CC BY
120
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 616-006.448:576.385.5:577.175.722
C.C. Шушанов, Т.А. Кравцова, Ю.Б. Черных
ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНОПОДОБНОГО ФАКТОРА РОСТА 1 ТИПА (IGF-1) НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ КЛЕТОК МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА
ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация
Шушанов Cаин Сакенович, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза
адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(962)939-82-55 e-mail: sainHershv@vandex.ru
Статья поступила 18.03.2013, принята к печати 09.07.2013
Резюме
В работе было исследовано влияние экзогенного инсулиноподобного фактора роста 1 типа на выживаемость и рост трех линий клеток множественной миеломы человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9. В указанных линиях клеток также была исследована роль IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов, участвующих в апоп-тозе. Данные, полученные методом МТТ-теста, подсчета и исследования кривых выживаемости клеток показали, что IGF-1 усиливает выживаемость и рост клеток RPMI1640 и IM-9, и не влияет на выживаемость и рост клеток RPMI8226. В ходе исследований, с использованием метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, было установлено, что экспрессия мРНК генов: Bcl-2, Mcl-1 и HIAP-1 является IGF-1/IGF-1R зависимой, в то время как экспрессия мРНК генов Bcl-xL, HIAP-2, NAIP, CycB1, CycD1 не зависит от активации IGF-1/IGF-1R сигнального пути.
Ключевые слова: инсулиноподобный фактор роста 1-го типа (IGF-1), выживаемость, экспрессия мРНК, множественная миелома.
S.S. Shushanov, T.A. Kravcova, U.B. Chernych
EFFECT OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR TYPE-1 (IGF-1) ON MULTIPLE MYELOMA CELL SURVIVAL
FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
In this paper investigated the effect of exogenous insulin-like growth factor type -1 on the survival and growth of three cell lines of human multiple myeloma (MM): RPMI1640, RPMI8226 and IM9. In these cell lines was also investigated the role of IGF-1 in the regulation of mRNA expression of genes involved in apoptosis. The data obtained by the MTT-test, counting and cell survival curves studies have shown that IGF-1 enhances the survival and growth of RPMI1640 and IM-9 cells, and has no effect on the survival and growth of RPMI8226 cells. It was found, using RT-PCR, that the mRNA expression of genes: Bcl-2, Mcl-1 and HIAP-1 is IGF-1/IGF-1R dependent, while the mRNA expression of Bcl-xL , HIAP-2, NAIP, CycB1, CycD1 independent of IGF-1/IGF-1R activation pathway.
Key words: multiple myeloma, insulin-like growth factor type-1 (IGF-1), survival, mRNA expression.
Введение
Множественная миелома - злокачественное лимфопролиферативное заболевание, характеризующееся инфильтрацией костного мозга плазматическими клетками, наличием моноклонального иммуноглобулина в сыворотке крови и/или моче и остеолитическими поражениями костей [1]. В соответствии с классификацией ВОЗ ММ относится к периферическим В-клеточным лимфоидным опухолям [14]. ММ составляет 1% от всех онкологических заболеваний и 13% от всех гемобластозов (неопластических заболеваний кроветворной и лимфатической ткани) [23]. Причины развития ММ у человека остаются неясными. Одним из злокачественных свойств клеток ММ является их способность мигрировать и локализоваться в костном мозге [1; 2]. В микроокружении костного мозга клетки ММ взаимодействуют с клетками стромы
костного мозга и активирует в них транскрипцию и секрецию различных цитокинов и факторов роста: 1Ь-6 (интерлейкин-6), УБвР (фактор роста эндотелия сосудов), ТОТа (фактор некроза опухоли альфа), ТвБр (трансформирующий фактор роста бета), ЖР-1а (фактор стромальных клеток 1а), ЮР-1 (инсулиноподобный фактор роста 1 типа) и другие цитокины и факторы роста [12; 30]. Воздействие этих факторов на миеломные клетки может придать им более агрессивные свойства - усилить пролиферацию, выживаемость, миграцию, а также может активировать механизмы возникновения лекарственной устойчивости и активировать разрушения кости. Поэтому исследование роли цитокинов и факторов роста в злокачественной прогрессии ММ является на сегодня одним из актуальных направлений в экспериментальной онкологии и этому посвящено немало работ. Среди публикаций имеется работа, в которой исследовалось влияние на выжи-
30 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНОПОДОБНОГО ФАКТОРА...
ваемость CD45+ и CD45- миеломных клеток комбина- Оценка выживаемости клеток ММ ции нескольких факторов роста: IL-6, IGF-1, HGF колориметрическим методом (МТТ) (фактор роста гепатоцитов), HB-EGF (эпидермаль- Метод основан на способности митохондри-ный фактор роста, связывающий гепарин), APRIL альных дегидрогеназ живых клеток превращать (лиганд, индуцирующий пролиферацию). В этой «желтый» МТТ 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-работе было показано, что одним из важных факто- дифенилтетразолия бромид в «синий» формазан. ров выживания для клеток ММ является IGF-1 [30]. Клетки засевали в 96-луночные планешты по 2 х 104 IGF-1 оказывает свой биологический эффект клеток на лунку в 150 мкл среды без сыворотки и без через связывание и активацию его рецептора IGF- IGF-1 (контроль) или без сыворотки, но содержащей 1R, который является рецепторной тирозин киназой, IGF-1 в концентрации 20 нг/мл. На каждую линию гетеротетрамером, состоящим из двух внеклеточных клеток для эксперимента в присутствии IGF-1 и от-а-субъединиц, связывающихся с IGF-1, и двух внут- сутствии (контроль) использовали не менее трех риклеточных р-субъединиц, содержащих тирозин лунок. Эксперимент повторялся не менее трех раз. киназный домен. Связывание IGF-1 с IGF-1R приво- Далее, клетки инкубировали в течение 72 ч в атмо-дит к активации внутренней тирозин киназы IGF-1R сфере с 5% СО2. Через 72 ч в лунки 3-(4,5-и последующему аутофосфорилированию тирозинов диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид внутриклеточной р-субъединицы, включая около- в объеме 25 мкл на 2-3 ч (срок инкубации зависит от мембранный тирозин в положении 950 [25]. Этот метаболической активности митохондрий исполь-тирозин служит сайтом связывания для субстратов зуемых клеток). Исходная концентрация вещества 5 IGF-1R, которые после связывания и последующего мг/мл. Удаляли среду и добавляли 60 мкл диметил-фосфорилирования, инициируют передачу сигналов сульфоксида (ДМСО) на лунку. Для гомогенного от IGF-1R внутрь клетки посредством активирова- распределения красителя качали на шейкере в течения целого ряда нижележащих эффекторов [11]. Ус- ние 3 мин при 300 об/ мин. Анализ проводили на тановлено, что в микроокружении костного мозга цитофотометре «Унискан» (Фирма «Пикон», Россия) клетки ММ при взаимодействии с эндотелием кро- при фильтре 595 нм. Жизнеспособность клеток при веносных сосудов экспрессируют на своей поверх- действии IGF-1 оценивалась сопоставлением опти-ности IGF-1R [19]. ческой плотности в экспериментальных лунках с Увеличение количества IGF-1R на поверхно- оптической плотностью в контрольных лунках. На сти клеток ММ приводит к большему числу IGF- основании полученных при сканировании данных 1/IGF-1R взаимодействий и последующей актива- строились графики, с учетом отклонения от средних ции нижележащих сигнальных путей в клетке, ко- значений. Для исследования влияния IGF-1 на вы-торые могут усилить злокачественные свойства живаемость клеток ММ ставили не менее трех неза-миеломных клеток - пролиферацию, миграцию, висимых экспериментов. выживаемость. Известно, что в злокачественной прогрессии Подсчет клеток миеломных клеток участвуют гены семейства Bcl-2 Мы исследовали влияние IGF-1 на выживае-и гены семейства ингибиторов апоптоза IAP. Пока- мость клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226, зано, что высокий уровень экспрессии некоторых IM9 методом подсчета. В эксперименте указанные генов из этих семейств ассоциируется с малигнизи- клетки были посажены в количестве 1,5х106 клеток рованным фенотипом миеломных клеток [29], с их на чашку и культивировались в среде без сыворот-лекарственной устойчивостью к доксорубицину, ки в течение 72 ч в присутствии и отсутствии IGF-1 дексаметазону и этопозиду [10; 33; 34], а также с в концентрации 20 нг/мл (также как и в случае ис-увеличением их выживаемости [4]. Исследования пользования МТТ-метода). Через 72 ч подсчитыва-показали, что в регуляции экспрессии генов семей- ли среднее количество клеток (из трех чашек на ства Bcl-2 и IAP может участвовать IGF-1/IGF-1R- культуру) каждой культуры и сравнивали получен-опосредуемый сигнальный путь. Однако имеющие- ные результаты. ся в литературе данные являются противоречивыми, и исследования в этом направлении в настоя- Исследования кривой выживаемости щем продолжаются. Мы исследовали влияние фактора роста IGF- В своей работе мы исследовали роль экзо- 1 на кривую выживаемости культур клеток генного IGF-1 в выживании трех линий клеток ММ RPMI1640, RPMI8226, IM9. Клетки указанных человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9, а также ис- культур были посажены в количестве 7х104 клеток следовали роль IGF-1/IGF-1R-опосредуемой регу- на лунку в 1мл среды без сыворотки в присутствии ляции экспрессии мРНК генов, участвующих в и отсутствии IGF-1 в концентрации 20 нг/мл, и их апоптозе: Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1,HIAP-1, HIAP-2, sur- количество подсчитывали через каждые 24 ч в те-vivin, NAIP. чение 96 ч. Затем по полученным после подсчета средним (из 6 лунок на культуру) результатам Материалы и методы строили кривые выживаемости. Линии клеток множественной миеломы Выделение РНК из клеток ММ В работе использованы три типа суспензи- и полимеразная цепная реакция онных линий клеток множественной миеломы че- с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) ловека, экспрессирующих на своей поверхности Для исследования экспрессии генов к осадку указанные в скобках маркеры дифференцировки: клеток добавляли 1 мл тризола (Trizol, "Sigma", RPMI1640 (CD138+, CD, CD45-, CD56±, CD19-), США). Процедуру выделения РНК проводили со-RPMI8226 (CD138+, CD38+, CD45-, CD56±, CD19-), IM9 гласно стандартному протоколу. Электрофорез вы-(CD138+, CD38-, CD45+, CD56-, CDî9+) [16]. Происхож- деленной РНК проводили в 1 %-ном агарозном геле дение указанных линий клеток: человек, костный при напряжении 100 В в течение 30-40 мин. Каче-мозг, миелома. Способ культивирования: суспензи- ство выделенной РНК оценивали по наличию полос онный в среде RPMI-1640 с 10%-ной ТЭС при 37 рибосомальной РНК. Концентрацию РНК опреде-°C, 5% CO2. ляли по оптическому поглощению при X 260 нм.
№ 3/том 12/2013 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
Экспрессию мРНК исследуемых генов определяли полуколичественным методом ОТ-ПЦР. Реакционная смесь для синтеза кДНК содержала 2 мкг тотальной клеточной РНК, 4 мкл «случайных» прай-меров (гексануклеотиды) (фирма «Литех», Россия), 1 мкл 25мМ смеси dNTP («MbI Fermentas», Литва), 24 ед. ингибитора РНКаз («MBI Fermentas»), 100 ед. обратной транскриптазы M-MuLV («MBI Fermentas»). Объем смеси составлял 25 мкл. Синтез кДНК с матрицы РНК проводили на амплификаторе «Тер-цик» («ДНК-технология», Россия) со следующими параметрами: обратная транскрипция - 42 °С, 50 мин; денатурация - 94 °С, 5 сек. Для наработки продуктов ПЦР составляли реакционную смесь, содержащую: 1 мкл раствора кДНК; 20 пкмоль каждого из праймеров; 1 мкл 25мМ смеси dNTP («MBI Fermentas»); 2,5 мкл 10-кратного буфера с (NH4)2SO4 («MBI Fermentas»), 25 мМ MgCl2; 1 ед. Taq-ДНК полимеразы; Н2О до конечного объема 25 мкл; минерального масла - 30 мкл. Нуклеотидные последовательности использованных специфических прай-меров приведены в табл. Реакцию амплификации проводили на амплификаторе «Терцик» по следующей схеме: денатурация - 94 °С, 10 сек; аннилинг -Tm, 10 сек; синтез - 72 °С, 20 сек значения температуры Tm и количество циклов ПЦР для каждого из генов приведены в таблице. В качестве внутреннего контроля для оценки количества взятой в реакцию РНК определяли экспрессию GAPDH. Продукты реакции ОТ-ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2 %-ном агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Размеры фрагментов оценивали в соответствии с расположением полос маркерной ДНК, гель фотографировали при ультрафиолетовом возбуждении с помощью цифровой камеры «Samsung CCTV LENZ».
Статистическая обработка данных
Статистическая обработка полученных данных была выполнена с помощью компьютерной программы GraphPad Prizm 5, 2008 год. Достоверность различий определялась с использованием непараметрического статистического критерия t-тest, различия считались достоверными при р < 0,05.
Результаты
Исследование экспрессии мРНК генов
системы IGF/инсулин (IGF-1A, IGF-1B,
IGF-2, IGF-1R, IR-A, IR-B)
в трех линиях клеток ММ человека
IGF-1 и его рецептор IGF-1R принадлежат системе IGF/инсулин, которая также включает: инсулин, инсулиноподобный фактор роста IGF-2, шесть типов IGF-связывающих и регулирующих белков (IGFBP) и их протеаз, а также различные изоформы и комбинации их общих рецепторов: IGF-1R, IR-A, IR-B (А и В изоформы рецептора инсулина), IGF-1R/IR-A, IGF-1R/IR-B (гибридные рецепторы). Активация перечисленных рецепторов опосредует сигналы, играющие различные роли в физиологии клетки, такие как: развитие, рост, диф-ференцировка, регуляция метаболизма, подвижность, опухолеродность чувствительность к апоп-тозу, ангиогенез, экспрессия молекул адгезии [2]. IGF-1 может связываться и активировать рецептор IR-A [18; 24], а также гибридный рецептор IGF-1R/IR-A [13; 14]. Со всеми указанными рецепторами: IR-A, IR-B и IGF-1R также может связывается IGF-2 [9; 37], который является высоко гомологичным IGF-1 [38]. В литературе описаны две изофор-
мы мРНК IGF-1 (IGF-1A и IGF-1B), которые образуются в результате альтернативного сплайсинга, при этом обе они сохраняют нуклеотидные последовательности, кодирующие полноразмерный пептид IGF-1, а С-концевые нуклеотидные последовательности этих двух изоформ кодируют два различных пептида, EA и EB. Функциональные значения изоформ мРНК IGF-1A и IGF-1B до конца неизвестны и в настоящее время исследуются.
Установлено, что про-IGF-1А пептид выделяется из клетки в межклеточное пространство, а про-IGF-lB пептид является активной внутриклеточной изоформой и обнаруживается в ядре клетки и, по-видимому, имеет регуляторную функцию [35]. Предполагается, что количественное соотношение этих изоформ может являться одним из факторов, определяющих дальнейшую судьбу клетки, т. е. в случае преобладания одной изоформы клетка будет пролиферировать, а другой - дифференцироваться [6].
В первой части исследования мы охарактеризовали экспрессию мРНК генов системы IGF/инсулин: IGF-1A, IGF-1B, IGF-2, IGF-1R, IR-A, IR-B - в трех линиях культур клеток ММ человека, RPMI1640, RPMI8226, IM-9 (рис. 1).
Экспрессия двух изоформ мРНК IGF-1A и IGF-1B выявлялась во всех трех линиях клеток ММ. Причем, в линиях клеток RPMI8226 и IM9 экспрессия мРНК этих изоформ была примерно одинаковой и выраженной, а в линии клеток RPMI1640 - очень слабой (рис. 1).
На сегодня в литературе нет работ, посвященных исследованию двух изоформ мРНК IGF-1 в миеломных клетках. Недавно в аспиратах костного мозга, полученных от больных ММ, нами была исследована экспрессия изоформ мРНК IGF-1A и IGF-1B.
Экспрессии изоформ мРНК IGF-1A и IGF-1B были выявлены у 63 % больных ММ. При сравнении случаев, когда обе эти изоформы присутствовали или отсутствовали в одних и тех же образцах, оказалось, что у 80 % больных изоформы мРНК IGF-1A и IGF-1B, как правило, коэкспресси-руются [3]. Таким образом, коэкспрессия in vivo и in vitro двух изоформ мРНК IGF-1 является характерной особенностью миеломных клеток.
Экспрессия мРНК гена IGF-2 была выраженной только в линии клеток RPMI8226, а в двух других линиях клеток - RPMI1640 и IM9 - ее экспрессия была чрезвычайно слабой, практически на уровне чувствительности, используемом для определения количества мРНК методом ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК IGF-1R была выраженной во всех трех линиях клеток ММ.
Уровень экспрессии мРНК IR-A был высоким в линиях клеток RPMI1640 и RPMI8226, а в линии клеток IM9 - слабым. мРНК IR-B не выявлялась ни в одной из трех линий клеток ММ. Таким образом, во всех трех линиях клеток ММ была выявлена экспрессия мРНК только А-изоформы рецептора инсулина (IR-A), тогда как B-изоформа (IR-B) не экспрессировалась. Полученные нами данные по экспрессии мРНК IR-A и IR-B in vitro в клетках ММ полностью совпадают с нашими данными полученными ранее, в которых мы показали, что в образцах от больных ММ, преимущественно экспрессируется мРНК IR-A [28].
Таким образом, наши исследования показали, что в трех линиях клеток ММ экспрессия мРНК генов, принадлежащих системе IGF/инсу-лин, отличается.
Таблица
Нуклеотидные последовательности специфичных праймеров к генам, размер продукта, температура отжига праймеров и количество циклов, используемых в ПЦР
Ген Название прайм ера Нуклеоти дная п о следов ательн о стъ Размер продукта. пары оснований Темп-ра отжига праймера
IRA IRA-F IRA-R 5 "-А А С С A G A GTGAGTATG A G GAT-3 " 5т -С С GTTC С A G A G С G A A GTGCTT-3 ' бООп.о. 60°С
IRE IRB-F IRB-R 5 '-А А С С A G A GTGAGTATG A G GAT-3 ' 5 ' -С С GTTC С A G A G С G A AGTGCTT-3 ' бЗбп.о. 60°С
IGF-1A IGF-1A-F IGF-1A-R 5 ' -G G А С С G G A GA С GCTCTGC GG-3 ° 5 ' -TCTA CTTGC GTTCTTC A A AT -3' 284 п.о. 60"С
IGF-1B IGF-1B-F IGF-1B-R 5'-GGACCGGAGACGCTCTGCGG-3° 5'-TTTGCCTCTGCATTCAGCAT-3' 431 п.о. 60°С
IGF-IR IGF-IR-F IGF-IR-R 5 ' -ATTG A GGAGGTCA С A G A GA AC -3 ' 5 ' -TTC ATATC CTGTTTTGGC CTG-3 ' 755п.о. 67°С
IGF-2 IGF-2-F IGF-2-R 5 ' -A GTC G ATGCTGGTGCTTCTC A-3 ' 5 ' -GTGGGC G G G GTCTTGGGTGGGTAG-3 ' 48бп.о. 60° С
Bd-2 Bd-2-F Bd-2-R 5T-CGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAG-3' 5T -ACTTGTGGC С С A GATA GGCACCCAG-3' 389 п.о. 61°С
Md-1 Md-l-R Md-l-R 5 ' -С A С G A G A С G GC CTTC С A A G GC ATGCT-3 ' 5 ' -CTAGGTTG CTAGGGTGCAA CTCTAG G A-3 ' 497 п.о. 60° С
Bd-xL Bd-xL-F Bd-sL-R 5'-TTGGACAATGGACTGGTTGA-3' 5 ' -TGGGATGTC A GGTC A CTG A A -3 ' 371 п.о. 54°С
HIAP-1 HIAP-l-F HIAP-l-R 5 ' -GC CTGATGCTGG ATA A CTGG-3 ' 5 ' -GGC G A С A G AA AA GTC AATGG-3 ' 349 п.о. 60° С
HIAP-2 HIAP-2-F HIAP-2-R 5'-GCCTGATGCTGGATAA CTGG-3' 5 ' -GCTCTTG С С A ATTCTG ATG G -3 ' 361п.о. 60° С
NAIP NAIP-F NAIP-R 5'-TTATACCAGCGCCAGTrTCC-3' 5 ' -GGTGG A A СТА A G G GA g AG G-3 ' 299п.о. 60° С
Surv Sinv-F Sinv -R 5T -CTTG A A A GTG G С A С С A G AG G- 3 ' 5T -TG С A G CTC A G АТГС A A С A GG-3 ' 290п.о. 60° С
Livin Livin -F 1,1 Y in R 5 ' -CTG GTC A G A G С С AGTGTTC С -3 ' 5'-TCATAGAAGGAGGCCAGACG-3' 311 п.о. 60° С
CycBl CycBl-F CycBl-R 5 ' -TTGGGG A С ATTG GTAACAAAGTC-3' 5 ' -ATA GGCTCAGGC G A AA GTTTTT-3 ' 204п.о. 64°С
CycDl CycDl-F CycDl-R 5 ' -GCTGG A G С С С GTG A AA AA GA -3 ' 5'-CTCCGCCTCTGGCAnTTG-3' 228 п.о. 63°С
GAPDH GAPDH-F GAPDH-R 5 ' -С С С CTG G С С A A G GTC АТС С ATG A С A ACTTT-3 ' 5 ' -G G С С ATG A GGTC С A С С AC CCTGTTGCTGTA-3 ' 513п.о. 60°С
Учитывая присутствие или отсутствие коэкспрес-сии лигандов и их рецепторов, принадлежащих системе IGF/инсулин, можно полагать, что в линии клеток IM9 экспрессируются мРНК IGF-1, IGF-1R, IRA, и возможно, что активными являются сигнальные пути, активируемые тремя лиганд-рецепторными аутокринными взаимодействиями: IGF-1/IGF-1R, IGF- 1/IGF- 1R/IRA, IGF-1/IRA (рис. 1). В клетках RPMI1640 вследствие очень слабой экспрессии мРНК IGF-1 и чрезвычайно низкой экспрессии мРНК IGF-2 (рис. 1) не исключено, что слабо активируются все внутриклеточные сигнальные пути, активируемые при любой возможной комбинации аутокринного взаимодействия лиган-дов и рецепторов системы IGF/инсулин.
Линия клеток RPMI8226 отличается от двух других исследованных линий клеток RPMI1640 и IM9 по экспрессии мРНК генов системы IGF/инсулин. Эта линия характеризуется выраженной экспрессией, и мРНК IGF-1, и мРНК IGF-2, и всех их рецепторов, и поэтому в линии клеток RPMI8226, возможно, активны сигнальные пути, активируемые пятью лиганд-рецепторными ауток-ринными взаимодействиями: IGF-1/IGF-1R, IGF-1/IRA, IGF-1/IGF-1R/IRA, IGF-2/IGF-1R и IGF-2/IRA (рис. 1). В связи с этим не исключено, что воздействие IGF-1 на клетки RPMI8226 может по-другому повлиять на их выживаемость и пролиферацию, чем на выживаемость и пролиферацию клеток RPMI1640 и IM9.
RPMI164Û RPMI 8226 IM9
Гп wm
IGF-IA
H m m
■■■ n
ц H H IGF-1B
щ g IGF-2
I(jÎ-1R
ЯН я
Ы
s s IRA
H в Э GAPDH
mm
Рис. 1. Экспрессия мРНК генов системы IGF/инсу-лин в линиях клеток ММ человека (полуколичественный ОТ-ПЦР).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНОПОДОБНОГО ФАКТОРА... 1 33
Исследование влияния фактора роста ЮЕ-1 на выживаемость клеток линий ММ человека методом МТТ Выживаемость клеток ММ человека исследовали методом МТТ (см. раздел Материалы и методы). Клетки культивировали в течение 72 ч в бессывороточной среде в присутствии и в отсутствие ЮР-1 в концентрации 20 нг/мл. Последняя является физиологической, и в этом случае ЮР-1 активирует только ЮР-1Я и не активирует ГЯ-А. В таких условиях, с одной стороны исключены все факторы роста, присутствующие в сыворотке, которые могли бы кооперировать с ЮР-1 и тем самым оказывать дополнительное влияние на выживаемость клеток ММ. С другой стороны, физиологические концентрации ЮР-1 позволяют определять биологические эффекты, которые являлись бы следствием активации только ЮР-1/ЮР-1Я-опосредуемой сигнальной трансдукции. В результате исследования мы выявили, что ЮР-1 повышал выживаемость клеток ЯРМ11640 (р<0,05; рис. 2 А) и ГМ9 (р<0,0001; рис. 2Б), и не влиял на выживаемость клеток ЯРМ18226 (рис. 2В).
А
КРМ11640
0.120
■ |ЙР-1
1М9
0.1« од» о.:оо о.ои 0,000
В
1*РМ 18226
Рис. 2. Выживаемость клеток ЯРМ11640, ГМ9 и ЯРМ18226 в среде без ТЭС в присутствии и отсутствие ЮР-1 (Мтт-тест):
*р < 0,05; ***р < 0,001 - достоверность различия.
Несмотря на то, что иммунофенотип (экспрессия маркеров дифференцировки) клеток ЯрМГ1640 (СБ138+, СБ38+, СБ45-, СБ56±, СБ19-) и клеток ЯРМГ8226 (СБ138+, СБ38+, СБ45-, СБ56±, СБ19-) является одинаковым, и эти клети морфологически выглядят очень похожими, оказалось, что они по-разному отвечают на воздействие ЮР-1 (рис. 2А-В). Возможно, что одним из решающих факторов такого различия в выживаемости исследуемых линий клеток ММ является различие в экспрессии генов системы ЮР/инсулин. Линия клеток ЯРМГ8226 отличается от двух других исследованных линий клеток ЯРМГ1640 и ГМ9 по экспрессии мРНК генов системы ЮР/инсулин. В клетках ЯРМГ8226 наблюдается выраженная экспрессия ЮР-1 и ЮР-2 и всех их рецепторов, что, возможно, позволяет аутокринным образом регулировать выживание и пролиферацию этих клеток в условиях культивирования без сыворотки. Внесение экзогенного ЮР-1 существенно не изменяет существующую аутокринную лиганд-рецепторнную регуляцию. Данная гипотеза в будущем будет проверяться в экспериментах в присутствии специфических ингибиторов ЮР-1Я и 1ЯА.
Исследование выживаемости клеток
линий ММ человека методом подсчета
В эксперименте клетки ЯРМ11640, ЯРМ18226, ГМ-9 сажали в количестве 1,5* 106 на чашку и культивировали в среде без сыворотки в течение 72 ч в присутствии/ отсутствии ЮР-1 в концентрации 20 нг/мл (также как и в случае использования МТТ метода). Через 72 ч подсчитывали среднее количество клеток (из трех чашек на культуру) каждой культуры и сравнили полученные результаты (рис. 3А-В).
Было установлено, что в присутствии юР-1 через 72 ч количество клеток ЯРМЛ640 и ГМ9 выросло (рис. 3А, Б). И наоборот, в среде без юР-1 клетки ЯРМГ1640 не только не росли, но их количество уменьшилось (рис. 3А), а количество клеток ГМ9, без сыворотки не увеличилось (рис. 3Б). Таким образом, данные, полученные в результате подсчета клеток ММ в присутствии и отсутствии юР-1, как и в случае исследования выживаемости клеток ММ методом МТТ, показали, что экзогенный юР-1 является фактором, регулирующим выживаемость клеток ЯРМГ1640 и ГМ9, а также является фактором, регулирующим пролиферацию клеток ММ. Вместе с тем, экзогенный юР-1 не влияет на выживаемость и пролиферацию клеток ЯРМГ8226. Количество клеток ЯРМГ8226 независимо от присутствия или отсутствия в среде юР-1 за 72 часа выросло вдвое (рис. 3В). В клетках ЯРМГ8226 наблюдается выраженная экспрессия юР-1 и юР-2 и всех их рецепторов, что, возможно, позволяет аутокринно регулировать выживание и пролиферацию этих клеток в условиях культивирования без сыворотки, и добавление экзогенного юР-1 решительно не влияет на выживаемость и рост клеток ЯРМГ8226. Данную гипотезу мы планируем проверить в экспериментах, в которых будем использовать ингибиторы и бжка юР-1Я и ГЯ с тем, чтобы разомкнуть цепи сигнальной трансдукции, идущие от этих рецепторов и понять, действительно ли в среде без сыворотки экспрессия лигандов юР-1 и юР-2, и их рецепторов юР-1Я и ГЯ достаточна для поддержания аутокринной регуляции пролиферации и выживаемости клеток ЯРМ18226. Полученные данные полностью подтвердили данные результаты метода МТТ, а именно то, что юР-1 усиливает выживаемость клеток ЯРМГ1640 и 1М9, и не влияет на выживаемость клеток ЯРМГ8226 (рис. 3А-В).
Рис. 3. Выживаемость клеток КРМ11640, 1М9 и КРМ18226 в среде без ТЭС в присутствии и отсутствие ЮР-1 (подсчет клеток): *р < 0,05; **р < 0,01 - достоверность различия.
Исследование влияния фактора роста ЮЕ-1 на кривую выживаемости клеток линий ММ человека
В следующей части работы мы исследовали влияние фактора роста ЮР-1 на кривую выживаемости культур клеток КРМ11640, КРМ182260 и 1М-9 (рис. 4А-В).
Клетки указанных культур были посажены в количестве 7*104 клеток на лунку в 1мл среды без сыворотки в присутствии и отсутствие ЮР-1, и их количество подсчитывали через каждые 24 ч в течение 96 ч, по полученным после подсчета средним результатам строили кривые выживаемости (рис. 4А-В). Количество клеток КРМ11640 в присутствии ЮР-1 через 72 ч незначительно выросло и достигло 7,5^10 клеток на лунку (рис. 4А).
Напротив, при отсутствии ЮР-1 количество клеток КРМ11640 начало уменьшаться уже через 24 ч, а через 72 ч их количество уменьшилось примерно до 5,5*104 клеток в лунке. Вместе с тем, и в присутствии и в отсутствие ЮР-1 через 96 ч количество клеток КРМ11640 уменьшилось и достигло в случае присутствия ЮР-1 до 6*104 клеток в лунке, а в случае отсутствия - до 4*104 клеток в лунке.
Рис. 4. Кривая выживаемости клеток КРМ11640, 1М9 и КРМ18226 в среде без ТЭС в присутствии и отсутствие ЮР-1(подсчет клеток): *р < 0,05; **р < 0,01 - достоверность различия.
Количество клеток 1М9 в присутствии ЮР-1 в течение 72 ч увеличилось примерно до 11*104 клеток в лунке, а в отсутствии ЮР-1 увеличилось до 8*104 клеток в лунке (рис. 4Б). Через 96 ч количество клеток 1М9 и в присутствии и в отсутствие ЮР-1 уменьшилось и достигло в случае присутствия ЮР-1 6х104 клеток в лунке, а в случае отсутствия -3,5*104 клеток в лунке.
Клетки КРМ18226 продолжали расти и в присутствии и в отсутствии ЮР-1, и через 72 ч их количество достигло в случае присутствия ЮР-1 12*104 клеток в лунке, а в случае отсутствия -11х104 клеток в лунке (рис. 4В). Вместе с тем через 96 ч количество клеток КРМ18226 и в присутствии, и в отсутствии ЮР-1 незначительно уменьшилось (рис. 4В).
Таким образом, среди исследованных линий клеток ММ чувствительными к ЮР-1 оказались клетки КРМ11640 и 1М9, которые в присутствии ЮР-1 начиная с 24 ч насчитывали большее количе-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНОПОДОБНОГО ФАКТОРА... 1 Эб
ство клеток, чем в случае, когда IGF-1 отсутствовал (рис. 4А, Б). Очевидно, что в этих двух линиях клеток IGF-1 является фактором, поддерживающим выживаемость, а для клеток линии IM-9 IGF-1 оказывает пролиферативный эффект. Напротив, клетки RPMI8226 оказались практически нечувствительными к IGF-1, хотя присутствует очень незначительный пролиферативный эффект через 72 ч, однако его величина является чрезвычайно маленькой (рис. 4В).
Таким образом, очевидно, что данные, полученные методом МТТ, подсчета клеток и исследования кривых выживаемости клеток линий ММ человека RPMI1640, RPMI8226, IM9, взаимно дополняемы и показывают, что IGF-1 является фактором выживаемости и фактором роста для клеток RPMI1640 и IM9, и не влияет на выживаемость и рост клеток RPMI8226. Мы объясняем это тем фактом, что в клетках RPMI8226 наблюдается выраженная экспрессия и IGF-1, и IGF-2, и всех их рецепторов, что, возможно, позволяет аутокринно регулировать выживание и пролиферацию этих клеток в условиях культивирования без сыворотки, и добавление экзогенного IGF-1 не влияет на выживаемость и рост этих клеток.
В литературе имеются работы, в которых исследовалась роль IGF-1 в выживаемости миелом-ных клеток. В 2009 г Sprynski и др. исследовали влияние различных факторов роста на выживаемость 9 линий миеломных клеток (XG-N) в среде без сыворотки. Среди этих 9 линий сначала были отобраны те, которые могли расти 4 дня в среде без сыворотки. Таковыми оказались 3 линии клеток: XG-5, XG-7 и XG-20. Ингибирование киназной активности IGF-1R в этих линиях приводило к резкому уменьшению их выживаемости [30]. В этой работе также было показано, что экзогенный IGF-1 является фактором, в разной степени, усиливающим пролиферацию большинства исследованных линий клеток [30]. Strömberg и др. показали, что ингибирование киназной активности IGF-1R в линии клеток RPMI8226 увеличило чувствительность этих клеток к доксорубицину, мелфалану и декса-метазону [31]. Недавно в работе Tagoug I. и др. было исследовано совместное действие AS602868, ингибитора NF-kb сигнального пути, и монокло-нальных антител против IGF-1R в четырех линиях клеток ММ человека: RPMI8226, LP1, MM.1S и U266. Исследования показали, что в двух из четырех линий клеток - RPMI8226 и LP1 комбинация указанного ингибитора и антител против IGF-1R усиливала апоптоз [32]. В другой работе было показано, что в мышиных клетках 5T33MMvv и в клетках ММ человека Karpas707 и OPM-2, экзогенный IGF-1 негативно регулировал экспрессию про-апоптотического гена Bim, и это коррелировало с усилением выживаемости этих клеток [7].
В отличие от перечисленных работ, мы не использовали ингибиторы киназной активности IGF-1R. Этот подход приемлем для исследования роли IGF-1 только в тех случаях, когда клетки ММ могут расти некоторое время без сыворотки. Также мы не использовали, как авторы указанных выше статей, высокие (в пять раз превышающие нормы) концентрации экзогенного IGF-1. Концентрация IGF-1 в наших экспериментах соответствовала физиологической, т.е. той, в которой IGF-1 присутствует в сыворотке крови, и при которой этот фактор in vivo взаимодействует со своим рецептором.
Полученные нами результаты коррелируют с данными других авторов, и мы убедительно пока-
зали, что ЮР-1 может являться фактором, усиливающим выживаемость клеток ММ. Однако следует отметить, что не для всех клеток ММ ЮР-1 является фактором выживаемости. Как показали результаты наших экспериментов, ЮР-1 является фактором выживаемости для миеломных клеток чувствительных к сыворотке (к ростовым факторам, присутствующим в сыворотке), как в случае с клетками КРМ11640, и не является фактором выживаемости для клеток менее чувствительных к сыворотке, как в случае с клетками ИРМ18226. Также необходимо отметить, что влияние ЮР-1 на выживаемость клеток ММ не зависит от их диффе-ренцировки. Например, в нашем случае и ИРМ11640, и ИРМ18226 экспрессируют на своей поверхности одинаковые маркеры дифференциров-ки, СБ138+, СБ38+, СБ45-, СБ56±, СБ19- [16], однако по-разному отвечают на экзогенный ЮР-1. Также следует подчеркнуть, что влияние ЮР-1 на выживаемость клеток ММ не зависит от экспрессии ЮР-1Я. Как показали наши эксперименты, все три линии исследуемых клеток ММ экспрессировали ЮР-1Я, но их реакции на экзогенный ЮР-1 отличались.
Исследование экспрессии мРНК генов
СусВ1 и СусБ1 и мРНК генов,
принадлежащих семействам Вс1-2 и 1АР
Мы исследовали экспрессию мРНК генов CycB1 и CycD1 в линиях клеток ММ человека ИРМ11640, ИРМ18226 и 1М-9 в среде без сыворотки, в присутствии и отсутствие ЮР-1 (рис. 5). Известно, что эти гены экспрессируются при пролиферации клеток. Показано, что в клеточном цикле ЮР-1/ЮР-1Я сигнальный путь индуцирует синтез СусБ1 и промотирует в^Б переход [25].
RPMI 1640
RPMI 8226
IM 9
С ve В1
С ve Dl
GAPDH
IGF-1
Рис. 5. Экспрессия мРНК генов CycB1 и CycD1 в линиях клеток ММ человека в среде без ТЭС в присутствии и отсутствие ЮР-1.
Этот сигнальный путь также может индуцировать экспрессию СусА и СусВ и промотировать в2-М переход [25; 31]. Наши исследования показали, что экспрессия мРНК генов CycB1 и CycD1 во всех указанных линиях клеток является выраженной и не изменяется в присутствии ЮР-1. Несмотря на то, что данные полученные методом МТТ-теста, подсчета клеток и исследования кривых выживаемости клеток ММ человека, свидетельствуют в пользу того, что ЮР-1 является фактором выживаемости и фактором роста для клеток ИРМ11640 и 1М-9, тем не менее, экспрессия мРНК генов CycB1 и CycD1 в указанных клетках в присутствии ЮР-1 не изменяется. Мы не исследовали изменение экспрессии мРНК этих генов через 24 ч и 48 ч. Возможно, что именно в эти промежутки времени их экспрессия могла увеличиться, а через 72 ч, когда рост клеток останавливается, и количество клеток
начинает убывать, мы не обнаруживаем увеличения их экспрессии. Также не исключено, что в клетках РРМ116401, РРМ18226, 1М9 ЮР-1 все же участвует в регуляции экспрессии генов CycB1 и CycD1 на уровне экспрессии их белков, и работу в этом направлении мы в будущем планируем выполнить. В литературе имеются несколько работ, в которых исследовалась экспрессия гена CycD1 у больных ММ. Показано что гиперэкспрессия гена CycD1 в клетках ММ коррелирует с неблагоприятным прогнозом заболевания [5; 8; 13].
Известно, что во многих типах злокачественных клеток нарушен механизм, регулирующий запрограммированную клеточную гибель - апоп-тоз. Опухолевые клетки менее чувствительные к индукции апоптоза при лечении получают преимущество в борьбе за выживание, по сравнению с окружающими их нормальными клетками. На сегодня известны различные гены, участвующие в регуляции апоптоза. К ним относятся гены семейства Вс1-2 и гены семейства ингибиторов апоптоза 1АР.
Мы исследовали роль ЮР-1 в регуляции экспрессии мРНК генов, принадлежащих семейству Bcl-2: Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 в линиях клеток ММ человека РРМ11640, РРМ18226 и 1М9 (рис. 6). Экспрессия мРНК исследуемых генов выявляется во всех трех линиях клеток ММ как в присутствии, так и в отсутствие экзогенного ЮР-1 (рис. 6). В линии клеток РРМ11640 добавление экзогенного ЮР-1 не влияет на изменение экспрессии мРНК генов Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1. В линии клеток РРМ18226 экзогенный ЮР-1 сильно подавляет экспрессию мРНК Bcl-2 и не влияет на изменение экспрессии мРНК генов Bcl-xL и Mcl-1. В линии клеток 1М9 ЮР-1 увеличивает экспрессию мРНК гена Mcl-1 и не влияет на экспрессию мРНК генов Bcl-2, Bcl-xL.
и аГЯЗ, антитела, блокирующего активацию ЮР-1Я, приводило к уменьшению уровня экспрессии Вс1-хЬ в линиях леток ММ [21]. В другой работе было показано, что ЮР-1-опосредуемое выживание клеток ММ коррелировало с повышением уровня экспрессии Вс1-хЬ на уровне транскрипции [26]. Таким образом, литературные данные являются противоречивыми, вместе с тем очевидно, что гены семейства Вс1-2 участвуют в молекулярных механизмах злокачественной прогрессии ММ, что свидетельствует о необходимости продолжения изучения регуляции их экспрессии при ММ, в том числе и участия в этой регуляции факторов роста и их рецепторов, принадлежащих системе ЮР/инсулин. Мы впервые показали, что в линии клеток РРМ18226 экзогенный ЮР-1 заметно подавляет экспрессию мРНК Bcl-2 и не влияет на изменение экспрессии мРНК генов Bcl-xL и Mcl-1. В линии клеток 1М9 экзогенный ЮР-1 увеличивает экспрессию мРНК гена Mcl-1 и не влияет на экспрессию мРНК генов Bcl-2, Bcl-xL.
На следующем этапе мы исследовали ЮР-1-зависимую экспрессию мРНК генов, принадлежащих к семейству ингибиторов апоптоза IAP: ШАР-1, ШAP-2, NA.JP, Livin - в линиях клеток ММ человека РРМ11640, РРМ18226, 1М9, (рис. 7). Экспрессия мРНК ШАР-1, ШАР-2, NAJP выявляется во всех трех линиях клеток ММ как в присутствии, так и в отсутствие ЮР-1, а экспрессия мРНК Livin не обнаруживается ни в одной из исследуемых линий (рис. 7). В клетках РРМ11640 и 1М9 добавление экзогенного ЮР-1 не влияет на изменение экспрессии мРНК генов ШАР-1, ШАР-2, Ш1Р.
Рис. 7. Экспрессия мРНК генов семейства ингибиторов апоптоза 1АР: Н1АР-1, ШАР-2, NAJP в линиях клеток ММ человека в среде без ТЭС, в присутствии и отсутствие ЮР-1.
Рис. 6. Экспрессия мРНК генов семейства Вс1-2: Мс1-1, Bcl-xL, Вс1-2 в линиях клеток ММ человека в среде без ТЭС, в присутствии и отсутствие ЮР-1.
В литературе имеются работы, посвященные исследованию экспрессии мРНК генов, принадлежащих семейству Вс1-2: Вс1-2, Вс1-хЬ, Мс1-1 при множественной миеломе. В ходе исследований было показано, что уровень экспрессии Вс1-2 при ММ достаточно высокий, но, в тоже время, вариабильный [22;
33]. Высокий уровень экспресси Мс1-1, как было показано, ассоциируется с малигнизированным фенотипом клеток ММ [29]. Повышенная экспрессия Вс1-2 и Вс1-хЬ ассоциируется с лекарственной устойчивостью к доксорубицину, дексаметазону и этопозиду [10; 33;
34]. Защитный эффект экзогенного ЮР-1 против дек-саметазон-индуцированного апоптоза не коррелировал с изменением экспрессии Вс1-2 и Вс1-хЬ [15; 36]. Тем не менее, совместное добавление дексаметазона
В линии клеток РРМ18226 экзогенный ЮР-1 сильно подавляет экспрессию мРНК ШАР-1 и не влияет на изменение экспрессии мРНК генов ШАР-2 и ^1Р. Также мы исследовали ЮР-1-зависимую экспрессию мРНК генов Survivin и Х1АР. Предварительные результаты показали, что экспрессия этих генов не зависит от присутствия ЮР-1, однако, полученные данные не приведены в этой статье, поскольку они требуют подтверждения.
Изучение роли генов, принадлежащих к семейству ингибиторов апоптоза 1АР, в злокачественной прогрессии опухолей человека является на сегодня актуальной. Работ, посвященных их роли при ММ, не так много. Что касается регуляции их экспрессии, показано, что в клетках ММ ЮР-1 повышает экспрессию Н1АР-2 и XI АР [20]. Другой член семейства 1АР survivin, как было показано, экспрессируется во многих трансформированных линиях клеток и в злокачественных опухолях [17].
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНОПОДОБНОГО ФАКТОРА... 37
В некоторых линиях клеток ММ IGF-1 усиливал ют с клетками стромы (фибробластами) и активи-экспрессию survivin [20]. Также было показано, что руют в них транскрипцию и секрецию цитокинов и экспрессия рекомбинантного survivin в пре-В ли- факторов роста, которые впоследствии паракрин-нии клеток увеличивала выживаемость этих клеток ным образом воздействуют на миеломные клетки. в среде без сыворотки [4]. Имеются и другие рабо- В тоже время сами клетки ММ при взаимодействии ты, посвященные роли генов, принадлежащих к с элементами костномозгового окружения (фиб-семейству ингибиторов апоптоза IAP в злокачест- робластами, белками внеклеточного матрикса) экс-венной прогрессии опухолей человека. Вместе с прессируют цитокины и факторы роста, которые тем в этих работах недостаточно уделено внимания могут воздействовать аутокринно. Паракринное и роли IGF-1/IGF-1R опосредованной регуляции экс- аутокринное действие цитокинов и факторов роста прессии генов, принадлежащих к семейству инги- на клетки ММ могут придать им более агрессивные биторов апоптоза IAP. Мы впервые установили, что свойства - усилить пролиферацию, выживаемость, в исследованных нами клетках ММ экспрессия индуцировать формирование опухолевого клона, мРНК гена HIAP-1, является IGF-1/IGF-1R зависи- активировать механизмы возникновения лекарст-мой, в то время как экспрессия мРНК генов HIAP-2, венной устойчивости и активировать разрушения NAIP не зависит от активации IGF-1/IGF-1R сиг- кости. Поэтому исследование роли цитокинов и нального пути. факторов роста в злокачественной прогрессии ММ В результате исследований мы установили, является на сегодня актуальным. что в линиях клеток множественной миеломы чело- Одним из факторов роста, присутствующим века RPMI1640, RPMI8226, IM-9 экспрессия мРНК в большом количестве в микроокружении костного генов Bcl-2, Mcl-1, HIAP-1 является IGF-1/IGF-1R мозга, является IGF-1. Он продуцируется фиброб-зависимой, в то время как экспрессия мРНК генов ластами и остеобластами и, как предполагается, Bcl-xL, HIAP-2, NAIP, CycB1, CycD1 не зависит от воздействует на клетки ММ, и может усилить их активации IGF-1/IGF-1R сигнального пути. выживаемость и пролиферацию. Таким образом, наши исследования показа- В своей работе мы исследовали in vitro роль ли, что линия клеток RPMI8226 отличается от двух IGF-1 в злокачественной прогрессии ММ на моде-других исследованных линий клеток, RPMI1640 и лях культур клеток ММ человека RPMI1640, IM9, по экспрессии мРНК генов системы RPMI8226 и IM9. Все исследуемые линии клеток IGF/инсулин. Эта линия характеризуется выражен- экспрессировали мРНК IGF-1 и мРНК его рецепто-ной экспрессией и мРНК IGF-1 и мРНК IGF-2, и ров IGF-1R и IR-A. Данные, полученные методом всех их рецепторов, и поэтому в этой линии воз- МТТ-теста, подсчета клеток и исследования кри-можно большее количество различных комбинации вых выживаемости, показали, что IGF-1 является лиганд-рецепторных аутокриных взаимодействий, фактором, повышающим выживаемость и проли-что может усилить выживание и пролиферацию ферацию клеток ММ. этих клеток в условиях культивирования без сыво- Известно, что выживаемость клеток ММ мо-ротки. Предположение будет проверено в будущих гут регулировать гены семейств Bcl-2 и IAP. Пред-экспериментах, в которых мы будем исследовать варительные исследования показали, что в регуля-каждое возможное лиганд-рецепторное взаимодей- ции экспрессии генов семейств Bcl-2 и IAP может ствие методом исключения. В этих целях мы будем участвовать IGF-1/IGF-1R-опосредуемый сигналь-использовать новый специфический ингибитор ти- ный путь. Однако имеющиеся в литературе данные, розинкиназной активности IGF-1R picropodophyllin являются противоречивыми. (PPP) и интерферирующие РНК (siRNA) к рецепто- Мы исследовали роль экзогенного IGF-1 в рам IGF-1R, IR-A, IR-B. Это позволит нам дать ответ выживании трех линий клеток ММ человека: на вопрос, какие именно комбинации лиганд- RPMI1640, RPMI8226 и IM9, а также исследовали рецепторного взаимодействия системы IGF/инсулин роль IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов, и индуцируемые ими внутриклеточные сигнальные участвующих в апоптозе: Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1,HIAP-пути вовлечены в выживаемость и пролиферацию 1, HIAP-2, survivin, NAIP. В ходе исследований мы исследуемых клеток ММ. установили, что экспрессия мРНК генов Bcl-2, Mcl- 1, HIAP-1, является IGF-1 зависимой, в то время как Заключение экспрессия мРНК генов Bcl-xL, HIAP-2, NAIP, CycB1, CycD1 не зависит от IGF-1. Одним из злокачественных свойств клеток Таким образом, результаты наших исследо-ММ является их способность мигрировать и лока- ваний in vitro свидетельствуют в пользу того, что лизоваться в костном мозге. В микроокружении IGF-1 является фактором, усиливающим выживае-костного мозга миеломные клетки взаимодейству- мость клеток ММ. Литература 1. Вотякова О.М., Демина Е.А. Множественная миелома. - Клиническая Онкогематология. Руководство для врачей под редакцией профессора Волковой М.А. (Издание второе, переработанное и дополненное). М.: «Медицина», 2007. - C. 847-73. 2. Шушанов C.C. Роль инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1) и некоторых других членов системы IGF/инсулин в прогрессии множественной миеломы // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 3. - С.71-80. 3. Шушанов C.C., Марьина Л.Г., Черных Ю.Б и др. Коэкспрессия мРНК генов систем IGF/инсулин и множественной лекарственной устойчивости у больных множественной миеломой // Клиническая Онкогематология. - 2010. - Т. 3, № 2. -C.105-13. 4. Ambrosini G., Adida C., Altieri D.C. et al. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma // Nat Med. - 1997. - 3. - P. 917-21. 5. Athanasiou E., Kaloutsi V., Kotoula V. et al. Cyclin D1 overexpression in multiple myeloma. A morphologic, immunohistochemical, and in situ hybridization study of 71 parrafin-embedded bone marrow biopsy specimens // Am. J. Clin. Pathol. - 2001. - 116. - P. 535-42.
№ 3/том 12/2013 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
6. Barton E.R. The ABCs of IGF-1 isoforms: impact of muscle hypertrophy and implications for repair. Appl. Physiol // Nutr. Metab. - 2006. - 31. - P. 791-7.
7. De Bruyne E., Bos T. J., Schuit F. et al. IGF-1 suppresses Bim expression in multiple myeloma via epigenetic and posttransla-tional mechanisms // Blood. - 2010. - 115. - P. 2430-40.
8. Filipits M., Pohl G., Stranzl T. et al. Low p27 Kip1 expression is an independent adverse prognostic factor in patients with multiple myeloma // Clin. Cancer. Res. - 2003. - 9. - P. 820-6.
9. Frasca F., Pandini G., Scalia P. et al. Insulin receptor isoform A a newly recognized, high-affinity insulin-like growth factor II receptor in fetal and cancer cells // Mol Cell Biol. - 1999. - 19. - P. 3278-88.
10. Gazitt Y., Fey V., Thomas C. et al. Bcl-2 overexpression is associated with resistance to dexamethasone, but not melphalan, in multiple myeloma cells // Int J Oncol. - 1998. - 13. - P. 397-405.
11. Hernandez-Sanchez С., Werner H., Charles T. et al. Differential Regulation of Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I) Receptor Gene Expression by IGF-I and Basic Fibroblastic Growth Factor // JBC. - 1997. - 272(8). - P. 4663-70.
12. Hideshima T., Bergsagel P.L., Kuehl W.M. et al. Advances in Biology of Multiple Myeloma: Clinical Applications // Blood. -2004. - 104. - P. 607-18.
13. Hoechtlen-Wollmar W., Menzel G., Bartl R. et al. Amplification of cyclin D1 gene in multiple myeloma: clinical and prognostic relevance // Br. J Haematol. - 2000. - 109. - P. 30-8.
14. Jaffe E.E., Harris N., Stein H. et al. World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumors of Hematopoietic and Lymphoid Tissues - Lyon: IRC Press, 2001. -351 p.
15. Jourdan M., De Vos J., Mechti N. et al. Regulation of Bcl-2 - family proteins in myeloma cells by three myeloma survival factors: interleukin-6, interferon-alpha and insulin-like growth factor 1 // Cell Death Differ. - 2000. - 7. - P. 1244-52.
16. Kalitin N., Kostjukova M., Kakpakova E. et al. Vascular endothelial growth factor 1 (VEGFR1) gene expression depends on immunophenotype of human multiple myeloma cells // Eur J Cancer. - 2011. - 47(1). - S644.
17. LaCasse E.S., Baird S., Korneluk R.G. et al. The inhibitors of apoptosis (IAP) and their emerging role in cancer // Oncogene. -1998. - 17. - P. 3247-59.
18. Ludwig T., EggenschwillerJ., Fisher P. et al. Mouse mutants lacking the type 2 IGF receptor (IGF2R) are rescued from perinatal lethality in igf2 and igf-1r null backgrounds // Dev Biol. - 1996. - 177. - P. 517-35.
19. Mitsiades C.S, Mitsiades N, Kung A.L. et al. The IGF/IGF-1R system is a major therapeutic target for multiple myeloma, other hematologic malignancies and solid tumors // Blood. - 2002. - P. 100-170a.
20. Mitsiades C.S, Mitsiades N, Poulaki V. et al. Activation of NF-kappa B and upregulation of intracellular anti-apoptotic proteins via the IGF-1/Akt signaling in human multiple myeloma cells: therapeutic implications // Oncogene. - 2002. - 21. - P. 5673-83.
21. Ogawa M., Nishiura T., Oritani K. et al. Cytokines prevent dexamethasone-induced apoptosis via the activation of mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase pathways in a new multiple myeloma cell line // Cancer Res. - 2000. - 60. - P. 4262-9.
22. Pettersson M., Jernberg-Wiklund H., Larsson L.-G. et al. Expression of the bcl-2 Gene in Human Multiple Myeloma Cell Lines and Normal Plasma Cells // Blood. - 1992. - 179(2). - P. 495-502.
23. Raab M.S., Podar K., Breitkreutz I. et al. Multiple myeloma // Lancet. - 2009. - 374. - P. 324-39.
24. Sacco A., Morcavallo A., Pandini G. et al. Differential signaling activation by insulin and insulin-like growth factors I and II upon binding to insulin receptor isoform A // Endocrinology. - 2009. - 150(8). - P. 3594-602.
25. Samani A.A., Yakar S., LeRoith D. et al. The role of the IGF system in cancer growth and metastasis: Overview and recent insights // Endocrine Reviews. - 2007. - 28. - P. 20-47.
26. Singleton J.R., Dixit V.M., Feldman E.L. et al. Type I insulin-like growth factor receptor activation regulates apoptotic proteins // J Biol Chem. - 1996. - 271. - P. 31791-4.
27. Slaaby R., Schaffer L., Lautrup-Larsen I. et al. Hybrid receptors formed by insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor I receptor (IGF-IR) have low insulin and high IGF-1 affinity irrespective of the IR splice variant // J Biol Chem. - 2006. - 281. - P. 25869-74.
28. Soos M.A., Field C.E., Siddle K. et al. Purified hybrid insulin/insulin-like growth factor-I receptors bind insulin-like growth factor-I, but not insulin, with high affinity // Biochem J. - 1993. - 290. - P. 419-426.
29. Spets H., Stromberg T., Georgii-Hemming P. et al. Expression of the bcl-2 family of pro- and anti-apoptotic genes in multiple myeloma and normal plasma cells: regulation during interleukin - 6 (IL-6) - induced growth and survival // Eur. J. Haematol. -2002. - 69. - P. 76-89.
30. Sprynski A.C., Hose D., Caillot L. et al. The role of IGF-1 as a major growth factor for myeloma cell lines and the prognostic relevance of the expression of its receptor // Blood. - 2009. - 113. - P. 4614-26.
31. Stromberg T., Ekman S., Girnita L. et al. IGF-1 receptor tyrosine kinase inhibition by the cyclolignan PPP induces G2/M-phase accumulation and apoptosis in multiple myeloma cells // Blood. - 2006. - 107. - P. 669-78.
32. Tagoug I., Sauty De Chalon A., Dumontet C. Inhibition of IGF-1 Signalling Enhances the Apoptotic Effect of AS602868, an IKK2 Inhibitor, in Multiple Myeloma Cell Lines // PLoS ONE. - 2011. - 6(7): e22641. doi:10.1371/journal.pone.0022641
33. Tu Y., Xu F., Liu J. et al. Upregulated Expression of BCL-2 in Multiple Myeloma Cells Induced by Exposure to Doxorubicin, Etoposide, and Hydrogen Peroxide // Blood. - 1996. - 88(5). - P. 1805-12.
34. Tu Y., Renner S., Xu F. et al. BCL-X expression in multiple myeloma: possible indicator of chemoresistance // Cancer Res. -1998. - 58. - P. 256-62.
35. Weber J.D., Kuo M.L., Bothner B. et al. Cooperative signals governing ARF mdm2 interaction and nucleolar localization of the complex // Mol. Cell. Biol. - 2000. - 20. - P. 2517-28.
36. Xu F., Gardner A., Tu Y. et al. Multiple myeloma cells are protected against dexamethasone-induced apoptosis by insulin-like growth factors // Br. J. Haematol. - 1997. - 97. - P. 429-40.
37. Yamaguchi Y., Flier J.S., Yokoto A. et al. Functional properties of two naturally occurring isoforms of the human insulin receptor in Chinese hamster ovary cells // Endocrinology. - 1991. - 129. - P. 2058-66.
38. Yu H., Rohan T. Role of insulin-like growth factor family in cancer development and progression // J Natl Cancer Inst. - 2000. -92. - P. 1472-89.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ММ - множественная миелома
