CC BY
39
УДК 615.357:577.175.53.015.4:612.123:547.963
О.И. Гимаутдинова, Л.Е. Панин, В.В. Базалук, П.А. Кузнецов
ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСА СТЕРОИД-АПОЛИПОПРОТЕИН A-I НА КОПИРОВАНИЕ ДНК
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Было изучено влияние комплексов стероид-аполипопротеин AI (стероид: тетрагидрокортизол, андростерон) на копирование ДНК, катализируемого фрагментом Кленова (полимераза Е. coli) и ДНК-полимеразами белкового экстракта ядер клеток крыс in vitro. Было показано, что на образующихся под воздействием указанных комплексов внутренних однонитевых участках ДНК происходит активация реакции копирования. Степень активации копирования составляет 22-27% при 50-кратном молярном избытке комплексов стероид-аполипопротеин AI по отношению к ДНК. При дальнейшем увеличении концентрации этих комплексов реакция копирования подавляется.
Ключевые слова: копирование ДНК, аиолипопротеин А-I, тетрагидрокортизол, андростерон
Введение
Ранее было показано, что связывание комплекса ТГК-апоА-I препятствует копированию (мечению) выступающих (однонитевых) концов ДНК с помощью фрагмента Кленова — ДНК-по-лимеразы E. coli [1], но осталось неясным проявление полимеразной активности на внутренних одноцепочечных участках. Появление однонитевых участков в нативной ДНК под воздействием комплексов стероид-апоА-I было показано с помощью флуоресцентного зондирования (стероид
— ТГК) [2], ферментативного анализа (стероиды: ТГК, АС, ДЭА, ДЭАС) [3] и метода малоуглового рентгеновского рассеяния (стероид — ТГК) [4].
В настоящей работе изучали влияние комплексов стероид-апоА-I на процесс копирования ДНК человека и крыс, катализируемый ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток печени крыс или фрагментом Кленова — ДНК-полимеразой E. coli.
Материалы и методы
Белки из ядер клеток печени крыс экстрагировали по методике [5], сохраняя ферментативную активность полимераз. Фрагмент Кленова 10 ед. акт./мкл (ДНК-полимераза I из E. coli) — фирмы «Сигма» (США). За 1 ед. акт. фрагмента Кленова (ДНК-зависимая ДНК полимераза) принимали количество фермента, катализирующее включение 10 нмоль нуклеотида в кислоторастворимую фракцию за 30 мин при 37 °С [6]. АпоА-I выделяли из крови крыс и анализировали, как описано в работе [7]. ДНК из печени взрослых крыс линии Вистар и крови (лимфоцитов) здоровых людей-добровольцев изолировали согласно [8] с некоторыми собственными модификациями. Работа с
лабораторными животными проводилась в соответствии с «Правилами проведения работ с экспериментальными животными».
ДНКаза I из поджелудочной железы быка — фирмы «Сигма» (США) с активностью фермента — 50000-100000 Domase ед./мг. 1 Domase ед. определяется как количество фермента, превращающее высокополимерную ДНК с относительной вязкостью 4,0 в олигомеры с вязкостью 1,0. Обычно 0,5 мкг свежего фермента полностью разрушает 5 мг ДНК тимуса теленка за 10 мин при комнатной температуре [6].
Трифосфаты дезоксимононуклеозидов: dGTP, dTTP, dCTP, dATP и ДНК фага X, рестрикт-ные фрагменты ДНК фага X /Hind III — фирмы «Медиген» (Новосибирск). Шестизвенные рэн-дом-праймеры и трифосфаты, содержащие радиоактивную метку, d[a-32P]ATP или d[a-32P]CTP с удельной радиоактивностью более 1000 Ки/ ммоль синтезированы в ИХБиФМ СО РАМН, Новосибирск. ДНК фага М13 штамм шрЮ любезно предоставлена С.Ф. Орешковой (НИИ биоинженерии, ГНЦ «Вектор»),
Реакцию копирования нативной изолированной ДНК проводили в следующей смеси [5]: 3 мкл 10Х буфера копирования, 1 мкг ДНК, комплекс anoAI-ТГК (или АС) в мольном соотношении с ДНК 50:1, 100:1 и 200:1. Затем в реакционную смесь добавляли 6-звенные статистические праймеры до концентрации 0,004 ОЕ260/мкл, по 1 нмоль немеченых dGTP, dTTP, dATP, а также 10 мкКи [a-32P]dCTP. Общий объем реакционной смеси составлял 30 мкл. Затем в реакционную смесь добавляли или 1 ед. акт. фрагмента Кленова, или 15 мкл раствора белкового экстракта
ядер, содержащего 1-7 мкг белка, перемешивали, инкубировали при 37 °С в течение 60 мин. После инкубации вносили 1 нмоль немеченного dCTP и инкубировали еще 30 мин. Реакцию останавливали добавлением равного объема формамида («Merck», Германия) с последующей термической обработкой (кипящая водяная баня, 5 мин).
Влияние избытка комплекса anoAI-ТГК на количество копированнных фрагментов ДНК изучали с помощью гидролиза ДНКазой I из поджелудочной железы быка [6]. Реакцию копирования проводили в следующей смеси: 5 мкл 10Х буфера копирования, 9 мкг ДНК, комплекс anoAI-ТГК (в молярных соотношениях ДИК:комплекс 1:0,2; 1:1, 1:2,1:5 и 1:10), 0,0085 ОЕ260 6-звенных рэндом-праймеров, 1 нмоль каждого из 4 dNTP (кроме dATP), 10 мкКи [a-32P]dATP. Общий объем реакционной смеси составлял 50 мкл. В реакционную смесь затем добавляли 1 е.а. фрагмента Кленова и перемешивали, инкубировали 1 час при 37 °С, затем добавляли немеченый dATP и инкубировали при 37 °С еще 30 мин. По окончании реакции копирования в смесь добавляли 25 нг ДНКазы I из поджелудочной железы быка [6], инкубировали 30-60 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 0,5 М ЭДТА с последующей термической обработкой (кипящая водяная баня, 5 мин). Фрагменты меченой ДНК разделяли электрофорезом в 10%, 15% и 20% ПААГ в денатурирующих или нативных условиях, как описано выше, затем гели экспонировали с рентеновской пленкой. Пленки сканировали и рассчитывали количество копий ДНК с помощью программы Band Scan. Фрагменты немеченой ДНК разделяли электрофорезом в 1% и 2% агарозных гелях, гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали на пленку Микрат-изопан в УФ-свете. Фотопленки сканировали на приборе «Кора» (Новосибирск) и рассчитывали количество фрагментов ДНК определенного размера с использованием программы BandScan по методу [9].
Результаты и их обсуждение
Взаимодействие ДНК с комплексом ТГК-АпоА-1 приводит к появлению однонитевых участков преимущественно в сайтах ДНК вида GCC/ CGG, как ранее было показано [2, 3, 8]. Известно, что ДНК-полимераза I E. coli (фрагмент Кленова) успешно используется для копирования (достраивания) однонитевых концевых последовательностей в ДНК разного происхождения [6]. Будут ли копироваться ДНК-полимеразой внутренние одноцепочечные участки эукариотической ДНК?
Для ответа на этот вопрос изучали зависимости количества копированнных in vitro фрагментов ДНК от концентрации комплексов стероид-апоА-I (стероид: кортизол, ТГК, АС), используя и фраг-
мент Кленова, и ДНК-полимеразы, содержащиеся в белковом экстракте ядер клеток печени крыс. Из табл. 1 видно, что при увеличении избытка комплекса стероид-апоА-I (ТГК, АС) число копий ДНК крыс возрастает на 22-27%. Но при молярном избытке комплекса стероид-апоА-I выше 100-кратного реакция копирования подавляется и при 200-кратном его избытке ингибируется полностью. Следует отметить, что комплекс кор-тизол-апоА-I не производит подобного эффекта, т.к. число Р32-копий ДНК несколько снижается при добавлении этого комплекса в реакционную среду копирования по сравнению с контролем и затем практически не меняется при увеличении концентрации комплекса кортизол-апоА-1.
Результаты копирования ДНК крыс, катализируемого полимеразами белкового экстракта ядер клеток печени крыс, аналогичны результатам копирования, катализируемого ДНК-полимеразой E. coli (фрагмент Кленова), как видно из таблицы
1. Таким образом, и в гомологичной системе происходит активация копирования ДНК в присутствии определенной концентрации комплекса (1:50 моль ДНК/моль белка в составе комплекса), достаточной для образования максимального количества [3, 7, 8] внутренних однонитевых участков. Отсюда можно сделать вывод, что их образование способствует активации реакции копирования, катализируемой как фрагментом Кленова, так и гомологичными ДНК-полимеразами.
Так как количество Р32-копий ДНК в реакции in vitro невелико (Таблица 1), для изучения этого процесса дополнительно использовали ДНКазу после копирования немеченной ДНК человека в присутствии комплекса ТГК-апоА-I. Известно, что ДНКаза I (гликопротеин) из поджелудочной железы быка, катализирует расщепление межнук-леотидных связей в одно- и в двунитевой ДНК, преимущественно между рядом расположенными остатками пуринов и пиримидинов [6]. Из рис. 1 видно, что апоА-1 как в отсутствие гормона, так и в составе комплекса ТГК-апоА-I защи-
Таблица 1
Синтез ДНК крыс в присутствии комплексов стероид-апоА-I, катализируемый фрагментом Кленова или ДНК-полимеразами БЭЯ клеток крыс
ДНК/комплекс стероид-апоА-1 Р32-копии ДНК, относительное количество
Фрагмент Кленова Полимеразы БЭЯ
ТГК-апоА-1 АС-апоА-1 ТГК-апоА-1
Без комплекса 0,34+0,02 0,27±0,01 0,30±0,02
1:50, моль/моль 0,42±0,02 0,33+0,02 0,38±0,02
1:100 0,25±0,01 0,21±0,01 -
1:200 0 0 0
Примечание: п=8, Р<0,05
Таблица 2
Зависимость количества фрагментов ДНК размером 3-0,5 т.п.п. (в условных единицах) [91 от избытка комплекса ТГК-апоА/при копировании и последующем гидролизе ДНКазой I
Дорожка геля 3 4 5 6 7 8 9 10
Количество комплекса на 1 т.п.н. - - - 0,2 1 2 5 10
ДНК-полимераза + + + + + -f
Кол-во фрагм., усл.ед. 128± 11 128±11 153,5+15 165±15* 134,5± 12 133± 12 99±10 95±10
anoAI на 1 т.п.н. 0.2
ДНКаза + + + + + + + 4-
Примечание: *н-5. Р<0,05
тает ДНК человека от гидролиза ДНКазой I, начиная с соотношения: I молекула белка (в составе комплекса) на I т.п.н. ДНК н 2 молекулы белка (без гормона) на 1 т.п.н. ДНК. Это подтверждает полученные ранее данные о достаточно прочном связывании белка апоА-1 и его комплекса со стероидным гормоном как с одно-, так и с двуцепочечной ДНК 11, 7, 8]. Если предварительно шел процесс копирования, то по количеству оставшихся негндролизованных ДНКазой фрагментов ДНК. можно судить о степени активации реакции копирования комплексом ТГК-аноА-1. Наиболее достоверные изменения в количестве немеченых фрагментов ДНК были зарегистрированы в области 3-0,5 т.п.н. Из таблицы 2 видно, что максимальное количество фрагментов ДНК (в том числе, копированных) размером от 3 до 0,5 т.п.н. присутствует и 6-ой дорожке геля, соответствующей реакционной смеси с содержанием 0.2 молекулы белка (в составе комплекса ТГК-апоА-1) на 1 т.п.н. ДНК. Далее количество копированных фрагментов ДНК падает с увеличением избытка комплекса н. наконец, гидролиз начинает преобладать. Видно, что избыток комплекса ТГК-апоА-1 не только подавляет реакцию копирования
Рис. Влияние апоА1 и его комплекса с ТГК пи гидролиз ДНК человека панкреатической ДНКазой 1. Электрофорез в 1% агарозе, окрашено бромистым этидием. Соотношения веществ в т.п.н. ДНК к моль белка.
Дорожки 4-10 в присутствии ДНКазы.
2 ДНК, контроль; 3 ДНК+ДНКаэа; I ДНК + апоА1 (1:2); 5 - ДНК + апоА1 (1:10); 6 -ДНК + ТГК-апоАI (0.2:1);
7 ДНК + ТГК-апоА 1(1:1); 8- ДНК + ТГК-апоАI (1:2);
V - ДНК + ТГК-апоА1 (1:5); 10 - ДНК + ТГК-апоАI (1:10)
ДНК человека (Таблица 2, столбцы 9 и 10), но н способствует расщеплению ДНКазой исходной ДНК. Активацию и последующее ингибирование реакции копирования избытком этого комплекса наблюдали п на ДНК крыс (Таблица 1). Следует отметить, что белок апоА-I в отсутствие гормона не влияет на вторичную структуру ДНК, что было показано ранее [2-41. Из таблицы 2 видно, что на гидролиз ДНКазой не влияет присутствие апоА-1 в той же концентрации (0,2 моль на 1 т.п.н.), что и в составе комплекса, когда наблюдали наибольшую активацию копирования (срав. столб. 3, 4 и 6). Но влияние комплекса ТГК-апоА-I на структуру ДНК, по-видимому, заключается не только в образовании одноннтевых участков в сайтах связывания с двойной цепью [3, 7|, а также в «разворачивании» более сложных структур, что облегчает гидролиз ДНКазой. Ранее на олигонуклеотид-пых дуплексах вида CC(GCC)nGG(CGG)n (п=3, 5), имитирующих сайты связывания комплекса 'ГГК-апоА-1 п способных образовывать квадруплексы [10], было показано подобное влияние этого комплекса на гидролиз панкреатической ДНКазой 1111.
Заключение
Было показано, что комплексы стероид-апоА-I активируют реакцию копирования ДНК крыс (стероид: ТГК, АС) п человека (стероид — ТГК) на внутренних однойите-ных участках, образующихся под влиянием этих комплексов, как в гомологичной (ДНК крыс/ДНК-полимераза крыс), так и в ге-терологпчной (ДНК крыс или человека/ Д Н К-полимераза E. coli) системах. Степень активации копирования составляет 22-27"<> при 50-кратном молярном избытке комплекса по отношению к ДНК. Дальнейшее увеличение концентрации комплекса приводит к подавлению реакции копирования, катализируемой как фрагментом Кленова, так и ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток печени крыс.
Сокращения: апоА-1 — аполипопротеин A-I,
ТГК-тетрагидрокортизол, АС-андростерон, ДЭА-де-гидроэпиандростерон, ДЭАС-дегидроэпиандросте-рон-сульфат, БЭЯ — белковый экстракт ядер, ПААГ
— полиакриламидный гель
THE INFLUENCE OF STEROID-APOLIPO-PROTEIN А-I COMPLEXES ON DNA COPY
O.I. Gimautdinova, L.E. Panin, V.V. Bazaluk, P.A. Kuznetsov
It was studied the influence of steroid-apoAI complexes (steroid: tetrahydrocortisol, androsteron) on DNA copy by the Klenov fragment and by polymerases of protein extract from nuclei of rat liver cells. It was shown the activation of the copy reaction on inner single-stranded DNA sites produced by these complexes. The degree of the copy activation is about 22-27% at fifty times steroid-apoAI complexes molar excess relatively to DNA. With further complex concentration increasing the copy reaction is inhibited.
Литература
1. Акимжанова М. В. Специфические сайты связывания комплекса аполипопротеин A-1-тетрагидрокор-тизол на эукариотической ДНК / М.В. Акимжанова, О.И. Гимаутдинова, П.А. Кузнецов // Бюл. СО РАМН.
- 2000. - №2. - С. 29-32.
2. Гимаутдинова О.И. Влияние аполипопротеина А-I в комплексе с тетрагидрокортизолом на вторичную структуру нативной ДНК / О.И. Гимаутдинова, Л.Е. Панин // Бюл. СО РАМН. - 1998. - №3. - С. 32-35.
3. Специфические изменения вторичной структуры ДНК эукариот под влиянием комплекса тетрагидро-кортизол-аполипопротеин А-I / О.И. Гимаутдинова,
Л.Е. Панин, П.А. Кузнецов и др. // Мол. биол. — 2002.
- Т. 36. - С. 103-105.
4. Взаимодействие эукариотической ДНК с аполи-попротеином А-I и его комплексами с глюкокортикои-дами / Л.Е. Панин, Ф.В. Тузиков, Н.А. Тузикова и др. // Биофизика. - 2000. - Т. 45. - С. 611-619.
5. Dignam J.D. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei / J.D. Dignam, R.M. Lebovitz, R.G. Roeder //Nucleic Acids Res. — 1983. — Vol. 11. — P. 1475-1489.
6. Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, J. Maniatis. — 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. — New York, 1989. — P. 583.
7. Влияние комплекса тетрагидрокортизол-апо-липопротеин А-I на вторичную структуру эукариотической ДНК и ее взаимодействие с РНК-полимеразой / Л.Е. Панин, О.И. Гимаутдинова, П.А. Кузнецов и др. //Биохимия.- 2002.- Т. 67.- Вып. 7. — С. 953-958.
8. Panin L.E. Tetrahydrocortisol-apolipoprotein А-I complex specifically interacts with eukaryotic DNA and GCC elements of genes / Panin L.E., Tuzikov F.V., Gimautdinova O.I. // J. Steroid Biochem. and Mol. Biol.
- 2003. - Vol. 87. - P. 309-318.
9. Кузнецов П.А. Влияние стероидных гормонов и их комплексов с аполипопротеином А-I на структуру ДНК : Автореф. дис.... канд. мед. наук / П.А. Кузнецов.
- Новосибирск, 2004.
10. Simonsson Т. G-quadruplex DNA structures
- variations on a theme / T. Simonsson // Biol. Chem.
- 2001. - Vol. 382. - P. 621-628.
11. Gimautdinova O.I. The role DNA GCC elements play in binding of the steroid-apoAI complex under stress conditions/ O.I. Gimautdinova, E.Ju. Velichko, L.E. Panin // Second Intern. Congress «Neuroscience for Medicine and Psychology». — Ukraina, Sudak. — 2006. — P. 78-80.
