Влияние кинетина на активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы в ферментативных препаратах различной степени очистки Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН __________________________________2007, том 50, №8____________________________

БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 577.175.1

А.К.Мирзорахимов, М.А.Бабаджанова, М.С.Нарзуллоев, Ш.А.Эсаналиева, Н.Ниматова,

А.К.Сайфудинов ВЛИЯНИЕ КИНЕТИНА НА АКТИВНОСТЬ РИБУЛОЗОБИСФОСФАТКАРБОКСИЛАЗЫ/ОКСИГЕНАЗЫ В ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ПРЕПАРАТАХ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ

(Представлено членом-корреспондентом АН Республики Таджикистан К.А.Алиевым 11.05.2007 г.)

Центральное место при исследовании регуляторных механизмов фотосинтеза принадлежит изучению ключевого фермента - рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О 4.1.1.39), потому что при ассимиляции СО2 главными «входными воротами» является реакция карбоксилирования рибулозобисфосфата.

РБФК/О является уникальным ферментом фотосинтеза, так как не встречается в других метаболических процессах.

Уникален он и потому, что является самым распространенным белком в растениях, так как содержание его достигает 50% от всех водорастворимых белков листа. Кроме того, этот фермент бифункционален. Он обладает карбоксилазной и оксигеназной функциями.

Поэтому РБФК/О служит объектом разнообразных исследований, направленных главным образом на изучение физико-химических свойств энзима, молекулярной организации и регуляции его активности.

Показано, что фитогормоны повышают интенсивность фотосинтеза, оказывают влияние на структурную организацию пластид, индуцируют синтез белка в хлоропластах и способствуют накоплению в них хлорофилла [1].

М.А.Бабаджановой с сотрудниками [2-5] установлено, что при добавлении кинетина в реакционную смесь возрастает фиксация 14СО2 в присутствии рибозо-5фосфата и АТФ экстрактами из листьев арабидопсиса и хлопчатника. Поскольку при фиксации 14СО2 в присутствии рибозо-5-фосфата и АТФ определялась суммарная активность трех ферментов - рибо-зофосфатизомеразы, фосфорибулокиназы и рибулозобисфосфаткарбоксилазы, то необходимо исследование действия кинетина in vitro на каждый из этих ферментов в отдельности.

Целью данной работы было исследование действия кинетина in vitro на карбоксилаз-ную активность РБФК/О в процессе очистки ферментных препаратов из листьев хлопчатника.

Материал и методы исследований

Объектом исследований служили листья хлопчатника Gossypium hirsutum L. сорта 108-Ф. Хлопчатник выращивали в полевых условиях с соблюдением общепринятых агротех-

нических приемов на экспериментальном участке Института физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан г.Душанбе).

Для выделения ферментных препаратов использовали листья хлопчатника в 6-8 настоящих листьев.

Получение ферментных препаратов и их очистка. Срезанные листья (110 г) растирали в равном объеме 110 мл трис-НС буфера рН-8.2, содержащем 0.01 М MgCl2, 0.01 М SH-восстановленного глютатиона и капроновый порошок, необходимый для связывания фенолов. Полученный гомогенат отжимали через три слоя капроновой ткани, затем центрифугировали при 18000 об./мин в течение 40 мин в центрифуге с охлаждением. Супернатант использовали в качестве источника ферментного препарата.

Надосадочную жидкость подвергали очистке путем фракционирования сульфатом аммония и последующей хроматографией на сефадексах G-50 и G-200.

Белки осаждали при 0-35%, 35-45%, 45-65% насыщениях сульфата аммония. Осадки собирали центрифугированием в течение 30 мин при 15000 об/мин. После центрифугирования осадок растворяли в трис-НС буфере, рН-7.8 и часть ферментного препарата пропускали через колонку с сефадексом G-25 (2.5х50 см) для освобождения от сульфата аммония. Другую часть ферментного препарата подвергали гель-хроматографии через колонку с сефадексом G-50 (2.5 х 90 см). Собранный после этой колонки фильтрат подвергали очистке с помощью гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-200 (3 х 90 см).

Количественное определение содержания белка. Содержание белка определяли по методу Лоури и других [6] с небольшой модификацией. Для освобождения от Лоури-положительных веществ небелковой природы использовали осаждение белка 3% ТХУ Калибровочная кривая построена по бычьему сывороточному альбумину.

Определение_______карбоксилазной_______активности______рибулозобисфосфаткар-

боксилазы/оксигеназы. Активность фермента РБФК/О определяли радиометрическим методом [7] по включению меченого углерода в продукты реакции. Состав реакционной смеси при определении активности РБФК/О в мк моль/мл: МgCl2 - 10, дитиотриэтол - 10, NaH14COз - 25, РБФ - 1, кинетин - 2, белок - 0.01 мг.

Результаты и обсуждение

Нами изучалась карбоксилазная активность ферментов в зависимости от степени очистки и добавления 2 мкмоль кинетина в реакционную смесь. Полученные результаты представлены в таблице.

Таблица

Влияние кинетина на карбоксилазную активность РБФК/О в препаратах различной степени

очистки, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе 6-8 настоящих листьев

Стадия очистки Удельная активность РБФКЮ (мкмоль NaH14COз /мин на 1мг белка)

Кинетин

- +

Экстракт 0.041 ± 0.005 100% 0.102 ± 0.005 263%

Осаждение белков 35-50% (NH4)2SO4 0.59 ± 0.005 100% 0.090 ± 0.005 143%

Гель-хроматография 0.82 ± 0.005 0.801 ± 0.005

на сефадексе G-200 100% 100%

Представленные в таблице данные показывают, что добавление кинетина в реакционную среду приводило к значительному возрастанию карбоксилазной активности РБФК/О в экстрактах и частично очищенных ферментных препаратах. Наибольшая активация (263%) кинетином карбоксилазной активности РБФК/О наблюдалась при добавлении кинетина к экстракту из листьев.

Осаждение белков в экстракте из листьев с помощью сульфата аммония в пределах 35-50% насыщения с последующим обессоливанием на колонках с сефадексом G-50 приводило к снижению активации кинетином карбоксилазной активности РБФК/О с 263% до 143%.

Очистка ферментного препарата из листьев хлопчатника с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-200 приводила к потере способности РБФК активироваться кинетином. При гель-хроматографии на сефадексе G-200, являющимся молекулярным ситом «наоборот», проходят вниз вначале белки с молекулярной массой более 500 кДа, белки же с меньшей молекулярной массой задерживаются (застревают), причем, чем меньше масса, тем белок застревает дольше и вверху колонки.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что активация кинетином карбоксилазной активности РБФК/О являлась опосредованной, по-видимому, через рецептор кинетина белковой природы. Наше предположение основано на том, что один из рецепторов цито-кинина с молекулярной массой 67 кДа был выделен из цитозоля и ядер клеток ячменя С.Ю.Селиванкиной и др. (1997). Затем этим исследователям (2001) удалось доказать, что ци-токинин-белковый комплекс активирует фактор элонгации транскрипции РНК-полимеразы I и РНК-полимеразы II в ядрах [8,9].

У растений Arabidopsis thaliana также открыты (Inone et al., 2001) [10] рецепторы ци-токинина, организованные по принципу биокомпонентной регуляторной системы, объединяющей в себе сенсор и регулятор ответа.

Таджикский государственный национальный университет Поступило 11.05.2007 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Борзенкова Р.А., Mокроносов А.Т. - Физиология растений, 1976, т.23. №3, с.490-496.

2. Бабаджанова M.A., Хаитова Л.Т., Насыров Ю.С. - ДАН ТаджССР, 1971, т.XIV, №8, с.62-66.

3. Бабаджанова M.A., Горенкова Л.Г. - Тез. докл. Всесоюзн. симпозиума «Генетические аспекты фотосинтеза». - Душанбе, 1972, с.41-42.

4. Бабаджанова M.A. - Тез докл. I-ой Всесоюзн. конф. «Регуляторы роста и развития растений». -M., 1981, с.17-18.

5. Бабаджанова M.A., Бакаева M.^, Нарзуллоев M.С. -Труды II-ой научной конф. Биохимического общества РТ «Проблемы биохимии». - Душанбе, 1996, с.7-8.

6. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. M.: Высшая школа, 1990, 272 с.

7. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. M.: Наука, 1980, 158 с.

8. Селиванкина С.Ю. и др. - ДАН РФ, 1997, т.356, с. 830-832.

9. Селиванкина С.Ю. и др. - Физиология растений, 2001, т.48, с.434-440.

10. Inone T., Higuchi M., Hslimato Y., et al. - Nature, 2001, v.409, p.1060-1063.

А.^Мирзорахимов, М.А.Бобочонова, M.C-Нарзуллоев, Ш.А.Эсаналиева, Н.Ниматова,

A.K.Caйфyдинов

ТАЪОТРИ KИНЕТИН БА ФAЪOЛНOKИИ РИБУЛOЗOБИCФOCФAТ KAРБOKCИЛAЗA/OKCИГЕНAЗA ДАР ПРЕПАРАТ^И ФЕРМЕНТАТИВИ,

БO ДАРА^А^И ГУНOГУН ТOЗA

Таъсиpи кинетин ба фаъолнокии каpбоксилазии пpепаpатx,ои феpментативии p^ бyлозобисфосфаткаpбоксилаза/оксигеназа, ки бо даpачаx,ои гуногун аз баpгx,ои пахта даp шаpоити чудо каpдашyда in vitro тадкик каpда шyдааст.

Натичах,ои бадастоваpдашyда даp боpаи даp хлоpопластx,о мавчуд будани pетсептоpx,ои кинетин ё кофактоpx,ои он ба фаъолнокии каpбоксилазии pибyлозобис-фосфаткаpбоксилаза/оксигеназа таъсиp кунандамаълумот медихднд.

A.K.Mirzorahimov, M.A.Babnadzhanova, M.S.Narzulloev, Sh.A.Esanalieva, N.Nimatova,

A.K.Saifudinov THE INFLUENCE OF KINETIN ON RIBULOSOBISPHOSPHATCARBOXILASE/OXIGENASE ACTIVITY OF ENZYME PREPORATES WITH DIFFERENT DEGREE OF PURIFICATION

The influence of kinetin in vitro was investigated on carboxilase activity of enzyme prepo-rates ribulose-1,5-bisfosphatecarboxylase/oxygenase with different degree of purification isolated from cotton leaves (108-F line). Obtained results are evidence of presence of some receptor of kinetin or cofactors of its effects in chloroplasts on carboxylase activity of ribulose-1,5-bisfosphatecarboxylase/-oxygenase.