зав. кафедрой — проф. И.Ю.Малышев);
3Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова, кафедра микробиологии и вирусологии педиатрического факультета, Москва (зав. кафедрой — проф. Л.И.Кафарская)
В статье оценивали праймирующее действие комплексных препаратов антигенов Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae на полиморфно-ядерные лейкоциты по изменению люминол- и люцигенинзависимой хемилюминесценции крови доноров. Было показано, что бактериальные антигены обоих микроорганизмов стимулируют оксидантные функции лейкоцитов.
Ключевые слова: полиморфно-ядерные лейкоциты, хемилюминесценция, прайминг, бактериальные антигены
The influence of complex bacterial preparations on oxidant functions of polymorphonuclear leukocytes of donors' blood
E.A.Usanova1, S.V.Chausova1, O.Yu.Filatov2, O.V.Krasyuk2, B.A.Efimov3, Yu.V.Balyakin1
The Russian National Research Medical University, Department of General Pathology of Medical-Biological Faculty, Moscow (Head of the Department — Prof. Yu.V.Balyakin);
2Moscow State Medical and Dental University, Department of Pathophysiology of Medical Faculty, Moscow (Head of the Department — Prof. I.Yu.Malyshev);
3The Russian National Research Medical University, Department of Microbiology and Virusology of Pediatric Faculty, Moscow (Head of the Department — Prof. L.I.Kafarskaya)
I In this article there was estimated a priming effect of Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae at the polymorphonuclear leukocytes by measuring luminal- and lucigenin amplified chemiluminescence of donors' blood. It was shown that bacterial antigens of both microorganisms stimulated oxidant functions of leukocytes.
Key words: polymorphonuclear leukocytes, chemiluminescence, priming, bacterial antigens
ной готовности клетки, что, в свою очередь, влечет за собой усиление интенсивности ответа на последующее добавление этого же или другого стимулятора [1-3]. На сегодняшний день известно много прайми-рующих агентов: различные физические факторы, химические вещества, препараты цитокинов, мие-лопептиды, микроорганизмы и их компоненты [3-5]. В ряде работ исследовали праймирующее действие бактерий или их антигенов на фагоцитарную активность ПМЛ крови in vitro при различных инфекционных заболеваниях и у здоровых людей [6]. Однако чаще всего это было воздействие каким-то одним выделенным компонентом бактерий, являющимся патоген-ассоциированным молекулярным паттерном
71
В настоящее время прайминг, или предстимуляция, рассматривается как один из возможных вариантов регуляции оксидантных функций полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЛ). Суть данного эффекта состоит в том, что действие праймирующего стимула на клетку не приводит к ее непосредственной активации, а вызывает развитие повышенной функциональ-
Для корреспонденции:
Усанова Елена Алексеевна, ассистент кафедры общей патологии медико-биологического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. H.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-8764 E-mail: usanova.alena@bk.ru
Статья поступила 06.12.2011, принята к печати 19.09.2012
Е.А.Усанова и др. / Вестник РГМУ, 2012, №5, с. 71-75
данного микроорганизма, — липополисахаридами, пептидогликанами либо выделенными ими токсинами [7, 8]. В организме же при воспалении бактерии пускают в ход все свои факторы патогенности, инвазии, токсины, выделяют продукты жизнедеятельности. Именно поэтому в данной работе была смоделирована in vitro ситуация, схожая с той, которая создается в крови здорового человека (in vivo) при попадании микроорганизма и возникновении воспалительного процесса. Для этого в качестве праймирующего стимула использовали комплексные бактериальные препараты, состоящие из инактивированных цельных микроорганизмов, их разрушенных компонентов, обладающих антигенными свойствами, и выделенных ими продуктов жизнедеятельности. Как известно, Staphylococcus aureus — наиболее частый возбудитель пиогенных инфекций кожи; этот микроорганизм может вызывать поражения внутренних органов, осложнять течение многих воспалительных заболеваний, возбудителем которых не является, приводить к генерализации воспалительного процесса вплоть до развития сепсиса. Klebsiella pneumonia — частый возбудитель воспалительных заболеваний внутренних органов (пневмоний, бронхитов, пиелонефритов); этот микроорганизм способствует развитию гнойных осложнений при различных деструктивных процессах в брюшной полости, например при панкреатитах, холециститах.
В свете всего сказанного целью исследования было изучение праймирующего действия комплекса антигенов Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae на ПМЛ периферической крови здоровых доноров.
Материалы и методы
Для исследования использовали венозную кровь 19 практически здоровых лиц в возрасте от 22 до 40 лет, не болевших острыми воспалительными заболеваниями в течение 3 нед до срока проведения испытания. Кровь забирали с помощью венепункции утром натощак. В качестве антикоагулянта применяли гепарин (50 ЕД/мл). Во взятых образцах крови непосредственно перед проведением исследования производили подсчет лейкоцитарной формулы с определением количества и жизнеспособности ПМЛ.
Препараты бактериальных антигенов получали путем приготовления бактериальных комплексов на целлофановом диске по методу В.Н.Федосеевой и В.А. Камышевой [9]. Полученные маточные суспензии представляли собой комплексные бактериальные препараты, содержащие 109 микробных клеток на 1 мл суспензии, фрагменты бактериальных стенок, продукты жизнедеятельности бактерий, антигены, ферменты и токсины данного вида микроорганизма.
Для изучения эффекта прайминга из взятых образцов крови отбирали объемы, содержащие 106 ПМЛ, и доводили их до 1 мл раствором Хенкса (pH 7,45). Затем к полученным образцам добавляли 0,01 мл препаратов антигенов Staphylococcus aureus
или Klebsiella pneumoniae в различных разведениях (от 5 х 106 до 1000 х 106 микробных клеток на 1 мл суспензии). В контрольные пробы вместо препарата антигенов добавляли аналогичный объем физиологического раствора. Все пробы инкубировали в течение 60 мин при 37 °С в режиме постоянного перемешивания. Жизнеспособность ПМЛ за время инкубации существенно не изменялась.
После инкубации проводили измерение интенсивности хемилюминесценции (ХЛ) проб на 36-кюветном биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ 3606-01 (г. Красноярск), сигнал от которого поступал на персональный компьютер и анализировался с помощью программы BLM-Obrab (г. Красноярск). В качестве активаторов свечения использовали люминол (для регистрации интенсивности ХЛ, отражающей суммарную выработку всех активных форм кислорода) и люцигенин (для регистрации интенсивности ХЛ, отражающей выработку супероксидного анион-радикала 02? [10-13]. В кювету хемилюминометра вносили 0,7 мл пробы с ПМЛ, подвергнутыми инкубации с праймирующим агентом, и 0,15 мл активатора (2 х 10-3 М, Sigma, США). После регистрации спонтанной ХЛ добавляли стимулятор клеток — 0,15 мл сульфата бария (2 мг/мл) — и регистрировали стимулированную ХЛ.
С помощью компьютерной программы определяли следующие параметры ХЛ: интенсивность спонтанной ХЛ; интенсивность максимальной ХЛ; время достижения максимальной вспышки ХЛ; интенсивность стимулированной ХЛ, равной разнице между максимальной и спонтанной ХЛ; светосумму ХЛ за период времени достижения максимального свечения. Для оценки эффекта прайминга вычисляли два показателя: индекс прайминга (ИП), равный отношению интенсивности стимулированной ХЛ опытной пробы (праймированной комплексным препаратом антигенов) к интенсивности стимулированной ХЛ контрольной пробы, и показатель отношения светосумм ХЛ опытной и контрольной проб, который обозначали как индекс светосумм (ИС).
Обработку результатов проводили общепринятыми статистическими методами с применением пакета программ «Statistical (версия 5.0.). Для каждой группы экспериментов вычисляли среднее арифметическое (М), ошибку среднего (m). Для сравнения средних использовали параметрический t-критерий (критерий Стьюдента). На рисунках результаты представлены в виде М ± m. Для оценки связи между ИП и ИС определяли коэффициент корреляции Пирсона (r) и оценивали его достоверность.
Результаты исследования и их обсуждение
На рис. 1 показано влияние препарата антигенов Staphylococcus aureus на ИП в зависимости от используемого активатора свечения — люминола или люцигенина. В обоих случаях получена обратная зависимость величины ИП от концентрации антигенов
72
Влияние комплексных бактериальных препаратов на оксидантные функции полиморфно-ядерных лейкоцитов крови доноров
0,0 -I----------,-----------,-----------,-----------,-----------,----------,---------^
0 5 25 5 О 125 250 500 1000
Концентр ай? и препарата Staphylococcus <пчет в фобе. микроб. клЛш. * 10+
Л-ХЛ -о-Лц-ХЛ
Рис. 1. Влияние комплексного препарата Staphylococcus aureus на индекс прайминга ПМЛ, рассчитанный по интенсивности стимулированной хемилюминесценции крови доноров. * — р <0,05 относительно контроля; ** — р <0,05 относительно аналогичной точки на кривой Лц-ХЛ
Рис. 2. Влияние комплексного препарата Staphylococcus aureus на индекс светосумм ПМЛ.
* — р <0,05 относительно контроля; ** — р <0,05 относительно аналогичной точки на кривой Лц-ХЛ
Staphylococcus aureus. При наименьшей исследуемой концентрации — 5 х 104 микробных клеток/мл — был обнаружен наибольший эффект прайминга при регистрации обоих типов свечения: в случае люцигенин-зависимой ХЛ (Лц-ХЛ) ИП составил 2,8, в случае лю-минолзависимой ХЛ (Л-ХЛ) — 1,8. В диапазоне концентраций 25 х104 — 125 х104 микробных клеток/мл стимулирующее влияние препарата на ПМЛ было обнаружено при регистрации Лц-ХЛ, однако при регистрации Л-ХЛ ИП не отличался от контроля. Высокие концентрации препарата антигенов (500 х 104, 1000 х 104 микробных клеток/мл) вызывали снижение ИП более чем на 50% относительно контроля при
регистрации Л-ХЛ и более чем на 35% при измерении Лц-ХЛ. Для уточнения полученных данных были рассчитаны ИС (рис. 2), а затем определены коэффициенты корреляции между ИП и ИС для обоих типов свечения. Была найдена сильная положительная корреляция между ИП и ИС: в случае использования люминола r = 0,99, при использовании люцигенина r = 0,97; p <0,05.
Как видно из рис. 1 и 2, при концентрации препарата антигенов Staphylococcus aureus 5 х 104 микробных клеток/мл происходит предстимуляция НАДФН-оксидазной и миелопероксидазной реакций кислородозависимого метаболизма ПМЛ. Однако влияние
73
Е.А.Усанова и др. / Вестник РГМУ, 2012, №5, с. 71-75
Рис. 3. Влияние комплексного препарата Klebsiella pneumoniae на индекс прайминга ПМЛ, рассчитанный по интенсивности стимулированной хемилюминесценции крови доноров. * — р <0,05 относительно контроля; ** — р <0,05 относительно аналогичной точки на кривой Лц-ХЛ
Рис. 4. Влияние комплексного препарата Klebsiella pneumoniae на индекс светосумм ПМЛ.
* — р <0,05 относительно контроля; ** — р <0,05 относительно аналогичной точки на кривой Лц-ХЛ
данного препарата на активность НАДФН-оксидазы выражено в большей степени. Угнетение Л-ХЛ и Лц-ХЛ под действием высоких концентраций препарата Staphylococcus aureus можно объяснить тем, что за время инкубации часть лейкоцитов, присутствующих в пробе, уже активируется и расходует свой
74
функциональный потенциал к моменту добавления сульфата бария.
На рис. 3 представлено влияние препарата антигенов Klebsiella pneumonia на ИП ПМЛ крови доноров. Эффект прайминга наблюдали при использовании обоих активаторов свечения в широком диапазоне
Влияние комплексных бактериальных препаратов на оксидантные функции полиморфно-ядерных лейкоцитов крови доноров
концентраций препарата (от 5 х 104 до 500 х 104 микробных клеток/мл). Праймирующий эффект отсутствовал только при самой высокой концентрации препарата антигенов (1000 х 104 микробных клеток/мл). Были также рассчитаны ИС (рис. 4) и определены коэффициенты корреляции между ИП и ИС для обоих типов свечения. Была найдена положительная корреляция между ИП и ИС: в случае использования люминола r = 0,99, при использовании люцигенина r = 0,85; p <0,05.
На основании полученных данных можно утверждать о предстимулирующем влиянии препарата Klebsiella pneumonia на работу как миелопероксида-зы, так и НАДФН-оксидазы, причем предстимуляция миелопероксидазы более выражена. Это подтверждают данные литературы о том, что липополисахарид Klebsiella pneumonia стимулирует работу миелопероксидазы лейкоцитов [14].
Проведенные исследования показали, что использованные препараты бактериальных антигенов Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae оказывают праймирующее влияние на кислородозависимый метаболизм ПМЛ. Можно предположить, что прайминг ПМЛ запускается посредством контакта патоген-ас-социированных молекулярных паттернов (PAMP) микроорганизмов с соответствующими им рецепторами лейкоцитов (Toll-like receptors), в результате чего реализуются процессы, ведущие к увеличению функционального потенциала ПМЛ. Полученные нами данные также показывают, что препараты антигенов этих двух видов микроорганизмов по-разному влияют на ферментные системы окислительного метаболизма ПМЛ крови. Возможно, это влияние обусловлено различными механизмами прайминга клеток. По меньшей мере, можно связать разницу в характере синтеза активных форм кислорода ПМЛ с активацией разных типов рецепторов, например с активацией TLR2, распознающих пептидогликаны Staphylococcus aureus, и TLR4, связывающих липополисахарид Klebsiella pneumonia.
Выводы
1. При воздействии антигенов Staphylococcus aureus или Klebsiella pneumoniae выявлено их дозозависимое влияние на стимулированную хемилюминесценцию крови доноров.
2. Эффект прайминга ПМЛ обнаружен при воздействии комплексов антигенов обоих микроорганизмов.
3. Во время прайминга при воздействии препаратов антигенов Staphylococcus aureus или Klebsiella pneumoniae в ПМЛ подготавливаются условия для последующей более выраженной активации их ферментных систем окислительного метаболизма.
Литература
1. Маянский А.Н. НАДФН-оксидаза нейтрофилов: активация и регуляция // Цитокины и воспаление. 2007. Т.6. №3. С.3-13.
2. Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А. Клеточные механизмы прайминга и активация фагоцитов // Успехи соврем. биол. 1999. Т.119. №5. С. 462-475.
3. Тутелян А.В., Клебанов Г.И. Прайминг фагоцитов и его применение в системе оценки специфической активности иммунорегуляторных соединений // Иммунология. 2004. Т.25. №1. С.14-16.
4. Горудко И.В., Вахрушева Т.В., Мухортова А.В. и др. Праймирующее влияние галогенированных фосфолипидов на функциональные ответы нейтрофилов человека //Виол. мембраны.2010. Т.27. №4. С. 314-324.
5. Нестерова И.В., Швыдченко И.Н. Влияние миелопептидов на функционирование нейтрофильных гранулоцитов // Аллергол. и иммунол. 2005. Т.6. №1. С.70-80.
6. Грачева Т.А. Способ диагностики специфической сенсибилизации организма человека к бактериальным антигенам по показателям хемилюминесцентного свечения нейтрофилов // Иммунология. 2007. Т.28. №5. С.297-299.
7. Marsha A. Protein A activates membrane bound multicomponents enzyme complex NADPH-oxidase in human neutrophils // Immunopharm. and Immunotox. 1999. V.21. №4. P.683-694.
8. Ruchaud-Sparagano M.-H., Ruivenkamp C.A. et al. Differential effects of bacterial lipopolysaccharides upon neutrophil function // FEBS Lett. 1998. V.430. №3. P.363-369.
9. Федосеева B.H., Камышева B.A. Способ получения бактериальных аллергенов. Патент № 2183970. Per. Гос. реестр изобретений РФ 27.06.2002. Заявка № 2001102725 от 31.01.2001.
10. McPhail L., Clayton C.C. Role NADPH-oxidase of human polymorphonuclear leukocytes // J. Biol. Chem. 1984. V.72. №1. P.192-197.
11. Morel F., Doussierre J., Vignais P.V. The superoxide-generating oxidase in phagocytic cells. Physiologic, molecular and pathological aspects // Eur. J. Biochem. 1991. V.202. №3. P.523-546.
12. Грачева Т.А. Совершенствование хемилюминесцентного метода исследования функциональной активности фагоцитирующих клеток // Клин. лаб. диагностика. 2008. №2. С.54-55.
13. Зенков Н.К. Практические замечания по регистрации хемилюминесценции фагоцитирующих клеток // Бюл. СО АМН СССР. 1990. №2. С.72-77.
14. Umeh O., Berkowitz L. Klebsiella infections [Electronic resource] // Medscape Reference [Official website]. Aug 31, 2011. URL: http://emedicine.medscape. com/article/219907-overview#a0104 (accessed: 05.12.2011).
Информация об авторах:
Чаусова Светлана Витальевна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей патологии медико-биологического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-8764 E-mail: svetlana_chau@mail.ru
Филатов Олег Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры патофизиологии лечебного факультета Московского государственного медико-стоматологического университета Адрес: 105275, Москва, ул. Бориса Жигуленкова, 23/1 Телефон: (495) 365-0325 E-mail: helge@bk.ru
Красюк Ольга Владимировна, ассистент кафедры патофизиологии лечебного факультета Московского государственного медикостоматологического университета Адрес: 105275, Москва, ул. Бориса Жигуленкова, 23/1 Телефон: (495) 365-0525 E-mail: iybolit@rambler.ru
Ефимов Борис Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор
кафедры микробиологии и вирусологии педиатрического факультета
Российского национального исследовательского медицинского
университета им. Н.И.Пирогова
Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1
Телефон: (495) 434-1774
E-mail: efimov_ba@mail.ru
Балякин Юрий Викторович, доктор медицинских наук, профессор,
заведующий кафедрой общей патологии медико-биологического
факультета Российского национального исследовательского
медицинского университета им. Н.И.Пирогова
Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1
Телефон: (495) 434-3521
E-mail: dekmbf@rsmu.ru
75
