CC BY
31
УДК 636.4.082.12:575.113
Ралков И.А.1, Волкова Н.А.2, Зиновьева Н.А.3, Эрнст Л.К.4
Аспирант, центр биотехнологии и молекулярной диагностики, 2доктор
биологических наук, заведующая лабораторией, Заместитель директора, член-корреспондент, доктор биологических наук; ГНУ Всероссийский НИИ животноводства РАСХН, 4академик Российской академии сельскохозяйственных наук, вице-президент Российской академии сельскохозяйственных наук.
ВЛИЯНИЕ ИНТЕГРАЦИИ ГЕНА СОМАТОЛИБЕРИНА НА КЛЕТОЧНУЮ СТРУКТУРУ НЕКОТОРЫХ ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ СВИНЕЙ В ОНТОГЕНЕЗЕ
Summary
The integration influence of the somatoliberin gene onto the cell structure of gland organs of transgenic pigs in ontogenesis was studied. It was shown, that the expression of the foreign protein affects the morphometrical parameters of liver, pancreas and thyroid gland cells as in the late prenatal, and also in the postnatal periods of development. Transgenic animals comparing to the non-transgenic analogs are characterized by the increase of the volume of the cell cytoplasm and by the dramatic differences in the nucleic acid ratio. The increase of the RNA synthesis of 10 to 31% in transgenic animal tissue cells was observed.
Ключевые слова: ген, гормон роста, трансгенные животные, соматолиберин, нуклеиновая кислота.
Keywords: gene, growth hormone, transgenic animals, somatoliberin, nucleic acid.
Изучено влияние интеграции гена соматолиберина на клеточную структуру железистых органов трансгенных свиней в онтогенезе. Установлено, что экспрессия чужеродного белка влияет на морфометрические показатели клеток печени, поджелудочной и щитовидной желез как в поздний плодный, так и в постнатальный периоды развития. У трансгенных животных по сравнению с аналогами отмечается увеличение размеров цитоплазмы клеток и существенно изменяется соотношение нуклеиновых кислот в них. В клетках опытных образцов тканей наблюдается повышение синтеза РНК в среднем на 10-31%.
Создание генетически модифицированных (трансгенных) животных открывает новые пути решения ряда прикладных задач в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве. В последнем случае искусственное конструирование генома позволяет получать животных с заданными хозяйственно-ценными признаками в значительно более короткие сроки, чем при использовании традиционных методов селекции и дает возможность создания новых генетических вариантов, не существующих в животном мире и не поддающихся селекции (например, животные, синтезирующие в молочной железе рекомбинантные белки человека или устойчивые к инфекционным заболеваниям).
С практической точки зрения для животноводства несомненный интерес представляют гены, кодирующие белки каскада гормона роста. На сегодняшний день уже получены модифицированные по данным генам кролики, свиньи, овцы [4,680-683]. Предполагается, что дополнительный синтез в организме животных белков соматотропного ряда будет положительно влиять на скорость роста. При этом одним из подходов, позволяющих оценить данное влияние, является характеристика морфо-функциональных особенностей клеток и органов трансгенных животных как показателя, характеризующегося относительной физиологической устойчивостью и отражающего основные характеристики организма.
Материалы и методы
Исследования проводили на свиньях, трансгенных по гену соматолиберина человека (релизинг-фактора гормона роста) под контролем металлотионеинового промотора мыши. Объектом исследований служили эмбрионы и взрослые животные. Эмбрионы свиней были получены после осеменения свиноматок семенем трансгенных хряков. Извлечение плодов осуществляли на 35, 45 и 90 день эмбрионального развития. Трансгенность полученных эмбрионов свиней определяли методом ПЦР-анализа, на основании данных которого формировали опытную и контрольную группы. На эмбриональном материале, а также на материале, полученном от взрослых животных, исследовали структурно-функциональные особенности железистых органов, в частности, печени, поджелудочной и щитовидной желез.
Выделение ДНК из образцов ушной раковины эмбрионов осуществляли с применением перхлората натрия [1,47]. ПИР проводили в объёме 20 мкл., применяя следующую инкубационную смесь: х10 буфер для ПЦР (166,7мМ (КН4^04; 100мМ Трис-НС1, рН=8,3; 1,5мМ MgCl2; 0,1% Tween 20); 0,2мМ dNTP, 25 пкмол каждого из праймеров, 1 ЕД Taq-полимеразы. ДНК для анализа брали в объёме 1,0 мкл.
Гистологические препараты исследуемых органов готовили по общепринятой методике. Для исследования нуклеиновых кислот в тканях использовали фиксатор Карнуа (абсолютный спирт : хлороформ : ледяная уксусная кислота в соотношении 6:3:1). Окраску тканей на ДНК осуществляли по Фёльгену. Суммарные нуклеиновые кислоты (РНК+ДНК) окрашивали галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсену [2,544]. Расчет относительного содержания ДНК проводили по следующей формуле: с=100(1/Ь^, где с -относительное содержание ДНК на ядро клетки, Ь - средняя яркость Шифф-положительного ядра клетки, S - его площадь. По аналогичной формуле рассчитывали и относительное содержание в клетке галлоцианин-окрашенных суммарных нуклеиновых кислот. Отдельно содержание РНК определяли как разность между относительным содержанием суммарных нуклеиновых кислот и ДНК.
Результаты и обсуждение
Гистологический анализ железистых органов трансгенных и контрольных свиней выявил изменения морфометрических показателей в опытных образцах тканей. Влияние экспрессии чужеродного гена на структуру органов было установлено как в эмбриональный, так и постнатальный периоды развития. При этом изучение гистоструктуры железистых органов 35, 45 и 90-дневных эмбрионов показало наличие определённых изменений в исследуемых органах только в поздний плодный период. У 35 и 45-дневных эмбрионов различия между трансгенными и нетрансгенными плодами по данному показателю были незначительными.
Оценивая влияние интеграции гена соматолиберина человека на структурно-функциональные особенности железистых органов свиней в целом, следует отметить, что наиболее значительные структурные изменения наблюдались в печени (табл. 1). У трансгенных животных по сравнению с контролем гепатоциты характеризовались более развитым слоем цитоплазмы, что сказывалось на показателе ядерно-цитоплазматического отношения. У трансгенных животных данный показатель был на 14,2-15,8% ниже, чем у контрольных. При этом между контрольной и опытной группами не было установлено существенной разницы по толщине балок. Трансгенные животные лишь незначительно (на 3,6%) превосходили по этому показателю своих аналогов.
Таблица 1
Морфометрические показатели органов трансгенных свиней и их аналогов
Группа Печень Поджелудочная железа Щитовидная железа
толщина балок, ц Я/Ц* диаметр ацинуса, ц Я/Ц Диаметр фолликулов ц Я/Ц
Эмбрионы
45-дневные:
опыт (п=5); 10,8±0,1811 0,34 - - 34,5±1,2 0,56
контроль (п=6); ,1±0,07 0,34 - - 33,6±1,4 0,54
разница к контролю, % - 2,7 0 - 1,1 -1,9
90-дневные:
опыт (п=6); 8,6±0,16 0,48 33,9±1,12 0,50 40,4±2,1 0,56
контроль (п=6); 8,7±0,17 0,56 37,8±0,65 0,58 39,3±1,3 0,59
разница к контролю, % - 1,1 -14,2 - 10,3 -14 + 2,8 - 5
Взрослые животные
опыт (п=5); 23,1±0,75 0,16 37,0±0,54 0,20 196±5,06 0,31
контроль (п=6); 22,3±0,30 0,19 40,2±0,72 0,21 152±4,02 0,41
разница к контролю, % + 3,6 -15,8 - 8,0 -4,8 + 28,9 -24
Примечание: Я/Ц - ядерно-цитоплазматическое отношение.
В поджелудочной железе у взрослых животных по сравнению с плодами наблюдалось резкое увеличение ацинарных клеток за счёт роста цитоплазматического слоя. При этом наиболее существенные различия по диаметру ацинусов были установлены у 90-дневных плодов. В данном случае у трансгенных эмбрионов диаметр ацинусов был на 10,3% ниже по сравнению с контролем. У взрослых животных данный показатель составил 8% в пользу нетрансгенных животных.
В щитовидной железе также отмечалось резкое увеличение размеров фолликулов в постнатальный период. При этом трансгенные животные превосходили своих аналогов по данному показателю на 28,9-31,6%, что свидетельствовало об интенсивном накоплении коллоидного содержимого в фолликулах и замедлении сброса его в кровяное русло.
Изучение характера накопления нуклеиновых кислот в клетках железистых органов показало, что этот признак является весьма чувствительным к внешним воздействиям на организм (табл. 2).
Таблица 2
Относительное содержание нуклеиновых кислот в органах трансгенных и _контрольных свиней__
НК Печень Поджел. железа Щитовидная железа
опыт контроль опыт контроль опыт контроль
Эмбрионы (35 дней)
ДНК 15,2±0.36 15,1±0.30 - - - -
РНК 41,9±0.66 42,0 ±0.67 - - - -
РНК/ ДНК 2,76 2,78
Эмбрионы (45 дней)
ДНК 17,6±0,37 17,7±0,34 - - 13,5±0,84 13,3±0,70
РНК 31,1±0,67 31,0±0,86 - -
РНК/ ДНК 1,76 1,77
Эмбрионы (9С дней)
ДНК 18,3±0,30 20,8±0,36 14,6±0,35 15,7±0,32 18,6±0,66 18,7±0,37
РНК 31,5±0,71 28,6±0,68 12,9±0,46 11,9±0,23 11,8±0,54 11,4±0,27
РНК/ ДНК 1,73 1,38 0,89 0,76 0,63 0,61
Взрослые свиньи
ДНК 15,9±0,37 16,7±0,54 12,6±0,21 11,0±0,19 12,7±0,17 11,8±0,18
РНК 47,3±1,02 41,2±0,84 38,0±0,64 32,2±0,59 16,8±0,33 13,0±0,31
РНК/ ДНК 2,97 2,46 3,02 2,94 1,33 1,10
На ранних стадиях эмбриогенеза, когда ещё не сформирована архитектоника печёночной паренхимы в клетках этого органа отмечается незначительное содержание ДНК и наблюдается интенсивный синтез РНК, что свидетельствует об интенсивной кроветворной функции, которая является основной в данный период эмбриогенеза. На более поздних стадиях развития эмбриона кроветворная функция печени сменяется пищеварительной. В данный период отмечается снижение интенсивности синтеза РНК и повышение содержания ДНК в клетках. У 45 и 90-дневных плодов гепатоциты по сравнению с аналогичными показателями 35-дневных эмбрионов характеризуются более низким отношением РНК/ДНК. Это объясняется пролиферацией гепатоцитов и специализацией ткани. При этом отмечается тенденция некоторого снижения данного показателя у трансгенных эмбрионов по сравнению с контрольными. Возможно, здесь играют роль разные сроки специализации, которые у трансгенных животных задерживаются вследствие активной пролиферации ткани.
В постнатальный период развития в клетках печени вновь отмечается повышение отношения РНК/ДНК, что свидетельствует об окончании дифференцировки клеток и активном функционировании ткани. При этом более высокий показатель отношения РНК/ДНК наблюдался в опытных образцах ткани. Более интенсивный синтез РНК в гепатоцитах был установлен у свиней в постнатальный период развития.
Аналогичная тенденция по синтезу нуклеиновых кислот отмечалась и в клетках поджелудочной и щитовидной желез.
Таким образом, экспрессия соматолиберина в организме трансгенных свиней вызывает определённые изменения в гистологическом строении и функциональной активности железистых органов. У трансгенных животных по сравнению с аналогами отмечается увеличение размеров цитоплазмы клеток и существенно изменяется соотношение нуклеиновых кислот в них. В клетках опытных образцов тканей на фоне снижения ДНК наблюдается значительное повышение синтеза РНК, что характеризует высокий уровень анаболических процессов у трансгенных животных.
Литература
1. Зиновьева Н. А., Попов А. Н., Эрнст Л. К. и др. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы, 1998, 47 с.
2. Микроскопическая техника: Руководство / Под ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова. М.: Медицина, 1996. 544 с.
3. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Кадулин С.Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца // Биотехнология . 1993. V.5. C.2-14.
4. Hammer R.E., Pursel V.G., Rexroad Jr. et al. Production of transgenic rabbit, sheep and pigs by microinjection // Nature. 1985. V.315. P.680-683.
5. Murray J.D., Nancarrow C.D., Marshall J.T. et al. Production of transgenic merino sheep by microinjection of metallotionein bovine growing hormone fusion genes // J. Reprod. Fertil. Dev. 1989. V.1. P.147-155.
6. Pursel V., Cambell R., Miller K. et al. Growth potential of transgenic pigs expressing a bovine growth hormone gene // J. Anim. Sci. 1988. V.66. P.267.
7. Pursel V.G., Pinkert C.A., Miller K.F.et al. Genetic engineering of livestock // Science. 1989. Vol. 244, S. 1281 - 1288.
8. Rexroad C.E., Hammer R.E., Behringer R.R. et al. Insertion, expression and physiology of growth-regulating genes // J. Reprod. Fert. Suppl. 1990. V.41. P. 119-124.
9. Wieghart M., Hoover J.L, McGrane M.M. et al. Production of transgenic pigs harbouring a rat phosphoenolpyruvate carboxykinase-bovine growth hormone fusion gene. Journal of Reproduction and Fertility. 1990. Vol. 41. Suppl. S. 89 - 96.
