CC BY
11
УДК 636.2:636.02 DOI 10.52231/2225-4269_2021_4_62
Влияние качественных показателей сперматозоидов на оплодотворяемость ооцитов в условиях in vitro
Плешков Владимир Александрович, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры селекции и генетики в животноводстве
e-mail: [email protected]
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия»
Смоловская Оксана Владимировна, кандидат биологических наук, доцент кафедры зоотехнии
e-mail: [email protected]
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия»
Зубова Татьяна Владимировна, доктор биологических наук, профессор кафедры зоотехнии
e-mail: [email protected]
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия»
Семечкова Анна Вячеславовна, младший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории «Биохимических, молекулярно-генетических исследований и селекции сельскохозяйственных животных»
e-mail: [email protected]
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия»
Касьянов Роман Олегович, лаборант научно-исследовательской лаборатории «Биохимических, молекулярно-генетических исследова-
ний и селекции сельскохозяйственных животных»
e-mail: [email protected]
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия»
Ключевые слова: замороженная сперма, активность спермиев, акросома, тест-набор, оплодотворяемость, ооцит.
Аннотация. Контроль качества и стандартизация генетического материала и препаратов, применяемых при воспроизводстве животных, являются первостепенными задачами для успешного ведения животноводства. Большое количество замороженной спермы поступает в нашу страну из-за рубежа, но она не всегда соответствует стандартам качества. На качественные показатели спермопродукции влияет множество различных факторов, к которым можно отнести кормление быков-производителей и их содержание, гигиену взятия спермы, состав разбавителей, способы замораживания и размораживания и ряд других факторов. Целью исследований было изучение влияния качественных показателей сперматозоидов от разных быков-производителей на оплодотворяемость ооцитов в условиях in vitro. Были проведены исследования качественных показателей спермы (активность сперматозоидов, количество живых и мертвых спермиев и целостность акросо-мы) от трех быков-производителей, а также влияние этих показателей на оплодотворяемость ооцитов в условиях in vitro. Ооциты для проведения эксперимента были получены от коров-доноров путем аспирации из яичников живых животных под контролем УЗИ (ovum-pick-up (OPU)) на животноводческом предприятии Кемеровской области. Качественные показатели спермы быка Матиас-4593, такие как, активность (42,0±2,10 %) и количество спермиев с поврежденной акросомой (25,2±1,8 %), положительно повлияли на оплодотворяемость ооцитов в условиях in vitro, где было получено 50 % успешных оплодотворений.
Актуальность
Способность спермы быка-производителя к оплодотворению яйцеклетки является важным показателем эффективности воспроизводства крупного рогатого скота. Достоверно доказано, что в России и за рубежом большая часть производителей поставляют в хозяйства низкокачественную в биотехнологическом отношении сперму быков производителей. Спермии либо погибают в процессе оттаивания или замораживания, либо теряют свою оплодотворяющую способность от
прочих причин [1-5].
Методы улучшения качества спермы животных предложены J. M. Morrell и H. Rodriguez-Martinez. Известно, что на качественные показатели спермы влияет состав разбавителя. J. M. Morrell и M. Wallgren считают, что имеются альтернативные варианты замены антибиотикам, входящих в разбавитель [4, 5].
Разработки в области криобиологии, репродуктивных технологий и охранной геномики могут формировать стратегии генного банка для сельскохозяйственных животных [6, 7]. Исследователями предложена оценка повреждений сперматозоидов на разных этапах криоконсерва-ции у водяных буйволов с помощью флуоресцентных зондов [8, 9].
В опытах по изучению воздействия кофеина на функциональность незамороженных спермиев быков и после консервации. Авторами отмечено, что «в интактных незамороженных спермиях быков инкубация в течение 4 ч в присутствии кофеина приводила к росту числа капаци-тированных и акросома-реактивных клеток» [10].
Была также изучена интрацитоплазматическая трансдукция кальция в сперматозоидах BOS TAURUS при капацитации и акросомной реакции [11].
Исследования в направлении по улучшению качественных показателей спермы ведутся учеными всего мира, и к настоящему времени уже достигнуто множество положительных моментов [8, 10, 12, 19, 24].
Замораживание и хранение спермы в жидком азоте - это важнейший метод увеличения репродуктивных способностей животных, однако оплодотворяющая способность замороженных спермиев до настоящего времени остается низкой [13, 14].
Для замораживания и хранения спермы в жидком азоте используются разнообразные среды, которые состоят из различных компонентов, в том числе из молока. По сообщению ряда авторов, «содержание сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением после оттаивания с использованием молочной среды составляет более 50%» [15, 16, 17].
Исследования В.В. Никулина, С.М. Боруновой, Б.С. Иолчиева и др. (2018), показали, что «для эффективной и достоверной оценки замо-рожено-оттаянной спермы быков-производителей с молочным разбавителем необходимо использовать витальный флуоресцентный анализ с применением красителя Hoechst 33342» [18].
В настоящее время большое внимание сосредоточено на изучении генетического материала и препаратов на соответствие их стандартам качества, в том числе проводятся исследование спермы. Разработка рекомендаций по определению целостности акросомы спермиев, с при-
менением тест-набора красителей Дифф-Квик, ФГБУ «ВГНКИ (Всесоюзный государственный научно контрольный институт ветеринарных препаратов)» совместно с сотрудниками ФБГУ «ВИЖ (Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства) им. Л.К. Эрнста», позволяет дать более точное прогнозирование оплодотворяющей способности спермиев. Ученые отмечают, что «методика окраски, указанная в ГОСТ 32277-2013, не отвечает современным требованиям определения целостности акросомы сперматозоида, а краситель эозин/ нигрозин советуют применять только для установления количественных показателей мертвых и живых спермиев» [18].
Е.Н. Новикова, И.С. Коба, А.В. Скориков, О.О. Аль-равашдех отмечают, что «основной причиной бесплодия животных является нарушение технологии содержания, кормления и осеменения коров». Оптимальным считается сервис-период от 60 до 110 дней, а более 140 дней наблюдают у проблемных животных. Определено, что стельность от первичных осеменений должна составлять 50-60 % [19].
Для успешного развития животноводства, как с применением метода искусственного осеменения, так и при внедрении современных биотехнологических методов воспроизводства, важно наряду с оценкой быков по качеству потомства, учитывать и качественные характеристики семени, влияющие на оплодотворяющую способность [20, 21, 22]. В этом отношении становится актуальным изучение качественных характеристик семени быков-производителей при использовании в методах оплодотворения in vitro.
Цель исследований. Изучить влияние качественных показателей сперматозоидов на оплодотворяемость ооцитов в условиях in vitro.
Задачи:
- провести исследования проб заморожено-оттаянной спермы на подвижность (активность), количественные показатели живых и мертвых спермиев, а также определить целостность акросомы спермиев в исследуемых образцах;
- определить влияние качественных показателей сперматозоидов на оплодотворяемость ооцитов in vitro.
Материалы и методы исследований
Экспериментальные исследования проводили в научно-исследовательской лаборатории «Биохимических, молекулярно-генетических исследований и селекции сельскохозяйственных животных» ФГБОУ ВО Кузбасской ГСХА.
Исследования проводили на заморожено-оттаянной сперме быков-производителей голштинской черно-пестрой породы: Алле-гро-106303101; Матиас-4593; Набег-1896.
Образцы спермы для исследования приобретали в АО «Кемерово-плем» Кемеровская область, п. Ясногорский. Сперма поступала в замороженном виде в пайетах в сосуде Дьюара при температуре -196 °С. Исследовали по 10 проб спермы от каждого быка.
На активность проверяли сперму согласно ГОСТ 32277-2013 «Средства воспроизводства. Сперма. Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов». Визуально под микроскопом в раздавленной капле спермы определяли количественное соотношение сперматозоидов, имеющих прямолинейное поступательное движение (ППД) к их общему количеству.
Для использования допускается сперма, в которой содержание сперматозоидов с ППД (прямолинейно-поступательным движением) не ниже 40 % (ГОСТ 26030-2015 «Сперма быков замороженная. Технические условия»).
При определении показателей живых и мертвых спермиев, проводили окрашивание раствором эозина и определяли по формуле:
с+
Нг=-100
с~ +с+
где С + - количество сперматозоидов с окрашенными головками,
шт.;
С- - количество сперматозоидов с неокрашенными головками, шт.
Для определения целостности акросомы сперматозоидов применяли тест-набор красителей Дифф-Квик, состоящий из фиксатора, раствор 2 - розовый, раствор 3 - синий и буфера Г (по 1 флакону каждого). Производитель НПФ «АБРИС+», Россия, Санкт-Петербург. Оценку результатов проводили по ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
Работы, связанные с получением, подготовкой и оплодотворением ооцитов in vitro проводили согласно методике «Экстракорпоральное оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота» [23].
Ооциты для проведения эксперимента были получены от коров-доноров путем аспирации из яичников живых животных под контролем УЗИ (ovum-pick-up (OPU)) на животноводческом предприятии ООО «Селяна» Кемеровской области.
В лаборатории ооциты промывали 3 раза в среде ТС-199, содержащей 5 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 10 мкг/мл гепарина, 0,2 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина. Для оценки были отобраны ооциты округлой формы, с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компактным кумулюсом. Для оплодотворения отбирали предварительно
оцененные ооциты хорошего и отличного качества [23].
Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере с помощью программы Microsoft ОШсе Excel с подтверждением достоверности по критерию t-Стьюдента в следующих значениях: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.
Результаты исследований
Анализ результатов исследования показал, что пробы спермы быка Аллегро-106303101 имели активность 33,0±2,30 % с прямолинейно-поступательным движением спермиев (3,3 балла), сперма быка Матиас-4593 с поступательным движением 42,0±2,10 % (4,2 балла), сперма быка Набег-1896 с поступательным движением 35,0±2,5 % (3,5 балла).
Показатели активности сперматозоидов быка Матиас-4593 достоверно превосходили показатели спермы от быков Аллегро-106303101 на 9 % (p<0,01) и Набег-1896 на 7 % (p<0,05) (табл. 1).
Таблица 1 — Результаты исследования спермы при определении активности
№ п/п Кличка и номер быка-производителя Средний показатель активности, % Средний показатель, балл
1 Аллегро-106303101 33,0±2,3 3,3
2 Матиас-4593 42,0±2,101**3* 4,2
3 Набег-1896 35,0±2,5 3,5
Примечание: здесь и далее разница достоверна при * р <0,05; ** р <0,01; *** р <0,001.
При определении показателей живых и мертвых спермиев были получены следующие результаты: сперма быка Аллегро-106303101 -1%, быка Матиас-4593 - 0,8%, быка Набег-1896 - 0,9% мертвых спермиев.
Таким образом, показатели, характеризующие подвижность спермиев, содержание живых и мертвых спермиев в образцах соответствовали ГОСТ 32277-2013 «Средства воспроизводства. Сперма. Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов».
Для выявления частоты морфологических повреждений структуры акросомы при оттаивании спермы и степени влияния на ее оплодотворяющую способность применяли набор красителей «Дифф-Квик». В ходе исследования определяли содержание сперматозоидов с поврежденной акросомой. Каждую пробу спермы (по 10 проб от быка) исследовали непосредственно после оттаивания, через 1 и 2 часа после
размораживания (табл. 2.). Сперматозоиды крупного рогатого скота, с поврежденной акросомой, при использовании красителя «Дифф-Квик» окрашивались в светло-розовый цвет, в норме - в коричневый [20].
Таблица 2 — Результаты исследования спермы при определении целостности акро-сомы
№ п/п Кличка и номер быка-производителя Средний показатель (норма по ГОСТ -50%)
1 Аллегро-106303101
2 Матиас-4593 25,2±1,8
3 Набег-1896 32,7±2,72*
Показатели, представленные в таблице, указывают на достоверную разницу по изучаемому показателю между образцами спермы быков. Нами установлено, что в пробах спермы быка Матиас-4593, выявлен меньший процент спермиев с поврежденными акросомами. В среднем, этот показатель отмечен на уровне 25,2±1,8 %, что может свидетельствовать о высоком качестве спермы.
Больший процент поврежденных акросом отмечен в пробах спермы быка Аллегро-106303101, который в среднем составил 36,3±2,2 %, что выше, чем в пробах спермы Матиаса-4593 на 11,1 % (p<0,01) и Набега-1896 на 3,6 %, где этот показатель отмечен на уровне 32,7±2,7 %. Разница между пробами спермы быков Набег-1896 и Матиас-4593 достоверно разнилась и составила 7,5 % (p<0,05). При определении целостности акросом сперма быка Матиас-4593 отличается лучшими характеристиками.
Таким образом, исходя из результатов исследований, по 3-м показателям (подвижность, показатель живых и мертвых спермиев, а также целостность акросомы) сперма быков-производителей Алле-гро-106303101, Матиас-4593, Набег-1896 соответствовала норме, но имелись определенные различия по изучаемым показателям, что возможно было связано с условиями получения и использования замороженной спермы.
Результаты оплодотворения in vitro, представленные в таблице 3, показали различную оплодотворяющую способность спермы изучаемых быков. Полученные в опыте результаты свидетельствуют, что наиболее высокие показатели оплодотворения ооцитов in vitro, с использованием спермы быка Матиас-4593, где получено 5 удачных оплодотворений из 10 (50 %). Более высокие показатели полученного процента оплодотворения in vitro спермой быка Матиас-4593 мы связываем лучшим показателем активности спермиев (42,0±2,10 %) и меньшим содержанием спермиев с поврежденной акросомой (25,2±1,8 %).
Таблица 3 - Результаты оплодотворения ооцитов in vitro
Показатели оплодотворения in vitro
Коли- Нормаль- Отсутствие Полис Всего
чество ное оплодо- оплодо- пермия
творение творения (больше,
(партено чем 3
генез или 1 прону
пронуклеус) клеуса)
Аллегро-106303101 n 4 5 1 10
% 40 50 10 100
Матиас-4593 n 5 3 2 10
% 50 30 20 100
Набег-1896 n 4 4 2 10
% 40 40 20 100
Заключение
Как показывают результаты российских и зарубежных исследователей, качество спермопродукции зависит от целого ряда факторов. При несоблюдении условий получения, замораживания, хранения и оттаивания спермы качественные характеристики заметно снижаются, что оказывает негативное влияние на оплодотворяющую способность сперматозоидов [3, 10, 12, 16, 24].
В ходе наших исследований было установлено, что пробы спермы быков производителей имели активность от 33,0±2,3% (3,3 балла) до 42,0±2,10 % (4,2 балла), показатели живых и мертвых спермиев при окрашивании эозином от 0,8 до 1 %, что соответствует ГОСТ № 32277-2013. Целостность акросомы спермиев в 3-х исследованиях соответствовала норме и в среднем отмечена на уровне от 25,2±1,8 до 36,3±2,2 %. Более лучшие результаты при оплодотворении ооцитов in vitro (50 % оплодотворений) получены при использовании спермы быка Матиас-4593, возможно на это повлияли качественные показатели спермы, такие как активность (42,0±2,10 %) и количество спермиев с поврежденной акросомой (25,2±1,8 %).
Литература:
1. Alm-Kristiansen, A.H. In vitro studies of Norwegian Red bovine semen immobilized and cryopreserved in alginate solid gel network // Reproduction of domestic animals. - 2018. - V. 53. - № 2. - P. 365-370.
2. Iqbal, S. L-Cysteine improves antioxidant enzyme activity, post-thawing quality, and sperm fertility of Nili-Ravi bull (Bubalus bubalis) / S. Iqbal, A Riaz, SMH Andrabi, K. Shahzad // Andrologia, 2016-Wiley Online Library.
Кличка и номер быка-произво дителя
3. Luno, V., Gil, L., Olaciregui, M., Gonzalez, N., Jerez, RA, and de Bias, I. Rosmarinic acid improves the function and in vitro fertilization ability of boar sperm after cryopreservation. Cryobiology 69 (2014), 157 -162.
4. Morrell, J. M., Rodriguez-Martinez, H. Biomimetic Techniques for Improving Sperm Quality in Animal Breeding: A Review. The Open Andrology Journal, 2009, 1: 1-9 DOI: 10.2174/1876827X00901010001.
5. Morrell, J.M. and Wallgren, M. Alternatives to antibiotics in sperm diluents: a review. Pathogenic 3 (2014), 934 -46.
6. Mostek, A., Dietrich, M.A., Slowinska, M., Ciereszko, A. Cryopreservation of bull semen is associated with carbonylation of sperm proteins // Theriogenology. - 2017.- V. 92.- P. 95-102.
7. Naresh, S. Effect of cooling (4°C) and cryopreservation on cyto-skeleton actin and protein tyrosine phosphorylation in buffalo spermatozoa// Cryobiology. - 2016. - V. 72. - № 1. - P. 7-13.
8. Kumar, D., Kumar P., Singh P., et al. Assessment of sperm damage at different stages of cryopreservation in water buffaloes using fluorescent probes. Cytotechnology 68 (2016), 451-458.
9. Kumar, D., Kumar P., Singh P., Yadav S. P., Sarkar S. K., Bharad-waj A., Yadav P. S. (2014) Characteristics of frozen thawed sperm in predicting the fertility of buffalo bulls. Indian J Anim Sci 84: 389-392.
10. Чистякова, И.В. Изменение функционального статуса натив-ных и деконсервированных сперматозоидов быков под действием кофеина / И.В. Чистякова, Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко // Российская сельскохозяйственная наука. - 2019. - №4. - С. 52-54.
11. Денисенко, В.Ю. Интрацитоплазматическая трансдукция кальция в сперматозоидах BOS TAURUS при капацитации и акросомной реакции / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Онтогенез. - 2020. - Т. 51. - № 5. - С. 369-378.
12. Багиров, В.А. Оценка репродуктивного потенциала производителей с помощью лабораторных исследований спермы // В.А. Багиров, Б.С. Иолчиев, А.В. Таджиева, П.М. Кленовицкий // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2015. - №1-2. - С. 51-54.
13. Денисенко, В.Ю. Индукция капацитации бычьих сперматозоидов до криоконсервации повышает их жизнеспособность после размораживания / Ю.В. Денисенко, Т.И. Кузьмина, Е.Н. Бойцева // Гены и Клетки. - 2018. - Т. 13.- № 2. - С. 72-76.
14. Плешаков, В.А. Коррелятивные связи некоторых качественных показателей спермы быков-производителей разного срока хранения в жидком азоте / В.А. Плешаков // Вестник Алтайского государ-
ственного аграрного университета. - 2004. - № 3 (15). - С. 316-319.
15. Murphy, E.M. Effect of increasing equilibration time of diluted bull semen up to 72 h prior to freezing on spermquality parameters and calving rate following artificial insemination // Theriogenology. - 2018. - V. 108. - P. 217-222. '
16. Nongbua, T. Adding bovine seminal plasma prior to freezing improves post-thaw bull sperm kinematics but decreases mitochondrial activity // Systems biology in reproductive medicine. - 2018. - V. 64. - № 3. - P. 183-190.
17. Paudel, B., Gervasi, M.G., Porambo, J., Caraballo, D. Sperm ca-pacitation is associated with phosphorylation of the testis-specific radial spoke protein Rsph6a // Biology of Reproduction. - 2018. - V.100. - №2.
- P.440-454.
18. Никулин, В.В. Использование витального окрашивания для оценки качества спермы в молочной среде / В.В. Никулин, С.М. Бору-нова, Б.С. Иолчиев и др. // Российская сельскохозяйственная наука. -2018. - №3. - С. 33-35.
19. Бесплодие крупного рогатого скота / Е.Н. Новикова, И.С. Коба, А.В. Скориков, О.О. Альравашдех // Сборник научных трудов Краснодарского научного центра по зоотехнии и ветеринарии. - 2019.
- Т. 8. - №2. - С. 278-283.
20. Эффективный метод определения целостности акросомы сперматозоида у быков-производителей / С.М. Борунова, Б.С. Иолчиев, П.Н. Абрамов и др. // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. - 2017.
- №4. - С. 29-34.
21. Ескин, Г.В. Влияние способа разбавления спермы на ее качество и оплодотворяющую способность после замораживания-оттаивания / Г.В. Ескин // Ветеринарная патология. - 2008. - № 2 (25). - С. 147-148.
22. Чугунов, А.В. Задачи искусственного осеменения в молочном скотоводстве / А.В. Чугунов, А.В. Попова, Т.А. Протопопова // Академический вестник Якутской государственной сельскохозяйственной академии. - 2020. - №7(12). - С. 18-22.
23. Экстракорпоральное оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота: методические рекомендации / Л.В. Голубец и др.: ГГАУ, 2010 - 48 с.
24. Ткачев, А.В. Сравнение цитотоксического действия зеарале-нона и токсина т-2 на половые клетки лошадей и быков in vitro до и после криоконсервирования / А.В. Ткачев, О.Л. Ткачева // Цитология.
- 2017. - Т. 59. - №1. - С. 45-52.
References:
1. Alm-Kristiansen A. H. In vitro studies of Norwegian Red bovine semen immobilized and cryopreserved in alginate solid gel network. Reproduction of Domestic Animals, 2018, V. 53, No. 2, pp. 365-370.
2. Iqbal S. L., Riaz A., Andrabi S.M.H, Shahzad K., et al. L-Cysteine improves antioxidant enzyme activity, post-thawing quality, and sperm fertility of Nili-Ravi bull (Bubalus bubalis). Andrologia, 2016, V. 48, No. 9, pp. 943-949.
3. Luno V., Gil L., Olaciregui M., Gonzalez N., Jerez R.A., de Blas I. Rosmarinic acid improves the function and in vitro fertilization ability of boar sperm after cryopreservation. Cryobiology, 2014, No. 69, pp. 157162.
4. Morrell J. M., Rodriguez-Martinez H. Biomimetic techniques for improving sperm quality in animal breeding: a review. The Open Andrology Journal, 2009, No. 1, pp. 1-9.
5. Morrell J.M., Wallgren M. Alternatives to antibiotics in sperm diluents: a review. Pathogenic, 2014, No. 3, pp. 934-946.
6. Mostek A., Dietrich M. A., Slowinska M., Ciereszko A. Cryopreservation of bull semen is associated with carbonylation of sperm proteins. Theriogenology, 2017, V. 92, pp. 95-102.
7. Naresh S. Effect of cooling (4°C) and cryopreservation on cytoskeleton actin and protein tyrosine phosphorylation in buffalo spermatozoa. Cryobiology, 2016, V. 72, No. 1, pp. 7-13.
8. Kumar D., Kumar P., Singh P., et al. Assessment of sperm damage at different stages of cryopreservation in water buffaloes using fluorescent probes. Cytotechnology, 2016, No. 68, pp. 451-458.
9. Kumar D., Kumar P., Singh P., Yadav S. P., Sarkar S. K., Bharadwaj A., Yadav P. S. Characteristics of frozen thawed sperm in predicting the fertility of buffalo bulls. Indian J Anim Sci, 2014, No. 84, pp. 389-392.
10. Chistyakova I. V., Kuz'mina T. I., Denisenko V.Yu. Changes in functional status of native and frozen-thawed spermatozoa of bulls under the influence of caffeine. Rossiyskaya sel'skokhozyaystvennaya nauka [Russian Agricultural Science], 2019, No. 4, pp. 52-54. (In Russian)
11. Denisenko V. Yu., Kuz'mina T. I. Intracytoplasmic calcium transduction in BOS TAURUS spermatozoa during capacitation and acrosome reaction. Ontogenez [Ontogenesis], 2020, Vol. 51, No. 5, pp. 369-378. (In Russian)
12. Bagirov V. A., Iolchiev B. S., Tadzhieva A. V., Klenovitskiy P. M. Assessment of producers' reproductive potential by laboratory research of sperm. Doklady Rossiyskoy akademii sel'skokhozyaystvennykh nauk
[Proceedings of the Russian Academy of Agricultural Sciences], 2015, No. 1-2, pp. 51-54. (In Russian)
13. Denisenko V. Yu., Kuz"mina T. I., Boytseva E. N. Bovine sperm capacitation induction before cryopreservation increases their viability after thawing. Geny i kletki [Genes and Cells], 2018, Vol. 13, No. 2, pp. 72-76. (In Russian)
14. Pleshakov V.A. Correlation of some qualitative parameters of servicing bulls" sperm with different shelf life in liquid nitrogen. Vestnik Altayskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta [Bulletin of the Altai State Agrarian University], 2004, No. 3 (15), pp. 316-319. (In Russian)
15. Murphy E. M. Effect of increasing equilibration time of diluted bull semen up to 72 h prior to freezing on sperm quality parameters and calving rate following artificial insemination. Theriogenology, 2018, V. 108, pp. 217-222.
16. Nongbua T. Adding bovine seminal plasma prior to freezing improves post-thaw bull sperm kinematics but decreases mitochondrial activity. Systems Biology in Reproductive Medicine, 2018, V. 64, No. 3, pp. 183-190.
17. Paudel B., Gervasi M. G., Porambo J., Caraballo D. Sperm capacitation is associated with phosphorylation of the testis-specific radial spoke protein Rsph6a. Biology of Reproduction, 2018, V.100, No. 2, pp. 440-454.
18. Nikulin V. V., Borunova S. M., Iolchiev B.S., et al. The use of vital staining to assess the sperm quality in a milk environment. Rossiyskaya sel'skokhozyaystvennaya nauka [Russian Agricultural Science], 2018, No. 3, pp. 33-35. (In Russian)
19. Novikova E. N., Koba I. S., Skorikov A.V., Afravashdekh O. O. Infertility of cattle. Sbornik nauchnykh trudov Krasnodarskogo nauchnogo tsentra po zootekhnii i veterinarii [Proceedings of the Krasnodar Scientific Center for Animal Science and Veterinary Medicine], 2019, Vol. 8, No. 2, pp. 278-283. (In Russian)
20. Borunova S. M., Iolchiev B. S., Abramov P. N., et al. The effective method for determining the integrity of the sperm acrosome in servicing bulls. Veterinariya, zootekhniya i biotekhnologiya [Veterinary Medicine, Animal Science and Biotechnology], 2017, No. 4, pp. 29-34. (In Russian)
21. Yeskin G. V. Influence of sperm dilution method on sperm quality and fertility after freezing-thawing. Veterinarnaya patologiya [Veterinary Pathology], 2008, No. 2 (25), pp. 147-148. (In Russian)
22. Chugunov A. V., Popova A.V., Protopopova T. A. The tasks of artificial insemination in dairy cattle breeding. Akademicheskiy vestnik Yakutskoy gosudarstvennoy sel'skokhozyaystvennoy akademii [Academic
Bulletin of the Yakutsk State Agricultural Academy], 2020, No. 7 (12), pp. 18-22. (In Russian)
23. Golubets L. V. and others. Ekstrakorporal'noe oplodotvorenie ootsitov krupnogo rogatogo skota: metodicheskie rekomendatsii [In Vitro Fertilization of Cattle Oocytes: Guidelines]. Grodno: GSAU, 2010. 48 p. (In Russian)
24. Tkachev A. V., Tkacheva O. L. Comparison of cytotoxic effect of zearalenone and t-2 toxin on germ cells of horses and bulls in vitro before and after cryopreservation. Tsitologiya [Cytology], 2017, Vol. 59, No. , pp. 45-52. (In Russian)
Influence of Spermatozoa Quality on Rate of Oocyte Fertilization under the in Vitro Conditions
Pleshkov Vladimir Aleksandrovich, Candidate of Science (Agriculture), Associate Professor, the Chair of Selection and Genetics in Livestock Breeding
e-mail: [email protected]
The Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education the Kuzbass State Agricultural Academy
Smolovskaya Oksana Vladimirovna, Candidate of Science (Biology), Associate Professor, the Chair of Animal Science e-mail: [email protected]
The Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education the Kuzbass State Agricultural Academy
Zubova Tat'yana Vladimirovna, Doctor of Science (Biology), Professor, the Chair of Animal Science e-mail: [email protected]
The Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education the Kuzbass State Agricultural Academy
Semechkova Anna Vyacheslavovna, Junior Researcher, research laboratory «Biochemical and Molecular Genetic Research and Breeding of Farm Animals»
e-mail: [email protected]
The Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education the Kuzbass State Agricultural Academy
Kas'yanov Roman Olegovich, a laboratory assistant, research laboratory «Biochemical and Molecular Genetic Research and Breeding of Farm Animals»
e-mail: [email protected]
The Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education the Kuzbass State Agricultural Academy
Keywords: frozen semen, sperm activity, acrosome, test kit, fertility rate, oocyte.
Abstract. Quality control and standardization of genetic material and preparations used in animal reproduction are high-priority tasks for suc-
cessful livestock management. A large amount of frozen semen is imported, but the material does not always meet needed quality standards. The quality indicators of semen production are influenced by many different factors, which include bull's feeding and keeping, hygiene of semen collection, composition of diluents, methods of freezing and defrosting, and a number of other factors. The aim of the research was to study the influence of the quality parameters of spermatozoa obtained from different breeding bulls on oocyte fertilization in vitro. The sperm qualitative indicators (sperm activity, number of live and dead sperm cells, acrosome integrity) as well as the effect of these indicators on the oocyte fertilization under the in vitro conditions were studied on the material obtained from three servicing bulls. Oocytes for the experiment were obtained from donor cows by US-guided (ovum-pick-up (OPU)) aspiration from the ovaries of live animals at a livestock enterprise in the Kemerovo Region. Such sperm qualitative indicators of the bull Matias-4593 as the sperm activity (42.0±2.10%) and the number of sperm cells with damaged acrosome (25.2 ± 1.8%) positively influenced the fertilization rate of oocytes under the in vitro conditions, where 50% of fertilization cases were successful.
