CC BY
102
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (118) 2013
УДК 616.516.5:616.831.311-005.4-07 Д. В. МЫЦИК
B. А. АКУЛИНИН
C. С. СТЕПАНОВ П. М. ЛАРИОНОВ
Омская государственная медицинская академия
Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии
ВЛИЯНИЕ ИШЕМИИ НА НЕЙРОГЛИАЛЬНЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЛОБНОЙ КОРЫ БОЛЬШОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА
В слоях III и V лобной коры (поле 10) большого мозга человека |п=15) на им-муногистохимических препаратах изучено содержание и распределение маркера нейроспецифической енолазы |№Е) и глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP). Установлено, что при ишемии содержание №Е- и GFAP-позитивного материала в лобной коре увеличивалось на фоне статистически значимого дефицита общей численной плотности нейронов. Таким образом, деструкция нейронов лобной коры человека при ишемии сопровождается активацией метаболизма части ее сохранившихся нейронов и увеличением содержания GFAP-позитивных глиальных клеток. Данный факт рассматривается как компенсаторно-восстановительная реакция ткани мозга на повреждение, направленная на более полное использование потенциальных возможностей сохранившейся нейронной сети.
Ключевые слова: человек, ишемия, неокортекс.
Исследование нейроглиальных взаимоотношений в различных отделах и слоях неокортекса человека при ишемии остается актуальной задачей современной нейроморфологии [1 — 3]. Это связано с необходимостью получения новых данных о закономерностях реализации деструктивных и компенсаторно-восстановительных процессов при ишемическом повреждении головного мозга — наиболее распространенной причины необратимых изменений у пациентов после тяжелой черепно-мозговой травмы и инсульта [1].
Надежная верификация функционирующих нейронов и глиальных клеток стала возможной с появлением иммуногистохимических методов исследования. Наиболее стабильные результаты функционирующих нейронов выявляются при использовании специфических моно- и поликлональных антител к нейронспецифической енолазе (№Е) [4, 5], а глиальных клеток — к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) [6].
^Е-гликолитический фермент (2-фосфо^-гли-церат гидролаза), относящийся к семейству енолаз, участвует в предпоследнем этапе гликолиза — катализирует переход 2-фосфо-О-глицериновой кислоты в фосфоенолпируват. Иммуноцитохимическая реакция на №Е служит хорошим индикатором активных нейронов в различных областях головного мозга, поскольку усиление метаболической активности клеток сопровождается увеличением количества этого белка в них [4]. При иммуногистохими-ческом выявлении №Е в головном мозге положительную реакцию обнаруживают в перикарионах нейронов, аксонах и дендритах [5].
GFAP, регистрируемый в клетках глиального происхождения, является членом семейства белков цитоскелета и представляет собой основной 8 — 9 нм
промежуточный филамент зрелых астроцитов центральной нервной системы (ЦНС). Это высокоспецифичный белок мозга, который не обнаружен за пределами ЦНС [6].
Мы полагаем, что подобные иммуногистохими-ческие свойства №Е и GFAP при их сочетанном использовании позволят получить новые данные о нейроглиальных взаимоотношениях неокортекса при ишемии. Однако сравнительная иммуногисто-химическая и морфометрическая оценка состояния нейронов и глиальных клеток в лобной коре большого мозга (ЛКБМ) человека при различных видах ишемии с помощью сочетанного использования данных маркеров не проводилась.
Цель исследования — иммуногистохимическое и морфометрическое изучение популяции нейронов и астроцитов III и V слоев лобной коры большого мозга человека в норме, при острой и хронической ишемии.
Материал и методы исследования. Работа выполнена на базе Омской государственной медицинской академии, Омского областного онкологического диспансера и лаборатории молекулярно-генетических и морфологических методов исследований Новосибирского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии. Интраоперацион-ный материал получали в отделении нейрохирургии Омской областной клинической больницы, аутоп-сийный материал — в Омском областном бюро судебно-медицинской экспертизы. Данное исследование одобрено этическим комитетом Омской государственной медицинской академии.
Для исследования были выбраны пациенты с острой (п = 5) и хронической (п = 5) ишемией головного мозга в возрасте от 23 до 62 лет. Причиной острой ишемии стала черепно-мозговая травма, а
Рис. 1. NSE-позитивные нейроны и GFAP-позитивные глиальные клетки слоя ШЬ лобной коры большого мозга: а — NSE (контроль), б — GFAP (контроль), в — NSE (хроническая ишемия), г — GFAP (хроническая ишемия). Иммунофлуоресценция. Шкала 50 мкм, объектив х 40
Рис. 2. Нейроны слоя ШЬ лобной коры большого мозга в норме и при ишемии: а (об. х 40) — 20 нормохромных нейронов (520 клеток на 1 мкм2 плоскости фронтального среза) с четкой верификацией ядра, норма; б (об. х 20) — 6 нормохромных и 9 реактивно измененных (гиперхромные сморщенные) нейронов (280 клеток на 1 мкм2 плоскости фронтального среза), хроническая ишемия. Окраска по Нисслю
хронической — различные опухоли головного мозга. После лечения все пациенты были выписаны из стационара в удовлетворительном состоянии. Контролем служил мозг погибших в результате несчастных случаев (n = 5). Аутопсийный материал забирали из левого полушария спустя 5—10 часов после смерти. Во всех случаях исследовалось поле 10 коры большого мозга (по Бродману).
Интраоперационный и аутопсийный материал фиксировали в 4 %-м растворе параформа на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2 — 7,4) при температуре + 4 °С (в течение 1 сут) и заключали в парафин. Изготавливали серийные фронтальные срезы ЛКБМ толщиной 4 мкм через все слои коры большого мозга и помещали их на предметные стекла.
Для иммунофлуоресцентного исследования нейронов использовали антитела к NSE в разведении 1:300. Для верификации астроцитов применяли антитела к глиальному фибриллярному кислому белку в разведении 1:200. Визуализацию иммунной реакции осуществляли с помощью козлиных поликлональных вторичных антител в разведении 1:200, ассоциированных с флюоресцентным красителем TexasRed® Sulfonyl Chloride. Для общего контроля часть из серийных срезов окрашивали по методу Ниссля.
На микроскопе Axioskop 40, оснащенном ртутной лампой HBO 100 и камерой на CCD-датчике (Axio Cam MR с объективом EC Plan-Neofluar x 40, апертура 0,9), изготавливали цифровые микрофото-
графии размером изображения 1300 х 1030 пикселов, реальным размером 220 х 174 мкм (38 280 мкм2). Морфометрический анализ изображений проводили с помощью программы 1тадеЛ 1,46. На иммуно-гистохимических препаратах определяли площадь (мкм2) флуоресцирующих гранул маркера в поле зрения (38 280 мкм2) препарата и общую численную плотность астроцитов, а на препаратах, окрашенных по Нисслю, — общую численную плотность нейронов и относительное содержание реактивно измененных клеток.
Проверку статистических гипотез осуществляли при помощи программы Statistica 8.0 с использованием непараметрического и-критерия Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова (для парного сравнения) и ANOVA Краскела-Уоллиса (для множественного сравнения). В каждом сравниваемом случае количество измерений и полей зрения клеток определялось требованиями выявления статистической значимости при р<0,05. Материал представлен как медиана (нижний и верхний квартили) — Ме (LQ; HQ).
Результаты и их обсуждение. В норме флуоресцентная метка на №Е в основном равномерно заполняла перикарион нейронов ЛКБМ, реже встречаясь в аксонах и дендритах, а метка на GFAP маркировала тела и отростки множества разнообразных астроцитов (рис. 1, а и б).
При острой и хронической ишемии мозга №Е в цитоплазме нейронов всех слоев ЛКБМ распределялась неравномерно: в одних клетках белок со-
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (118) 2013 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (118) 2013
Численная плотность (на 1 мм2) пирамидных нейронов и глиальных клеток лобной коры большого мозга человека в норме и при ишемии, окраска по Нисслю и на GFAP, [Ме (LQ; HQ)]
Слой Группа ANOVA К-У (^ = 2)
контроль острая ишемия хроническая ишемия
Слой ШЬ
Нейроны 286 (234; 338) 169(156; 248,8)** 134,0 (119; 148)***" Н = 45,7; р = 0,0000#
Глия 202,0 (168; 215) 202 (190; 247) 241(223; 254)** Н = 37,5; р = 0,0000#
Слой V
Нейроны 168 (125; 214) 135 (118; 142) 102 (84; 112)**" Н = 34,5; р = 0,0000#
Глия 108 (99; 140) 140(129; 173)* 161(150; 175)** Н = 38,4; р = 0,0000#
Примечание. * — р < 0,05 в сравнении с контролем; ** — р < 0,01 в сравнении с контролем; *** — р < 0,001 в сравнении с контролем; ~ — р < 0,05 в сравнении с острой ишемией; # — различия статистически значимы при множественном сравнении трех групп (ANOVA Краскела-Уоллиса).
Таблица 2
Общая площадь (мкм2) всех гранул №Е-позитивного материала в поле зрения (38 280 мкм2) лобной коры большого мозга человека в норме и при ишемии, Ме (LQ; HQ)
Слой Группа ANOVA К-У (^ = 2)
контроль острая ишемия хроническая ишемия
ШЬ 267 (178; 306) 501 (445; 506)*** 387 (340; 405)**""" Н = 109,3; р = 0,0000#
V 363 (317; 380)** 315 (292; 347)**** 504 (483; 529)***"""*** Н = 90,9; р = 0,0000#
Примечание. * р < 0,05 в сравнении с контролем; ** — р < 0,01 в сравнении с контролем; *** — р < 0,001 в сравнении с контролем; — р < 0,001в сравнении с острой ишемией; •• — р < 0,01 в сравнении со слоем III; ••• — р < 0,001 в сравнении со слоем III (критерий Колмогорова-Смирнова); # - различия статистически значимы при множественном сравнении трех групп (ANOVA Краскела-Уоллиса).
Таблица 3
Общая площадь (мкм2) всех гранул GFAP-позитивного материала в поле зрения (38 280 мкм2) лобной коры большого мозга человека в норме и при ишемии, Ме (LQ; HQ)
Слой Группа ANOVA К-У (сК = 2)
контроль острая ишемия хроническая ишемия
III 232 (230; 257) 251 (237; 269)*** 365 (324; 398)***""' Н = 55,3; р = 0,0000#
V 268 (256; 305)*** 379 (335; 539)****** 403 (388; 409)***"*** Н = 48,5; р = 0,0000#
Примечание. *** — р < 0,001в сравнении с контролем; ~ — р < 0,05 в сравнении с острой ишемией; — р < 0,001 в сравнении с острой ишемией; *** — р < 0,001 в сравнении со слоем III (критерий Колмогорова-Смирнова); # — различия статистически значимы при множественном сравнении трех групп (ANOVA Краскела-Уоллиса).
держался в незначительном количестве или вовсе отсутствовал, а в других его было существенно больше, чем в контроле (рис. 1в). Появлялось большое количество немеченых нейронов, которые, вероятно, были подвержены реактивным или деструктивным изменениям. Увеличивалось и количество GFAP-позитивных астроцитов с гипертрофированными разветвленными отростками (рис. 1г).
Ишемию головного мозга обусловливали появление большого количества реактивно измененных нейронов (до 80 %) и дефицит численной плотности нейронов (рис. 2, а и б). Наиболее значительно количество нейронов уменьшалось в слое ШЪ при хронической ишемии. Редукция численной плотности нейронов сопровождалась увеличением количества астроцитов (табл. 1).
По данным морфометрического исследования иммуногистохимических препаратов ЛКБМ, при ишемии происходило статистически значимое изменение характера распределения, количества, размеров и формы флуоресцирующих меток NSE в нейронах всех слоев (табл. 2).
Так, в слое III ЛКБМ общая площадь флуоресцирующих NSE-позитивных гранул при острой ишемии увеличивалась в 1,9 раза, а при хронической ишемии — в 1,5 раза по сравнению с контролем (табл. 2). В слое V площадь ^Е-позитивных гранул уменьшалась на 13,2 % при острой ишемии и увеличивалась, по сравнению с контролем, в 1,4 раза при хронической (табл. 2).
Следовательно, увеличение количества ^Е-позитивного материала в ЛКБМ при ишемии сопро-
вождалось редукцией общей численной плотности нейронов и было возможным только в результате реализации механизмов внутриклеточной репара-тивной регенерации за счет гиперплазии клеточных органелл и усиленного синтеза растворимых ферментов цитоплазмы сохранившихся нейронов.
Общая площадь GFAP-позитивного материала в ЛКБМ при ишемии также статистически значимо увеличивалась (табл. 3): в слое III при острой ишемии, по сравнению с контролем, — на 7,6 % и при хронической ишемии — на 36,4 %, а в слое V — соответственно на 29,3 и 33,5 %. Наряду с этим увеличением площади GFAP-позитивного материала в слое III при хронической ишемии, в отличие от нейронов, увеличивалась и численная плотность астро-цитов на 16,3 % (табл. 1).
Заключение. При острой и хронической ишемии в сохранившихся неповрежденных нейронах лобной коры большого мозга компенсаторно увеличивается содержания нейроспецифической енолазы выше контрольных значений, что, вероятно, свидетельствует о высокой функциональной активности этих нейронов. Компенсаторная активация метаболизма части сохранившихся нейронов сопровождается активацией пула астроцитов с образованием новых клеток. Подобные изменения нейроглиаль-ных взаимоотношений обеспечивают наиболее оптимальные условия для постишемической реабилитации функций нейронных сетей в поврежденном головном мозге [4].
Библиографический список
1. Синаптическая пластичность головного мозга (фундаментальные и прикладные аспекты) / В. В. Семченко [и др.]. — Омск : Омская государственная медицинская академия, 2008. - 408 с.
2. Актуальные проблемы изучения структурно-функционального состояния нейронов коры большого мозга человека
в постишемическом периоде / А. В. Мыцик [и др.] // Журнал анатомии и гистопатологии. — 2012. — Т. 1, № 1. — C. 37 — 48.
3. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy / J. C. Fiala // Journal of Microscopy. — 2005. — Vol. 218, № 1. - P. 52-61.
4. Immunocytochemistry of neuron specific enolase (NSE) in the rat brain after single and repeated epileptic seizures / М. Yardimoglu [et al.] // Int. J. Neurosci. — 2008. — Vol. 118, № 7. — P. 981 — 983.
5. Schmechel, D. E. The brain enolases as specific markers of neuronal and glial cells / D. E. Schmechel [et al.] // Science. — 1978. — Vol. 199, № 4326. — P. 313 — 315.
6. Глиальный фибриллярный кислый белок в астроцитах неокортекса человека / Д. Э. Коржевский [и др.] // Морфология. — 2004. — Т. 126, № 5. — С. 7—10.
МЫЦИК Алексей Владимирович, ассистент кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Омской государственной медицинской академии (ОмГМА).
АКУЛИНИН Виктор Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ОмГМА. СТЕПАНОВ Сергей Степанович, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ОмГМА. ЛАРИОНОВ Пётр Михайлович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярно-генетических и морфологических исследований Новосибирского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии.
Адрес для переписки: [email protected]
Статья поступила в редакцию 04.04.2013 г.
© А. В. Мыцик, В. А. Акулинин, С. С. Степанов,
П. М. Ларионов
Книжная полка
Пономаренко, Г. Н. Физические методы лечения : справ. / Г. Н. Пономаренко. - 4-е изд., перераб. и доп. -СПб. : Санкт-Петербург, 2011. - 319 с. - ISBN 5-91263-007-2.
В четвертом издании пособия (первое вышло в 1999 году, второе — в 2002 году, третье — в 2006 году) па основе оригинальной классификации физических методов лечения представлены сведения о современных физических методах лечения, применяемых в медицинской практике в настоящее время, и вызываемых ими лечебных эффектах. Составляющие основу пособия физические методы лечения имеют доказательную базу лечебного действия. Приведены введенные в практику физиотерапии в последние годы физические методы, широко используемые в инновационных технологиях медицины (аппаратная косметология, СПА-медицина, восстановительная и профилактическая медицина). Представлены основные механизмы лечебного действия, основные показания и противопоказания к назначению физических метолов лечения, параметры лечебного воздействия, вопросы дозирования и совместимости процедур. Пособие предназначено для практических врачей, использующих в своей практике физические методы лечения, врачей-интернов, физиотерапевтов, врачей восстановительной медицины. Содержащиеся в нем сведения могут быть использованы студентами высших медицинских учебных заведений.
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (118) 2013 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
