CC BY
18
БИОФИЗИКА И МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
Влияние ионов тяжелых металлов на молекулярно-динамические характеристики молекул коллагена в водных растворах
А. Д. Масленникова0, И. С. Сергеева6, Г. П. Петрова
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, физический факультет, кафедра молекулярной физики. Россия, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 2.
E-mail: а [email protected], ь [email protected]
Статья поступила 26.09.2012, подписана в печать 21.12.2012.
Методом динамического рассеяния света изучено влияние ионов тяжелых (Pb2+, Cs+) и легких (Na + ) металлов на молекулярно-динамические характеристики белка коллагена I типа в водном растворе. Получено, что зависимость коэффициента трансляционной диффузии Dt от показателя кислотности среды рН имеет нелинейный вид с выраженным экстремумом в области изоэлектриче-ской точки белка (pi 6.0). Для чистого водного раствора белка в области изоэлектрической точки наблюдается максимум. Для растворов белка коллагена с добавлением солей тяжелых металлов в области изоэлектрической точки наблюдается минимум. Данная зависимость свидетельствует об образовании белковых нанокластеров в растворе. С увеличением концентрации ионов тяжелых металлов коэффициент трансляционной диффузии Dt уменьшается, что свидетельствует об усилении эффекта агрегации. При добавлении в водный раствор коллагена, содержащего ионы тяжелого металла, соли натрия также наблюдается резкое уменьшение коэффициента трансляционной диффузии частиц. Это, по-видимому, является следствием увеличения массы рассеивающих частиц (агрегатов).
Ключевые слова: коллаген I типа, ионы тяжелых металлов, свинец, цезий, метод динамического рассеяния света, изоэлектрическая точка, коэффициент трансляционной диффузии.
УДК: 577.32.11, 537.635. PACS: 87.15.Nn, 42.62.Ве, 87.64.Сс.
Введение
Изучение физических процессов, происходящих в растворах белков, содержащих ионы тяжелых металлов, например свинца и цезия, необходимо для понимания влияния патогенных факторов на биологические объекты. Автомобильные выхлопы и выбросы отходов с предприятий в больших концентрациях содержат тяжелые металлы, которые оказывают не только внешнее негативное воздействие на среду обитания человека, но также могут попадать внутрь организма с вдыхаемым воздухом и осаждаться на коже человека.
Коллаген — фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани организма (сухожилие, кость, хрящ, дерма и т. п.) и обеспечивающий ее прочность и эластичность [1]. В данный момент описано 28 различных типов коллагена. Они отличаются друг от друга по аминокислотной последовательности, а также по степени модификации — интенсивности гидроксили-рования или гликозилирования. Самый распространенный из них — коллаген I типа, основа кожного покрова всех живых существ. В данной работе исследовался коллаген первого типа, полученный из кожи теленка.
Белки в водных растворах имеют тенденцию к агрегации в зависимости от их физико-химического состояния. Этот процесс часто бывает необратимым и может являться признаком некоторых серьезных заболеваний в организме человека. Патологические изменения в структуре коллагеновых фибрилл являются причиной ряда заболеваний соединительной ткани и характеризуются поражением органов, а именно суставов, сердца, сосудов, мышечной и кожной ткани.
Агрегация и другие процессы, происходящие с белковыми макромолекулами в растворах, зависят от природы белков, их концентрации, типа растворителя, солей, ионов металлов, кислот, оснований, показателя рН, температуры и других факторов.
Было показано экспериментально [2], что при добавлении ионов легких металлов (например, натрия) в растворы глобулярных (альбумина, гамма-глобулина) и фибриллярных (коллагена) белков их динамические параметры не изменяются. При добавлении ионов тяжелых металлов (например, свинца, калия, кадмия) наблюдалось уменьшение коэффициента трансляционной диффузии молекул, что может быть связано с увеличением массы диффундирующих частиц. Из этого можно сделать вывод, что наличие ионов тяжелых металлов «запускает» процесс кластеризации белков в растворе.
В работе [3] исследовались свойства мономолекулярных слоев коллагена и продукта его денатурации — желатина, а также изучалось влияние трехвалентных ионов металлов (Ре3+, А13+, Сг3+) на поведение молекул белка в монослоях. Было показано, что слои желатина и коллагена наименее расширены на подложках при значениях рН, близких к изоэлектрической точке белка (рН 6.0 для коллагена, рН 4.8 для желатина). Выявлено, что введение в водную подложку ионов Ре3+ оказывает на монослои коллагена и желатина сильное конденсирующее действие. Авторы объясняют этот эффект образованием на границе раздела вода-воздух двумерных комплексов макромолекул с ионами Ре3+. Также получено, что ионы Сг3+ оказывают на монослои
коллагена и желатина меньшее конденсирующее деи-свие, а ионы А13+ влияют только на свойста желатина.
Целью настоящей работы было исследование моле-кулярно-динамических процессов, происходящих в водных растворах молекул коллагена I типа при изменении различных параметров среды (рН, концентрация белка, ионная сила), в том числе изучение вредного воздействия ионов токсичных металлов (РЬ2+ и Сэ+) методом динамического рассеяния света.
1. Теоретические основы метода динамического рассеяния света
Метод динамического рассеяния света используется для изучения изменения динамических параметров молекул (например, коэффициента трансляционной диффузии или гидродинамического радиуса частиц). В методе исследуется корреляционная функция флуктуаций интенсивности рассеянного света, вызванных броуновским движением частиц. Для растворов макромолекул возможно связать корреляционную функцию сЦ), описывающую молекулярное движение, с коэффициентом трансляционной диффузии Д:
с(0 = а {Е*(0)Е(0) = с0 ехр(^ОИг20. (1)
Соответствующий метод определения сЦ) называется методом корреляции фотонов. Известно, что существует связь между функцией спектральной плотности молекулярного движения 5(ш) и с(0 в виде
c{t)e dt
(2)
Функцию 5(ш) можно определить методом оптического смешения света [4]. При динамическом светорассеянии излучение детектируется под постоянным углом (обычно 90°). Диффузное движение частиц в растворе увеличивает флуктуации интенсивности рассеянного света в микросекундном временном интервале.
В простейшем случае идеальной трансляционной диффузии малых по сравнению с величиной 1/д невзаимодействующих одинаковых сферических частиц в растворе можно показать, что спектр мощности фототока представляет собой лоренцовскую кривую с полушириной Г = , а корреляционная функция — экспоненту с временем релаксации тге1 = 1/Г. Таким образом, по спектру легко определяется коэффициент трансляционной диффузии Д.
Характерное время релаксации флуктуаций пропорционально размеру частиц. Спектр фототока в случае полидисперсности раствора, т. е. при наличии в нем различающихся по размерам частиц, представляет собой непрерывное множество (интеграл) лоренцовых кривых с разными полуширинами:
G(r)e
(3)
Следовательно, для нахождения распределения частиц по размерам (коэффициентам диффузии) необходимо решать обратную спектральную задачу в виде интегрального уравнения с лоренцовым ядром.
Для полидисперсных частиц, или частиц с характеристическими размерами, соизмеримыми с длиной
волны исходного пучка, автокорреляционная функция является суммой вкладов интенсивностей частиц различных размеров и различных дуффузионных мод. При этом интерпретация Д представляет собой довольно сложную задачу.
В работе [5] была рассмотрена связь между статистическими и динамическими параметрами рассеяния света в растворах макромолекул. Концентрационная зависимость коэффициента трансляционной диффузии Д может быть представлена вириальным разложением по малым концентрациям. В соответствии с этим связь между коэффициентом Д, массой молекулы М, коэффициентом межмолекулярного взаимодействия В и характеристической вязкостью белкового раствора [??] определяется уравнением
A = A>{l + (2BM-fo])c}.
(4)
Характеристическая вязкость [??] — предельное значение вязкости при с —> 0. Д — коэффициент трансляционной диффузии, определяемый по формуле (3).
2. Объект исследования
В работе исследовались водные растворы молекул коллагена I типа, полученного из телячьей кожи, немецкой фирмы «Sigma Aldrich» при добавлении солей свинца РЬ(СНзСОО)г, цезия CsCl и натрия NaCl.
Коллаген - основной структурный белок межклеточного матрикса. Он составляет 25-33% общего количества белка в организме, т. е. 6% массы тела. Название «коллаген» объединяет семейство близкородственных фибриллярных белков, которые являются основным белковым элементом кожи, костей, сухожилий, хряща, кровеносных сосудов, зубов. В разных тканях преобладают разные типы коллагена, а это в свою очередь определяется той ролью, которую коллаген играет в конкретном органе или ткани. 95% всего коллагена в организме человека составляют коллагены I, II и III типов, которые образуют очень прочные фибриллы. Коллаген I типа входит в состав кожи, сухожилий, костей, роговицы, плаценты, артерий, печени и дентина человека.
Молекула коллагена представляет собой правоза-крученную спираль из трех а-цепей. Такое образование известно под названием тропоколлаген. Один виток спирали а-цепи содержит три аминокислотных остатка. Молекулы коллагена не связаны между собой «конец в конец», а между ними имеется промежуток в 35-40 нм. При электронной микроскопии видно, что фибриллы коллагена состоят из молекул, смещенных относительно друг друга примерно на 67 нм (единица, которая обозначается буквой D и меняется в зависимости от состояния гидратации вещества). Считают, что такое строение максимально повышает сопротивление всего агрегата растягивающим нагрузкам [6].
Выбор исследуемых металлов обусловлен их распространением в природе. Свинец в большом количестве присутствует в окружающей среде и попадает в организм человека с вдыхаемым воздухом, либо осаждаясь на коже. Свинец и его соединения чрезвычайно токсичны. Попадая в организм, свинец накапливается в костях, вызывая их разрушение. Предельно допустимая концентрация соединений свинца в атмосферном воз-
духе 3.8 мг/м3, ацетата свинца (РЬ(СН,зСОО)2), используемого в настоящей работе, равна 0.01 мг/м3 [7].
Цезий относится к группе тяжелых металлов. 137 Сэ — бета-гамма-излучающий радиоизотоп, один из главных компонентов радиоактивного загрязнения биосферы. Он содержится в радиоактивных отходах, сбросах заводов, которые перерабатывают отходы атомных электростанций.
Натрий — неотъемлемая часть всех биологических жидкостей человека: крови, пота, лимфы. В связи с этим полезно изучить механизм взаимодействия молекул белка коллагена с ионами тяжелых (свинец, цезий) и легких (натрий) металлов.
Исследования проводились при различных ионных силах растворов, т. е. при различной концентрации ионов металла. Ионная сила раствора /х рассчитывалась по формуле
(5)
где С; ЦЫ, 2;
молярная концентрация данной ионнои части- число ее элементарных зарядов.
3. Экспериментальная установка
Для исследований использовалась оптическая установка «Photocor-FC» (рис. 1) с диодным лазером (длина волны 647 нм и мощность 25 мВ) [3, 5]. Измерения проводились под углом 90°, сигнал с ФЭУ (Perkin Elmer), анализировался компьютером [8]. В кювете с исследуемым раствором поддерживалась комнатная температура (20° С) при помощи встроенного в прибор термостата.
4. Результаты исследований
В работе [2] при исследовании динамических параметров молекул коллагена в чистом водном растворе и в растворах с добавлением солей NaCl и CaS04 были получены нелинейные зависимости коэффициента трансляционной диффузии Д от рН с максимумом вблизи изоэлектрической точки белка (рН 6.0), соот-
ветствующей минимальному значению поверхностного заряда молекулы белка. В соответствии с формулой (5) коэффициент трансляционной диффузии белка Д должен уменьшаться, если его характеристическая вязкость превышает произведение массы молекулы на коэффициент межмолекулярного взаимодействия. Действительно, как следует из литературных данных [9], характеристическая вязкость коллагена (1150 см3/г) более чем на два порядка выше, чем вязкость таких глобулярных белков как, например, альбумин (3.7 см3/г).
В настоящей работе были получены рН-зависимости коэффициента трансляционной диффузии Д молекул коллагена в чистом водном растворе белка (концентрация белка в растворе с = 0.05 мг/мл), а также в растворах с добавлением солей свинца РЬ(СНзСОО)г, цезия СэС1 и натрия МаС1 (рис. 2-5).
Как видно из рис. 2, в чистом водном растворе коллагена зависимость коэффициента трансляционной диффузии от рН имеет нелинейный вид, близкий к параболическому, с максимумом в области изоэлектрической точки белка р1 6.0 (рис. 2, кривая /). При добавлении в раствор ионов свинца характер зависимости меняется - вблизи изоэлектрической точки наблюдается теперь минимум, а не максимум, как в случае чистого раствора коллагена (рис. 2, кривые 2, 3). Вероятно, это связано со сменой характера взаимодействия молекул коллагена в водном растворе с кулон-кулоновского на диполь-дипольное и с образованием белковых нанокла-стеров [5].
На рис. 2 видно что, минимум в области изоэлектрической точки белка становится глубже с ростом ионной силы раствора. Это указывает на то, что с увеличением концентрации ионов РЬ21 в растворе масса рассеивающих частиц также растет, что связано с усилением эффекта кластеризации.
Аналогичные зависимости были получены для водных растворов с добавлением соли цезия (рис. 3). Из рис. 3 видно, что рН-зависимость коэффициента трансляционной диффузии Д молекул коллагена в водном растворе с содержанием ионов Сэ 1 также имеет нелинейный вид с минимумом в изоэлектрической точке
225
500 (~ 240...900 нм)
©
ш
О) -0-
ж
0125 ' 070 -
Расстояния в мм
(.15
□
<ё> @ и
Ж
495
0180
Ж
о—
990
Рис. 1. Схема экспериментальной установки. На жестком основании 6 смонтированы прецизионный гониометр 10 и оптическая скамья 5, на которой размещены Не-№ лазер / и фокусирующий узел 3. Термостат 7 и адаптер кювет 8 установлены на гониометре коаксиально с его осью. На поворотной консоли // гониометра располагается фотоприемный блок 14, в состав которого входит приемная оптическая система 13 со сменной диафрагмой выбора апертуры 12, малошумящий фотоумножитель, работающий в режиме счета фотонов, быстрый усилитель-дискриминатор 15 со сквозным по постоянному току трактом и специальный высоковольтный источник питания ФЭУ без паразитных корреляций
Д *10"9, см2/с
Рис. 2. рН-зависимость коэффициента трансляционной диффузии Д коллагена (/ — в чистом водном растворе; с добавлением соли РЬ(СНзСОО)г: 2 — д = 10^4 моль/л, 3 — д = 10^3 моль/л)
Б, *10 9, см2/с 18 -16 -
14 - т ___I
12 " ^ч
10 " 2<
8 -
6 ~ 4
4 - Т
4.6 5.0 5.4 5.8 6.2 рН
Рис. 3. рН-зависимость коэффициента трансляционной диффузии Д коллагена (/ — в чистом водном растворе; с добавлением соли СзС1: 2 — д = 10^5 моль/л, 3 — д= 10^4 моль/л, 4 — д= 10^3 моль/л)
белка и уменьшается с увеличением концентрации ионов тяжелого металла (рис. 3, кривые 2-4).
Также было получено, что добавление ионов натрия в водные растворы коллагена, содержащие ионы тяжелого металла (РЬ21), приводит к уменьшению коэффициента трансляционной диффузии в области изоэлектрической точки белка (рис. 4, кривые 2, 3). Из чего можно сделать вывод, что ионы натрия усиливают эффект кластеризации молекул в водных растворах белка, содержащих ионы тяжелого металла РЬ21 .
Аналогичный эффект наблюдается и при добавлении соли ЫаС1 в водный раствор белка, содержащий ионы Сэ 1 (рис. 5, кривые 2, 3).
Заключение
Обнаружено, что добавление солей РЬ(СНзСОО)г и СэС1 в водные растворы коллагена приводит к уменьшению коэффициента трансляционной диффузии в области изоэлектрической точки белка (р1 6.0), что связано с ростом массы рассеивающих частиц при образовании белковых нанокластеров.
Выявлено, что с ростом концентрации ионов Сэ 1 и РЬ21 в водных растворах коллагена минимум на рН-за-висимости коэффициента трансляционной диффузии
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 рН
Рис. 4. рН-зависимость коэффициента трансляционной диффузии Д коллагена (/ — в чистом водном растворе; 2 — с добавлением соли РЬ(СНзСОО)г, дрь = 10^3 моль/л; 3 — с добавлением солей РЬ(СНзСОО)г, Дрь = Ю-3 моль/л, и №С1, ДНа = Ю-3 МОЛЬ/Л)
¿>,*10~9,см2/с
16
14
12
10 8 1 V
6 4 2 _ т
2 3!- | 1 11111
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 рН
Рис. 5. рН-зависимость коэффициента трансляционной диффузии Д коллагена (/ — в чистом водном растворе; 2 — с добавлением соли СбО, дс5 = Ю-3 моль/л; 3 — с добавлением солей СбО, дс5 = Ю-3 моль/л, и №С1, дна = Ю-3 моль/л)
становится глубже, что связано с ростом рассеивающих частиц.
Получено, что в водных растворах коллагена, содержащих ионы Сэ 1 и РЬ21 , добавление ионов Ыа 1 приводит к уменьшению коэффициента трансляционной диффузии и усилению «эффекта кластеризации».
Таким образом эффект, вызванный тяжелыми металлами, приводит к изменению молекулярно-динами-ческих параметров молекул коллагена в водных растворах: уменьшению коэффициента трансляционной диффузии, увеличению линейных размеров частиц. Содержание тяжелых металлов в окружающей нас среде увеличивается быстрыми темпами в результате деятельности человека, в связи с этим изучение воздействия этих вредных факторов на организм человека, в том числе на слизистые оболочки и кожный покров, имеет важное практическое значение для медицины, экологии и биофизики. Данные, полученные на модельных растворах
белка, позволяют установить возможные патологические процессы в организме человека, происходящие под воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды.
Работа выполнена при финансовой поддежке РФФИ (грант 12-02-00434-а).
Список литературы
1. Boot-Handford R.P., Tuckwell D.S. 11 Bioessays. 2003. 2, № 25. С. 142.
2. Сергеева И.А., Сокол Н.В., Иванова М.С. и др. // Вестн. Моск. ун-та. Физ. Астрон. 2009. № 4. С. 85.
3. Лебедев А.Д., Левчук Ю.Н., Ломакин А.В. и др. Лазерная корреляционная спектроскопия в биологии. Киев, 1987.
4. Камминс Г.З., Пайк Е.Р. Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов. М., 1978.
5. Петрусевич Ю.М., Петрова Г.П. // Биомед. Радиоэлектроника. 2000. № 3. С. 41.
6. Биохимия: Учеб. для вузов / Под ред. Е. С. Северина. М., 2003.
7. Rajaram R.K., Mohana Rao J.К. 11 Z. Kristallogr. 160, N 3-4. P. 225.
8. http://www.photocor.ru/dynals.htm.
9. Маршелл Э. Биофизическая химия. Т. 1. М., 1981.
Effect of heavy metal ions on dynamic characteristics of collagen molecules in solutions A. D. Maslennikova", I. A. Sergeeva", G. P. Petrova
Department of Molecular Physics, Faculty of Physics, M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow 119991, Russia.
E-mail: a [email protected], b [email protected].
Effect of heavy ions (Pb2+, Cs+) and light (Na+) metal on the molecular-dynamic characteristics of collagen protein type I in aqueous solution was studied with the method of dynamic light scattering. It was found that the dependence of translational diffusion coefficient Д from pH solutions has nonlinear form with a pronounced extremum near of the isoelectric point of the protein (pi 6.0). For pure aqueous solution of protein there is a maximum of Д in isoelectric point. For collagen protein solutions with the addition of heavy metals salts the minimum of Д is observed near of the isoelectric point. This fenomenon is connected with the formation of protein nanoclusters in the solution. With concentration of heavy metal ions increasing translational diffusion coefficient Dt decreases, which shows on increasing of aggregation effect. The addition of sodium ions in aqueous solution of collagen containing heavy metal ions sharp decreasing of the translational diffusion of molecules is observed. That can be connected with the rise of scattering particles masses.
Keywords: collagen I type, heavy metal ions, cesium, lead, dynamic light scattering, isoelectric point, translation
diffusion coefficient.
PACS: 87.15.Nn, 42.62.Be, 87.64.Cc.
Received 26 September 2012.
English version: Moscow University Physics Bulletin 2(2013).
Сведения об авторах
1. Масленникова Анна Дмитриевна — студентка; тел.: (495) 939-10-88, e-mail: [email protected].
2. Сергеева Ирина Александровна — канд. физ.-мат. наук, ст. преподаватель; тел.: (495) 939-10-88, e-mail: [email protected].
3. Петрова Галина Петровна — докт. физ.-мат. наук, профессор; тел.: (495) 939-10-88, e-mail: [email protected].
