CC BY
46
УДК 576 . 33. 04
Н. В. Кулева, М. А. Сабиров, В. Б. Филимонов, А. И. Раилкин
влияние ионов меди на показатели окислительного стресса у беломорской мидии MYTILUS EDULIS
Санкт-Петербургский государственный университет
Существование на Земле аэробных организмов сопряжено со своеобразным кислородным парадоксом, который определяется, с одной стороны, необходимостью кислорода для извлечения из органических веществ пищи необходимой организму энергии и, с другой — его вредным влиянием в связи с образованием активных форм кислорода (АФК) . Антиоксидантная защита организмов предохраняет биологические системы от токсического действия АФК. Когда системы защиты нарушаются или уровень генерации АФК превышает возможности антиоксидантных систем организма, наступает состояние окислительного стресса (ОС) [19] .
Многие загрязнители окружающей среды, такие, как хлорорганические соединения или тяжелые металлы, попадая в организм, приводят к избыточной генерации АФК [2, 4, 5] . В присутствии ионов меди АФК могут образовываться в ходе реакции Фентона [19] . Избыток АФК вызывает перекисное окисление липидов (ПОЛ), окисление аминокислотных остатков в боковых цепях белков, приводящее к появлению альдегидных и кетонных групп (карбо-нилированию белков), а также окисление оснований в нуклеиновых кислотах [8, 11] .
Двустворчатые моллюски, обладающие фильтрационным типом питания, накапливают тяжелые металлы в своих тканях и являются хорошими биоиндикаторами загрязнения водной среды . Установлено, что загрязнение среды тяжелыми металлами изменяет профили экспрессии цитоплазматических белков и влияет на такие показатели ОС моллюсков, как активность ферментов антиоксидантной защиты [14, 17,18] .
Цель настоящей работы — изучить влияние ионов меди на показатели окислительного стресса у беломорской мидии Mytilus edulis: перекисное окисление липидов, содержание белковых SH-групп и карбонилирование белков .
Материалы и методы исследования. Мидии были собраны на мидиевой банке (пролив Под-пахта губы Чупа Кандалакшского залива Белого моря) в отлив в конце сентября 2006 г. на каменистом грунте, в условиях быстрого течения . До эксперимента около 1,5 лет животные содержались в Морском аквариальном комплексе БиНИИ . За этот период они увеличились в размерах примерно в 2 раза, и длина раковин составляла 3-5см . Температура содержания мидий за этот период, а также в период эксперимента, колебалась в пределах от +9 до +10 °С .
Кормление осуществляли личинками (науплиусами) рачка Artemia salina дважды в неделю . Моллюсков содержали в естественной беломорской воде (место забора — прибрежные воды губы Чупа Кандалакшского залива Белого моря у пос . Чкаловский) . Соленость воды — 24 о/оо .
Изучение влияния хлорида меди на мидий проводили в условиях Морского аквариального комплекса БиНИИ . Моллюсков разделили на три группы — по 15 особей в каждой: «контрольную» и две «опытных»
© Н . В . Кулева, М . А. Сабиров, В . Б . Филимонов, А. И . Раилкин, 2008
(концентрация хлорида меди — 1 и 5 мг/л) . Срок экспозиции составил 6 суток . У моллюсков всех групп были извлечены мягкие ткани, а также запирательные мышцы . Все образцы биоматериала хранились при -80 °С . Для экстракции водорастворимых белков ткани мидий каждой группы растирали в охлажденной фарфоровой ступке в 10 объемах охлажденного 30 мМ Трис-HCl буфера (рН 7,4), содержащего 100 мМ KCl .
Полученный тканевой гомогенат использовали для определения перекисного окисления липидов . Для определения белковых SH-групп и обнаружения карбонилированных белков гомогенат центрифугировали 15 мин на центрифуге К-24 при 11000 g и использовали супернатант. Перед определением ПОЛ и SH-групп в гомогенате и супернатанте, соответственно, определяли концентрацию белка микро-биуретовым методом [12].
Показателем ПОЛ служило увеличение концентрации малонового диальдегида (МДА), которое определяли по методу М . Ушияма и М . Михара [20], в модификации, описанной Ф . Е . Путилиной с соавтарами [6] . Содержание SH-групп определяли по реакции с 5,5-дитио-бис-нитробензойной кислотой по Элману в модификации, описанной ранее [8] статистическую обработку проводили методами, изложенными в пособии [7]
О карбонилировании белков судили с помощью электрофореза и иммуноблоттинга . Для разделения белков использовали электрофорез на 12%-м полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия по Ю . К . Лэммли [13] . По завершении электрофореза белки переносили на поливинилдифторидную мембрану и осуществляли их реакцию с динитрофенилгидразином, чтобы пометить карбонилированные белки [10]. Для проведения электрофореза и вестерн-блоттинга использовали установку PROTEANE 3Cell (BIO-RAD) . Для обнаружения карбонилированных белков использовали кроличьи антитела к динитрофенолу и вторичные мышиные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена Для визуализации карбонилированных белков использовали 0,1%-ный диаминобензидин и 0,01%-ную перекись водорода.
результаты исследований и их обсуждение. В результате эксперимента in vivo оказалось, что моллюски, экспонированные в среде с концентрацией CuCl21 и 5 мг/л, в меньшей степени распределились по поверхности экспериментальных емкостей по сравнению с контрольными животными (рис . 1) . Стрессирующее действие ионов меди на уровне организма может быть связано с тормозящим влиянием ионов двухвалентной меди на двигательную активность животных . Уменьшение подвижности можно объяснить действием Cu2+ либо на регуляторные, либо на исполнительные механизмы подвижности .
Показателями окислительного стресса, как уже отмечено, могут быть усиление ПОЛ [11] и уменьшение содержания белковых SH-групп . В результате проведения эксперимента in vivo по выявлению возможных изменений показателей окислительного стресса
Рис. 1. Различия в локализации моллюсков в «контрольной» (А, без добавок хлорида меди) и двух «опытных» группах (Б и В, концентрация хлорида меди 1 и 5 мг/л) после 6-суточной экспозиции
a ó <: a ó <:
Рис. 2. Влияние хлорида меди на перекисное окисление липидов (А) и количество белковых
SH-групп (Б) мягких тканей мидий а — контрольный уровень показателей, принятый за 100 %, б — «опыт-1» с концентрацией CuCl2 1 мг/мл, в — «опыт-2» с концентрацией CuCl2 5 мг/мл .
у M. edulis при добавлении в среду ионов двухвалентной меди, было установлено, что обнаруженные изменения значений концентрации МДА и содержания тиоловых групп не являются статистически значимыми (рис . 2) . Это означает, что использованные нами концентрации Cu2+, не вызывают окислительного стресса в мягких тканях моллюсков in vivo, что соответстствует данным литературы: металл-зависимая генерация ОН может не играть существенной роли в ОС in vivo [1]. С другой стороны, токсические эффекты различных загрязнителей окружающей среды, как правило, проявляются в жабрах и в меньшей степени в пищеварительных железах мидий [15]. Еще одной возможной причиной слабой чувствительности этих показателей к действию ионов двухвалентной меди в нашем эксперименте может быть длительное (1,5 года) содержание мидий в условиях аквариума и их адаптированность к возможным изменениям окружающей среды .
В результате проведения электрофореза с последующим иммуноблоттингом цитоплазматических белков из мягких тканей мидий (данные не приводятся) было установлено, что карбонилированию в одинаковой степени для мидий всех групп подвергается один из белков, по электрофоретической подвижности немного превосходящей актин, возможно, тропомиозин. Полос карбонилированного белка, соответствующего по электрофоретической подвижности актину, обнаружено не было . По данным литературы [15, 16], именно актин является мишенью окислительного стресса в жабрах и пищеварительной железе мидий. Отсутствие полос, соответствующих актину, возможно, объясняется малым его содержанием в мягких тканях мидий, выходящим за пределы чувствительности метода при данных условиях его проведения . Для проверки возможности карбонилирования актина были исследованы белки, экстрагированные раствором высокой ионной силы из запирательных мышц мидий, где актин является мажорным белком
В результате проведения электрофореза и последующего иммуноблоттинга белков из запирательных мышц мидий (рис . 3) были выявлены полосы карбонилированных белков, интенсивность которых не сильно различается для мидий контрольной и опытных групп Они соответствуют по электрофоретической подвижности актину, тяжелым и легким цепям миозина. Кроме того, карбонилированным оказался белок, присутствующий исключительно в пробах из запирательных мышц Электрофоретическая подвижность этого белка несколько меньше таковой для тяжелых цепей миозина. В литературе есть данные, позволяющие предположить, что это может быть миород — белок, связанный с запирательной функцией мышц моллюсков [3, 21].
А
М
к
Ol
O1
А
М
к
O1
O1
Рис. 3. Электрофореграмма и вестерн-блот белковых проб из запирательных мышц мидий А — актин; М — миозин; К — «контроль»; OI - «опыт-1» (концентрация CuCl2 1 мг/л); 02 — «опыт-2»
(концентрация СиС12 5 мг/л ).
Таким образом, наши данные по перекисному окислению липидов, содержанию тиоловых групп и карбонилированию белков из мягких тканей и мышц-запирателей мидий соответствуют друг другу и показывают, что указанные ткани мидий, экспонированные с хлоридом меди 1 и 5 мг/л, не испытывали оксидативного стресса. Однако были обнаружены те белки, которые могут подвергаться окислению in vivo у мидий . Это сократительные белки и белки цитоскелета, в первую очередь, актин Эти данные соответствуют данным других публикаций, демонстрирующих окисление актина в присутствии перекиси водорода и тяжелых металлов [8, 9].
Следует принять во внимание, что карбонилирование белков, которое представляет собой необратимую модификацию боковых цепей, может приводить к агрегации инактивации и деградации белков [19]. Метод одномерного электрофореза использованный в настоящей работе, не позволяет выявить эти модификации в смеси белков . Однако обнаруженное влияние ионов меди на двигательную активность мидий может быть обусловлено именно такими модификациями сократительных белков . Поэтому кажется перспективным выделить очищенные препараты сократительных белков и исследовать их структурные и функциональные свойства.
Summary
Kuleva N. V., SabirovM. A., Filimonov V B., Railkin A. I. The influence of Cu-ions on oxidative stress biomarkers in White sea Mytilus edulis mussel
The influence in vivo of Cu-ions in concentration 1 and 5 mg/l on oxidative stress parameters changes was studied in White sea Mytilus edulis mussel . Malone dialdehyde and thiol group content did not significally
change in mussel tissues . Carbonylation of contractile and tissues proteins did not reveal any dependence on Cu-ions concentration in medium . The absence of the changes may be a consequence of long term staying of mussels in aquarium conditions
Key words: oxidative stress, Mytilus edulis, protein carbonylation
Литература
I. Воейков В. Л. Регуляторные функции активных форм кислорода в крови и водных модельных системах: Докт. дис . М. , 2003 . 269 с .
2 . Довженко Н. В., Куриленко А. В., Бельчева Н. Н. Окислительный стресс, индуцированный кадмием, в тканях двустворчатого моллюска Modiolus modiolus // Биология моря . 2005 . Т 31, № 5 . С.358-362 .
3 . Матусовский О. С. Физико-химические свойства миорода и телокина, сократительных белков гладких мышц: Автореф . канд. дис . Владивосток, 2005 . 22 с .
4 . Павловская В. В . Экологические аспекты реакции моллюсков Dreissenapolymorpha (Pallas, 1771) на действие ионов тяжелых металлов: Автореф . канд . дис . Калининград, 2007. 26 с .
5 . Подгурская О. В. Механизмы детоксикации тяжелых металлов у моллюсков семействаMytilidae: Автореф канд дис владивосток, 2006 22 с
6 . Путилина Ф. Е., Галкина О. В., Ещенко Н. Д., Диже Г. П., Красовская И. Е., Прокопенко В. М. Практикум по свободнорадикальному окислению, СПб . , 2006 .
7 . Учебное пособие по медицинской статистике / Под ред . Е . Я . Белицкой. Л. , 1972 .
8 . Федорова М. А., Благовещенский И. Ю., Филимонов В. Б., Кулева Н. В. Неэнзиматическая модификация актина in vitro под влиянием факторов окислительного, гликоокислительного и нитрозоактивного стрессов // Вестн . С . -Петерб . ун-та . 2006. Сер . 3 . Вып . 2 . С . 51-58 .
9 . Chora S., McDonagh B., Sheehan D. Ubiquitination and carbonylation as markers of oxidative stress in Ruditapes decussatus // Mar. Environ . Res . : 2008 (article in press) .
10 . Dalle-Donne J., Rossi R., Guistauni D, Colombo R. Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress // Clinica Chimica Acta. 2003 . Vol . 329 . Р. 23-38 .
II. Gutteridge J. M. C., HalliwellB. The measurement and mechanism of lipid peroxidation in biological systems // Trends Biol . Sci. 1990 . Vol. 15 . Р. 129-135 .
12 . Ithaki N. F., Gill H. M. A micro-biuret method for estimating proteins // Analyt. Biochem . 1964 . Vol . 9 . Р. 401-408 .
13 . Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature . 1970. Vol . 227. P. 680-685 .
14 . Manduzio H., Rocher B., Durand F., Galap C., Leboulenger F . The point about oxidative stress in molluscs // ISJ. 2005 . Vol . 2 . Р. 91-104 .
15 . McDonagh B., Tyther R., Sheehan D. Carbonylation and gluthtionylation of proteins in the blue mussel Mytilus edulis detected by proteomic analysis and Western blotting: Actin is target of oxidative stress // Aquat. Toxicol. 2005 . Vol. 73 . Р. 315-326.
16 . McDonagh B., Tyther R., Sheehan D. Redox proteomics in the mussel Mytilus edulis // Mar. Environ . Res 2006 Vol 62 р 101-104
17 . Rodríguez-Ortega M. J., Alhama J., Funes V. Biochemical biomarkers of pollution in the clam Chamaelea Gallina from south-spanish littoral // Environmental Toxicology and Chemistry: SETAC PRESS . 2002. Vol . 21. N 3 . Р. 542-549 .
18 . Rodríguez-Ortega M. J., GmsvikB. E., Rodríguez-Ariza A. Changes in protein expression profiles in bivalve molluscs (Chamaelea gallina) exposed to four model environmental pollutants // Proteomics 2003 Vol. 3 . Р. 1535-1543 .
19. Stadtman E. R., Levine R. L., Protein oxidation // Annu. N. Y Acad. Sci. 2000 . Vol. 97. Р. 191-207.
20 . Uchiyama M., Mihara M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test // Anal. Biochem . 1978. Vol . 86 . N 1. P. 271-278.
21. YamadaA., YoshioM., Oiwa K, Nyitray O. Catchin, a novel protein in molluscian catch muscles is produced by alternative splicing from the myosin heavy chain gene // Mol . Biol . 2000 . Vol . 295 . P. 169-178.
