CC BY
5
ПОИСК ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МИТОХОНДРИЙ В ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛАХ, ПРОИЗВОДНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Д.Б. Зоров1 2, Л.Д. Зорова1 2, С.И. Ковальчук3, В.А. Попков1' 2, В.П. Черников4, А.А. Жарикова5, А.А. Хуторненко2, С.Д. Зоров1' 5, К.С. Плохих6, Р.А. Зиновкин1, Е.А. Евтушенко7, В.А. Бабенко1, 2, И.Б. Певзнер1, 2, Ю.А. Шевцова2, 5, К.В. Горюнов2, Е.Ю. Плотников1, 2, Г.Т. Сухих2, Д.Н. Силачев1, 2
1 Институт физико-химической биологии
им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова, Москва, Россия
3 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва, Россия
4 НИИ Морфологии человека РАН, Москва, Россия,
5 Факультет Биоинженерии и Биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
6 НИЦ Курчатовский Институт, Москва, Россия
7 Биологический Факультет МГУ
им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия,
e-mail: zorov@belozersky.msu.ru
Ключевые слова: митохондрии, терапия, стволовые клетки, экстраклеточные везикулы.
С недавнего времени наряду с клеточными технологиями возникло целое направление по субклеточным технологиям, которые, в частности, в терапии ряда патологий предполагают трансплантацию митохондрий и использование экстраклеточных везикул (ЭВ), производимых стволовыми клетками.
Есть свидетельства наличия митохондриальных компонентов в ЭВ, хотя данные о том, что ЭВ содержат компетентные в энергетическом плане митохондрии отсутствуют. Это определило задачу данной работы как решение вопроса: содержат ли ЭВ, образуемые в среде культивации мезенхимальных стромальных стволовых клеток (МСК) костного мозга человека, функциональные митохондрии?
Просвечивающая электронная микроскопия позволила проследить за образованием ЭВ из МСК через почкование клеточной мембраны или путем организации пула ЭВ, собираемых внутри МСК. Были получены два препарата ЭВ через дифференциальное центрифугирование среды культивации в разных режимах, которые исследовались на предмет наличия митохондриальных компонентов и полностью функциональных митохондрий. ЭВ в обоих препаратах характеризовались сильной гетерогенностью форм, подтвержденной как просвечивающей, так и крио электронной микроскопией, и размеров, определяемых по дзета потенциалу и через анализ траекторий наночастиц.
Проточная флуориметрия с использованием двух митохондриальных красителей (MitoTracker Green, окрашивающих все митохондрии и TMRE, окрашивающих лишь энергизованные митохондрии) не позволила выявить однозначно интерпретируемый митохондриальный сигнал. Использование того же метода с применением 10-нонил акридинового оранжевого привело к доказательству его взаимодействия с ЭВ, что позволило предположить наличие кардиолипина, являющегося маркерным липидом внутренних мембран митохондрий.
С использованием праймеров на компоненты мито-хондриальной и ядерной ДНК (мДНК и яДНК соответственно) удалось не только обнаружить эти виды, нои отметить обогащение мДНК в ЭВ: если в МСК принять соотношение мДНК/яДНК=1, то в ЭВ это соотношение было около 20. Вестерн блот анализ выявил наличие в ЭВ целого ряда митохондриальных белков, однако подвижность части этих пептидов при ЭФ в ПААГ отличалась от стандартного поведения.
Анализатор кислорода SeaHorse позволил зарегистрировать потребление кислорода ЭВ при использовании субстратов комплексов I-III дыхательной цепи митохондрий. Однако скорость этого потребления не менялась при добавлении как разобщителя (СССР), так и ингибиторов цитохромоксидазы (цианида и азида), что говорит о том, что это потребление кислорода нельзя однозначно приписать дыханию.
Масс-спектрометрия выявила целый ряд митохондри-альных белков внешних и внутренних мембран, межмембранного пространства и матрикса.
Таким образом в ЭВ присутствуют митохондриальные компоненты, а функциональных митохондрий обнаружить не удалось. Поддержано грантом РНФ № 19-14-00173п.
ВЛИЯНИЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА
4 НА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ
КЛЕТКИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ
Е.С. Зубкова1, А.П. Калинин1, И.Б. Белоглазова1,
М.Ю. Меньшиков1, Е.В. Парфёнова1, 2
1 ФГБУ НМИЦК им. Е.И. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
2 ФФМ МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: cat.zubkova@gmail.com
Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки,
воспаление, митохондрии, интерлейкинз-4.
Использование мезенхимальных стволовых клеток (МСК) является одним из ведущих методов клеточной терапии, обеспечивающим прочную связь между клиническими и фундаментальными исследованиями. Одним из популярных способов повышения эффективности клеточной терапии с помощью МСК является их обработка цитокинами. Мы выявили, что у МСК, инкубировавшихся в присутствии интерлейкина 4 (ИЛ4) повышается резервная респираторная емкость, в то время как МСК, инкубировавшиеся в присутствии провоспалительных ци-токинов показали тенденцию к ее снижению. Известно, что количество митохондрий тесно связано с энергетическими потребностями клетки и может варьироваться в зависимости от многих факторов, таких как стресс и окислительно-восстановительный баланс. Мы оценили количество митохондрий на клетку с помощью окрашивания витальным флуоресцентным митохондриальным зондом — MitoTracker Red CMXRos и последующего анализа методами спектрофлуориметрии и обнаружили увеличение количества митохондрий на клетку в МСК, инкубировавшихся в присутствии ИЛ4 и тенденцию к уменьшению их числа в мСк, инкубировавшиеся в присутствии провоспалительных цитокинов, что может быть обусловлено усилением в них экспрессии факторов, ассоциированных с митофагией. Одна из функций митофа-гии — это удаление поврежденных митохондрий и таким образом предотвращение накопления митохондриаль-ных реактивных форм кислорода (АФК) и повреждения клеток [1]. Мы оценили генерацию супероксид радикала,
как основного свободного радикала кислорода, образующимся в митохондриях в результате передачи электрона по ЭТЦ, с помощью флуоресцентного зонда MitoSox Red. Однако нам не удалось выявить значимой разницы между индукторами, только в случае LPS наблюдалась тенденция к усилению генерации АФК. Также мы оценили концентрацию молочной кислоты в среде культивирования МСК, как еще один параметр метаболизма, отражающий интенсивность процессов гликолиза в клетках. Полученные данные создают предпосылку к выяснению механизмов, опосредующих влияние воспалительного окружения на свойства мезенхимальных клеток, а также к разработке подходов активного воздействия на начальные этапы репаративных процессов, связанные с контролируемой воспалительной реакцией. Кроме того, приобретает актуальность дальнейшее исследование механизмов, сопрягающих аутофагию (в данном случае — митофагию) с со свойствами клеток, участвующими в реализации их биологической функции. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 20-015-00405.
Литература: 1. Cadwell K. Nat Rev Immunol 16, 661-675 (2016).
ИЗОФОРМНЫЙ СОСТАВ МРНК А1А-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ, ИНДУЦИРУЕМЫХ ПРИ ДЕЙСТВИИ НОРАДРЕНАЛИНА НА МСК
А.М. Иванова, Р.А. Чанышев, К.Ю. Кулебякин, П.А. Тюрин-Кузьмин
Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: ivanovanastasia14@gmail.com
Ключевые слова: мезенхимные стромальные клетки (МСК), норадреналин, а7А-адренорецептор, гетерологиче-ская сенситизация.
Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК) входят в состав стромы соединительной ткани, где играют ключевую роль в ее репарации, регенерации и поддержании гомеостаза. МСК участвуют в этих процессах благодаря секреции различных паракринных факторов и способности дифференцироваться в ряд направлений. Важными компонентами стромы также являются кровеносные сосуды и нервные окончания, получая гормональные сигналы от которых МСК координируют свою активность с целым организмом [1]. Одним из ключевых регуляторов функций МСК является норадреналин. Ранее мы показали, что норадреналин регулирует функциональную активность МСК, изменяя их чувствительность к норадреналину. При стимуляции норадрена-лином сигнального пути ß-адренорецепторы/Gs-белок/ аденилатциклаза/cAMP через 6 часов происходит повышение уровня экспрессии белка а1А-адренергических рецепторов и, как следствие, повышение чувствительности клеток к этому гормону. Данный феномен был назван гетерологической сенситизацией [2].
Для выяснения механизмов повышения белка а1А-адренорецепторов мы изучили влияния данного механизма на транскрипцию гена а1А-адренорецептора, как одного из основных способов повышения белка в клетке. Для этого мы исследовали изменение уровня мРНК после стимуляции норадреналином. При использовании праймеров, таргетирующих начальный фрагмент мРНК а1А-адренорецепторов, уровень мишени не изменялся, а при использовании праймеров, таргетирующих район
мРНК, имеющийся в составе 1-4 транскрипционных вариантов, уровень матрицы снижался. Эти результаты могут свидетельствовать о том, что в процессе прохождения гетерологической сенситизации происходит изменение изоформного состава мРНК а1А-адренорецепторов в МСК. При изучении литературы мы выяснили, что с единственного гена а1А-адренорецепторов в результате альтернативного сплайсинга считывается 7 транскрипционных вариантов с различными комбинациями экзонов. Для изучения изменений уровня экспрессии различных изоформ мы подобрали праймеры, специфичные для каждого транскрипционного варианта. Путем полуколичественного ПЦР-анализа мы исследовали изменение уровеня экспрессии каждой изоформы через 1 и 3 часа после стимуляции норадреналином относительно клеток контроля. Таким образом, в процессе осуществления гетерологической сенситизации МСК происходит изменение изоформного состава мРНК а1А-адренергических рецепторов. Исследование выполнено при поддержке РНФ в рамках проекта № 21-15-00311.
Литература:
1. Н.И. Калинина, В.Ю. Сысоева и др. Acta Naturae. — 2011. —
T. 1. — C. 32-39.
2. Tyurin-Kuzmin P.A., Fadeeva J.I.. et al. Sci. Rep. — 2016. — Vol.
6, N 1. — P. 32835.
МОДЕЛЬНЫЕ НАНОКОРПУСКУЛЯРНЫЕ
НОСИТЕЛИ ДЛЯ ВНУТРИЯДЕРНОЙ ДОСТАВКИ
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Е.В. Ивановская1, В.А. Дятлов1, 2
1 Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
2 Институт тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: kivanovskaia27@gmail.com
Ключевые слова: генная терапия, нанокорпускулярные носители, аддукт, этил-2-цианакрилат, внутриклеточный транспорт, доксорубицин.
Эффективная генная терапия возможна только при использовании носителей, способных доставлять лекарственные препараты или гены внутрь клетки и ее орга-неллы на разных стадиях развития. Целью настоящей работы было изучение возможности доставки лекарственного средства внутрь ядра живых клеток на стадии их митоза.
В качестве модельного соединения использовали доксорубицин — противоопухолевый антибиотик, проникновение которого внутрь клетки легко регестрировать методом конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопии при экспериментах in vitro. Синтезированные полици-анакрилатные частицы, полученные из аддукта этил-2-цианакрилата и жирных кислот, использовали в качестве носителя. Этил-2-цианакрилатные мономеры обладают рядом уникальных свойств, главным из которых является, способность к полимеризации, в отсутствие радикальных инициаторов, с образованием полимеров, способных к биодеградации внутри организма (гидролизом и ферментативным гидролизом) [1]. Поверхность частиц была покрыта слоем полисахарида (реополиглюкина) и фос-фатидилхолина с целью обеспечения трансмембранного проникновения системы внутрь клетки.
Наилучший результат был получен при использовании нанокорпускулярных полимерных носителей малого
