CC BY
31
Серия «Биология. Экология»
Онлайн-доступ к журналу: http://izvestiabio.isu.ru/ru
2020. Т. 34. С. 20-32
Иркутского государственного университета
И З В Е С Т И Я
УДК 57.085.23
DOI https://doi.org/10.26516/2073-3372.2020.34.20
Влияние инициальных сред и длительности холодовой предобработки на эффективность андрогенеза в культуре изолированных пыльников озимой пшеницы сорта Иркутская
И. В. Любушкина1'2, А. В. Поморцев1, М. С. Полякова1, Г. А. Арбузова1'2, В. К. Войников1, Б. Б. Анапияев3
'Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск, Россия 2Иркутский государственный университет, г. Иркутск, Россия 3 Казахский национальный исследовательский технический университет им. К. И. Сатпаева, г. Алматы, Казахстан E-mail: ostrov'873@yandex.ru
Аннотация. Изучались особенности андрогенеза in vitro в культуре изолированных пыльников озимой пшеницы сорта Иркутская. Исследовано влияние разных питательных сред и условий холодовой предобработки на образование каллусов и эмбриоидов, выявлена оптимальная для индукции андрогенеза среда, определены оптимальные для образования эмбриоидов и зелёных растений-регенерантов температурный режим и длительность холодовой предобработки.
Ключевые слова: озимая пшеница, культура изолированных пыльников, индуцированный андрогенез, гаплоиды, эмбриоидоподобные структуры, каллусы, инициальные среды, низкотемпературное воздействие.
Для цитирования: Влияние инициальных сред и длительности холодовой предобработки на эффективность андрогенеза в культуре изолированных пыльников озимой пшеницы сорта Иркутская / И. В. Любушкина, А. В. Поморцев, М. С. Полякова, Г. А. Арбузова, В. К. Войников, Б. Б. Анапияев // Известия Иркутского государственного университета. Серия Биология. Экология. 2020. Т. 34. С. 20-32. https://doi.org/10.26516/2073-3372.2020.34.20
Гаплоидные технологии основываются на регенерации гаметных клеток с образованием целых растений. Главное преимущество гаплоидных технологий - это возможность быстрого, за одно поколение, получения гомозиготных растений с требуемыми параметрами. В связи с этим данный метод имеет большие перспективы использования в генетике и селекционных программах, а также в фундаментальных областях биологии для исследования структуры и эволюции генома растений. Сегодня для получения гаплоидных растений используют достаточно широкий ряд методик: отдалённую гибридизацию с селективной элиминацией хромосом чужеродного вида-опылителя [Niroula, Bimb, 2009], культивирование изолированных пыльников и микроспор [An improved ... , 2001; Lantos, Jancso, Pauk, 2005;
Введение
Soriano, Li, Boutilier, 2013], неоплодотворённых завязей и семяпочек [Bo-hanec, 2009]. Весьма примечательным, с нашей точки зрения, является метод культивирования изолированных пыльников, который основывается на явлении андрогенеза in vitro, поскольку он достаточно несложен и требует минимальных затрат. Кроме того, некоторые виды растений показывают наибольшую частоту индуцированного андрогенеза именно в культурах изолированных пыльников, где микроспоры находятся в условиях, соответствующих родительскому организму [Bhojwani, Dantu, 2010]. Следует отметить, что эффективность андрогенеза у разных видов растений значительно различается и даже внутри одного вида может варьировать между сортами. Показано, что эффективность андрогенеза в культуре изолированных пыльников во многом определяется генотипом растений и находится под строгим генетическим контролем [Islam, Tuteja, 2012]. Так, у мягкой пшеницы имеются сорта, для которых экспериментально установлена невозможность применения данного метода [Comparison of ... , 2020]. Условия выращивания донорных растений также могут оказывать значительное воздействие на развитие пыльников и, следовательно, на частоту эмбриогенеза у микроспор [Olmedilla, 2010]. Ещё одной проблемой применения гаплоидных технологий является образование растений со смешанной плоидностью вследствие слияния гаплоидных ядер на инициальных стадиях андрогенеза или эндопо-липлоидии [Islam, Tuteja, 2012]. Однако главной проблемой андрогенеза у хозяйственно значимых злаковых культур является высокая частота формирования растений-альбиносов, лишённых хлорофилла [Progress in doubled ... , 2009]. Такие растения не могут выживать в природе и не имеют какой-либо хозяйственной ценности. Во многом существующие проблемы применения гаплоидных технологий связаны с недостаточной изученностью данного метода. Тем не менее его использование открывает большие перспективы для получения новых сортов значимых для сельского хозяйства растений, более устойчивых к широкому ряду факторов внешней среды, что особенно важно для регионов рискованного земледелия.
Настоящая работа посвящена изучению особенностей андрогенеза in vitro в культуре изолированных пыльников озимой мягкой пшеницы сорта Иркутская и определению методических особенностей получения интакт-ных растений данного сорта.
Материалы и методы
В качестве исходного материала использовалась озимая мягкая пшеница сорта Иркутская. В осенне-зимний период донорные растения выращивали на станции искусственного климата (фитотрон) СИФИБР СО РАН. Температура поддерживалась в интервале 22-26 °С, фотопериод составил 16 ч. Полив осуществляли еженедельно. В весенне-летний период донорные растения выращивали в поле на экспериментальных участках Заларинского аг-роэкологического стационара (дер. Тунгуй, Заларинский район, Иркутская область). Стационар расположен в лесостепной части Среднего Приангарья в бассейне р. Заларинка. Среднемесячные температуры в 2020 г. в период
активной вегетации колебались от 9 до 19 °С. Количество среднемесячных осадков в этот же период составило от 50 до 130 мм. Растительный материал отбирался на стадии трубкования. После срезки колосья помещались в воду и подвергались холодовой предобработке при 4 °С в темноте в течение 3-15 сут.
В асептических условиях донорные колосья обрабатывали 98%-ным этанолом. Пыльники вычленялись из 6-10 колосков средней трети колоса. Извлечённые пыльники помещались на инициальные стерильные среды Potato IV (PIV) [A set of the ... , 1978] и N6 [Анапияев, 2001] с разным содержанием регуляторов роста, нафтилуксусную кислоту (НУК; 0,5, 1, 1,5 мг/л) и 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д; 0,2, 0,5, 1, 1,5 и 2 мг/л). В качестве источника углеводов использовали сахарозу (90 г/л) и мальтозу (80 г/л). Содержание агара в средах составляло 7 г/л. После пересадки пыльники культивировали в темноте при температуре 26 °С в течение 4 недель до появления каллусов и эмбриоподобных структур. В дальнейшем эмбриопо-добные структуры и каллусы переносили на среды для регенерации: Гам-борга (В5) [Gamborg, Eveleigh, 1968] или 190-2Cu [Pauk, Mihaly, Puolimatka, 2003] с регуляторами роста НУК (0,5 мг/л) и кинетином (0,5 мг/л) или без регуляторов роста и помещали в темноту при 4 °С на 3, 5 или 7 сут. Затем сосуды с каллусами и эмбриоподобными структурами переносили под непрерывное освещение при 22-24 °С. Развившиеся зелёные проростки обрабатывали 0,05%-ным раствором колхицина, высаживали в смесь вермикулит : перлит и прикрывали стаканами для поддержания влажности. В течение трёх недель проростки подкармливали либо соответствующей средой (B5 или 190-2Cu) в разведении 1:2, либо средой Кнопа в разведении 1:1. Далее растения переносили в почвосмесь.
Особенности андрогенеза оценивали по частоте образования каллусов и эмбриоподобных структур к общему числу пыльников и частоте образования общего числа проростков и числа зелёных проростков к числу эм-бриоподобных структур и каллусов. Статистическая обработка данных производилась с использованием программ MS Excel 2016 и SigmaPlot v. 14.0.
Результаты и обсуждение
Широкое применение гаплоидных технологий для создания новых высокопродуктивных и устойчивых к абиотическим и биотическим факторам среды сортов ценных сельскохозяйственных растений сегодня во многом ограничено низкой частотой образования каллусов, эмбриоидов и зелёных растений-регенерантов. Подбор оптимальных условий культивирования и определение отзывчивых генотипов играет значимую роль для повышения частоты андроклинии. Нами было исследовано влияние разных питательных сред и условий холодовой предобработки на образование андроклинных структур, а именно каллусов и эмбриоидов, в культуре изолированных пыльников озимой пшеницы сорта Иркутская. С целью выбора оптимальной инициальной среды были проанализированы среды N6 и PIV и их модификации (табл. 1).
Таблица 1
Влияние состава инициальных сред на частоту эмбриоидо- и каллусогенеза в культуре изолированных пыльников озимой пшеницы сорта Иркутская
ы ЭС Каллусы
«
Среда Источник С Модификация среды Содержание 2,4-мг/л Число культивирована пыльников Число Частота, % Число Частота, %
9%-ная - 0,2 179 1 0,56 4 2,23
PIV сахароза - 1,5 315 0 0 9 2,85
8%-ная - 0,2 188 0 0 0 0
мальтоза - 1,5 156 0 0 0 0
Минеральная 9%-ная Без картофель- 0,2 210 0 0 2 0,95
основа PIV сахароза ного экстракта 1,5 290 4 1,38 2 0,69
- 1 315 0 0 33 10,47
Глицин 2 мг/л 1 363 2 0,55 40 11,11
N6 9%-ная Глицин 2 мг/л; НУК 1 мг/л 1 4183 57 1,36 14 3 3,41
сахароза Глицин 2 мг/л; НУК 1,5 мг/л 0,5 642 3 0,46 15 2,35
Глицин 2 мг/л; НУК 0,5 мг/л 1,5 572 2 0,35 16 2,79
Примечание: ЭС - эмбриоидоподобные структуры. 2,4-Д - дихлорфеноксиуксусная кислота; НУК -нафтилуксусная кислота.
Среда PIV является рекомендуемой по протоколу J. Pauk с соавторами [Pauk, Mihâly, Puolimatka, 2003] для инициации андрогенеза в культуре изолированных пыльников пшеницы Triticum aestivum L. Для разных сортов озимой и яровой пшеницы именно эта среда считается одной из наиболее подходящих. Многие авторы сообщали об успешном применении сред PII или PIV с целью получения эмбриогенных структур в культурах изолированных пыльников и микроспор [Получение высокоморозостойких форм ... , 2012; Изучение особенностей андрогенеза ... , 2013]. Однако в наших исследованиях разные модификации среды PIV в большинстве случаев показали крайне низкую частоту образования эмбриоидов или их полное отсутствие в культуре вне зависимости от содержания ростового регулятора 2,4-Д (см. табл. 1). Использование в качестве источника углеводов мальтозы было также совершенно неэффективным - образования каллусов и эмбриоидов в культуре пыльников не наблюдалось вовсе (см. табл. 1). Единственным вариантом среды PIV, на которой образование эмбриоидоподобных структур происходило с частотой выше 1 %, явилась модификация, в которой использовалась минеральная основа PIV без картофельного экстракта с добавлением 2,4-Д в концентрации 1,5 мг/л (см. табл. 1). Однако значительным недостатком данного варианта явилась низкая частота образования каллусов -0,69 % (см. табл. 1).
Оригинальный вариант среды N6 также показал полное отсутствие эм-бриоидоподобных структур в культуре изолированных пыльников. В то же время характерной особенностью применения этой среды для изучаемого сорта пшеницы явилась высокая частота образования каллусов - более 10 % (см. табл. 1). Интересно отметить, что добавление в среду N6 аминокислоты глицина в концентрации 2 мг/л приводило к образованию эмбриоидов в культуре, хотя и с низкой частотой (см. табл. 1). Наиболее подходящим вариантом среды для индукции образования андроклинных структур в культуре изолированных пыльников озимой пшеницы сорта Иркутская явилась модификация N6, содержащая наряду с глицином и 2,4-Д дополнительный регулятор роста НУК. Оптимальные концентрации НУК и 2,4-Д в среде составили 1 и 1 мг/л соответственно (см. табл. 1). При использовании данного варианта среды N6 мы наблюдали образование эмбриоидоподобных структур в культуре изолированных пыльников с частотой 1,36 % и каллусов с частотой 3,41 % (см. табл. 1). Такой выход андроклинных структур считается приемлемым для продолжения работы с исследуемым сортом [Анапияев, 2001].
Для переключения микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития необходим соответствующий сигнал. Холодовая предобработка может инициировать симметричное деление микроспор и, следовательно, приводить к образованию андрогенных структур [Stress induced microspore ... , 1996; Hu, Kasha, 1997]. Следует отметить, что для каждого генотипа температура и продолжительность такого воздействия на донорные растения устанавливается экспериментально, хотя рекомендуемый период холодовой предобработки для работ со злаковыми культурами составляет от 3 до 21 сут. [Islam, Tuteja, 2012]. Некоторые авторы отмечают тот факт, что длительность холодовой предобработки донорных растений пшеницы может быть значимым фактором, влияющим на образование андроклинных структур в культурах изолированных пыльников [Анапияев, 2001]. В нашей работе установлено, что максимальная частота образования эмбриоидов в культуре изолированных пыльников озимой пшеницы сорта Иркутская наблюдалась в тех случаях, когда длительность холодовой предобработки донор-ных колосьев при +4 °С составляла от 6 до 12 дней (рис., а). В то же время максимальная частота образования каллусов в культуре изолированных пыльников регистрировалась после холодовой предобработки растений озимой пшеницы в течение 3-6 сут. (рис., б). Вероятно, это может быть обусловлено необратимыми физиолого-биохимическими изменениями, происходящими в срезанных колосьях в этот период. Интересно отметить, что работы некоторых авторов свидетельствуют о том, что воздействие низкими положительными температурами не всегда является необходимым для получения андроклинных структур и растений-регенерантов у ряда сортов пшеницы [Marsolais, Seguin-Swartz, Kasha, 1984].
Образование андроклинных структур в культуре изолированных пыльников не всегда в дальнейшем сопровождается регенерацией интактных зелёных растений [Comparison of the ... , 2020]. В нашей работе для инициации регенерации растений озимой пшеницы использовались среды B5 и 190-2Cu (табл. 2, 3). Некоторые авторы для образования растений-регенерантов
применяют также модификации среды Мурасиге - Скуга [Comparison of the ... , 2020]. Нами было установлено, что среда В5 не приводила к образованию регенерантов из андроклинных структур озимой пшеницы сорта Иркутская вне зависимости от наличия или отсутствия ростовых регуляторов и происхождения донорных растений (см. табл. 2, 3). Среда 190-2Cu оказалась более эффективной для индукции регенерации растений как с добавлением ростовых регуляторов, так и без них (см. табл. 2, 3).
0 *
а 2,5
1
S
0
1 2
1 В
ВС
i W
я
О
О
п а
Си 1 Ф о
¡5
о
в 0,5 г
О
3 4 S 6 7 в 9 10 11 12 13 11 15 период холодовой предобработки, дни
6 6 6
6 ■
1 р
а о а
L в
6 6
6
[±1
3 4 5 6 7 3 9 10 11 12 13 11 15 период холодовой предобработки, дни
Рис. Влияние длительности холодовой предобработки донорных колосьев озимой пшеницы сорта Иркутская на частоту образования эмбриоидов (а) и каллусов (б) в культуре изолированных пыльников. а - представлены медианы (Р50), планки погрешностей ограничивают р25 и р75 процентили. Тест на нормальность проводился по методу Шапиро - Уилкса. Попарное множественное сравнение проводилось с использованием теста Тьюки. Значимые различия р50 при р < 0,05 отмечены на диаграмме разными буквами. п = 3; б - представлены М±8.Б. Тест на нормальность проводился по методу Шапиро - Уилкса. Попарное множественное сравнение проводилось с использованием метода Холма - Сидака. Значимые различия М при р < 0,05 отмечены на диаграмме разными буквами. п = 3
Таблица 2
Влияние состава индукционных сред на образование растений-регенерантов из андроклинных структур, полученных в культуре изолированных пыльников, выделенных из донорных растений озимой пшеницы, выращенных в условиях
фитотрона
Среда Наличие ростовых регуляторов/ наличие холодовой предобработки Общее число пыльников Число андроклинных структур Донорные растения, выращенные в условиях фитотрона
Общее число растений-регенерантов Зелёные растения-регенеранты
Число Частота, % Число Частота, %
в5 - / - 205 14 0 0 0 0
+ / - 189 10 0 0 0 0
190-2Си - / - 217 12 3 25 1 8,3
+ / - 388 14 8 57,1 4 28,6
- / + 208 15 4 26,7 0 0
+ / + 198 15 4 26,7 0 0
В литературе имеются сведения о том, что способность пыльников к андрогенезу и последующая способность эмбриоидов образовывать зелёные растения-регенеранты определяются как генотипом выбранного сорта, так и условиями выращивания растений-доноров. Так, некоторые авторы отмечают, что выращивание донорных растений в искусственных условиях негативно сказывается на образовании эмбриоидоподобных структур в культуре пыльников и последующей регенерации зелёных растений [Жоносарь, 2009; Изучение особенностей андрогенеза ... , 2013]. В нашей работе принципиальных различий между частотой образования каллусов и эмбриоидоподоб-ных структур из донорных растений, выращенных в полевых и лабораторных условиях, не было. В то же время применение среды 190-2Си с ростовыми регуляторами было более эффективным в тех случаях, когда мы использовали донорные растения, выращенные в условиях фитотрона (см. табл. 2, 3).
Таблица 3
Влияние состава индукционных сред на образование растений-регенерантов
из андроклинных структур, полученных в культуре изолированных пыльников,
выделенных из донорных растений озимой пшеницы, выращенных в полевых условиях Заларинского агроэкологического стационара
Среда Наличие ростовых регуляторов/ наличие холодовой предобработки Общее число пыльников Число андроклинных структур Донорные растения, выращенные в условиях фитотрона
Общее число Зелёные растения-растений-регенерантов регенеранты
Число Частота, % Число Частота, %
В5 - / - 253 16 0 0 0 0
+ / - 199 18 0 0 0 0
190-2Си - / - 719 28 7 25 4 14,2
+ / - 540 21 10 47,6 3 14,3
- / + 352 17 3 17,6 0 0
+ / + 416 22 4 18,2 0 0
Следует также отметить, что во всех случаях частота образования растений-альбиносов была достаточно высокой и в ряде случаев достигала 70 % от числа всех образовавшихся растений (см. табл. 3). Интересным является и тот факт, что без предварительной низкотемпературной обработки андроклинных структур при +4 °С в течение 3-7 дней мы не наблюдали образования зелёных растений-регенерантов вне зависимости от присутствия ростовых гормонов (см. табл. 2, 3). Рядом авторов отмечается, что в целом образование андроклинных структур и зелёных растений-регенерантов у разных видов озимой пшеницы происходит значительно реже, чем у яровой [Regeneration of fertile ... , 2000; Genetics of androgenesis ... , 2003; Anther culture effectiveness ... , 2014; Comparison of the ... , 2020]. Вероятно, именно низкотемпературное воздействие на разных этапах, начиная от предобработки донорных колосьев и заканчивая воздействием на андроклинные структуры, является для озимой пшеницы ключевым фактором, способствующим андрогенезу в культуре изолированных пыльников и успешному формированию интактных растений.
Выводы
1. Оптимальной средой для индукции андрогенеза в культуре изолированных пыльников озимой пшеницы сорта Иркутская оказалась среда N6 с добавлением глицина (2 мг/л), НУК (1 мг/л) и 2,4-Д (1 мг/л), содержащая в качестве источника углерода 9%-ную сахарозу.
2. Максимальная частота образования эмбриоидов в культуре изолированных пыльников озимой пшеницы сорта Иркутская наблюдалась в тех случаях, когда длительность холодовой предобработки донорных колосьев при +4 °С составляла от 6 до 12 дней.
3. Образование зелёных растений-регенерантов происходило только при использовании среды 190-2Cu с добавлением ростовых регуляторов 2,4-Д (0,5 мг/л) и кинетина (0,5 мг/л), а также без них, при обязательной низкотемпературной обработке андроклинных структур при +4 °С в течение 3-7 сут.
Работа выполнена с использованием коллекций ЦКП «Биоресурсный центр» и оборудования ЦКП «Биоаналитика» Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках проекта № 20-34-80003 мол эв а.
Список литературы
Анапияев Б. Б. Культура микроспор и гаплоидная биотехнология пшеницы. Алма-ты, 2001. 220 с.
Жоносарь М. В. Оптимизация технологии получения удвоенных гаплоидов мягкой пшеницы, различающихся по генам фотопериодической чувствительности (Ppd) и продолжительности яровизации (Vrd) : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Одесса, 2009. 20 с.
Изучение особенностей андрогенеза в культуре пыльников сортов и перспективной формы яровой мягкой пшеницы западносибирской селекции, различающихся наличием или отсутствием пшенично-чужеродных транслокаций / Л. А. Першина, Т. С. Осадчая,
Е. Д. Бадаева, И. А. Белан, Л. П. Россеева // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. Т. 17, № 1. С. 40-49.
Получение высокоморозостойких форм пшенично-пырейных гибридов / Е. П. Раз-махнин, Т. М. Размахнина, В. Е. Козлов, Е. И. Гордеева, Н. П. Гончаров, Ю. Г. Галицын, С. Г. Вепрев, В. М. Чекуров // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2012. Т. 16, № 1. С. 240-249.
An improved in vitro technique for isolated microspore culture of barley / K. J. Kasha, E. Simion, R. Oro, Q. A. Yao, T. C. Hu, A. R. Carlson // Euphytica. 2001. Vol. 120. P. 379385. https://doi.org/10.1023/A:1017564100823
Anther culture effectiveness in producing doubled haploids of cereals / D. Grauda, A. Mikelsone, N. Lisina, K. Zagata, R. Ornicans, O. Fokina, L. Lapina, I. Rashal // Proc. Latv. Acad. Sci. Sect. B.' 2014. Vol. 68. P. 142-147. https://doi.org/10.2478/prolas-2014-0016
A set of potato media for wheat anther culture / C. C. Chuang, J. W. Ouyang, H. Chia, S. M. Chou, C. K. Ching // Proc. Symp. Plant Tissue Culture. Peking: Sci. Press., 1978. P. 5156.
Bohanec B. Doubled Haploids via Gynogenesis // Advanced in haploid production in higher plants. Dordrecht : SpringerScience + BusinessMedia B.V., 2009. P. 47-65. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-8854-4_2
Bhojwani S. S., Dantu P. K. Haploid plants // Plant Cell Culture: Essential Methods. N. Y. : John Wiley & Sons, 2010. P. 61-78. https://doi.org/10.1002/9780470686522.ch4
Comparison of the androgenic response of spring and winter wheat (Triticum aestivum L.) / D. Weigt, A. Kiel, I. Siatkowski, J. Zyprych-Walczak, A. Tomkowiak, M. Kwiatek // Plants. 2020. Vol. 9, N 1. P. 49. https://doi.org/10.3390/plants9010049
Gamborg O. L., Eveleigh D. E. Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. 1968. Vol. 46, N 5. P. 417-421. https://doi.org/10.1139/o68-063
Genetics of androgenesis in winter and spring wheat genotypes / H. K. Chaudhary, I. Dhaliwal, S. Singh, G. S. Sethi // Euphytica. 2003. Vol. 132. P. 311-319. https://doi.org/10.1023/A:1025094606482
Hu T., Kasha K. J. Improvement of isolated microspore culture of wheat (Triticum aestivum L.) through ovary co-culture // Plant Cell Rep. 1997. Vol. 16. P. 520-525. https://doi.org/10.1007/BF01142316
Islam S. M. S., Tuteja N. Enhancement of androgenesis by abiotic stress and other pre-treatments in major crop species // Plant science. 2012. Vol. 182. P. 134-144. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2011.10.001
Lantos C., Jancso M., Pauk J. Microspore culture of small grain cereals // Acta Physiol. Plant. 2005. Vol. 27. P. 631-639. https://doi.org/10.1007/s11738-005-0067-6
Niroula R. K., Bimb H. P. Overview of wheat X maize system of crosses for dihaploid Induction in wheat // WASJ. 2009. Vol. 7, N 8. P. 1037-1045.
Marsolais A. A., Seguin-Swartz G., Kasha K. J. The influence of anther cold pretreat-ments and donor plant genotypes on in vitro androgenesis in wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1984. Vol. 3. P. 69-79. https://doi.org/10.1007/BF00035922
Olmedilla A. Microspore embryogenesis // Plant Development Biology - Biotechnologi-cal Perspectives. Heidelberg : Springer-Verlag, 2010. Vol. 2. P. 27-44. https://doi.org/10.1007/978-3-642-04670-4_2
Pauk J., Mihaly R., Puolimatka M. Protocol for wheat (Triticum aestivum L.) anther culture // Doubled Haploid Production in Crop Plants. Dordrecht : Springer Science+Business Media, 2003. P. 59-64. https://doi.org/10.1007/978-94-017-1293-4_10
Progressed in doubled haploid technology in higher plants / M. Wedzony, B. P. Forster, I. Zur, E. Golemiec, M. Szechynska-Hebda, E. Dubas, G. Got^biowska // Advances in haploid
Production in Higher Plants. Heidelberg : Springer-Verlag, 2009. P. 1-34. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-8854-4_1
Regeneration of fertile doubled haploid plants from colchicine-supplemented media in wheat anther culture / I. Zamani, G. Kovacs, E. Gouli-Vavdinoudi, D. G. Roupakias, B. Barnabas // Plant Breed. 2000. Vol. 119. P. 461-465. https://doi.org/10.1046/j. 1439-0523.2000.00538.x
Soriano M., Li H., Boutilier K. Microspore embryogenesis: establishment of embryo identity and pattern in culture // Plant Reprod. 2013. Vol. 26. P. 181-196. https://doi.org/10.1007/s00497-013-0226-7
Stress induced microspore embryogenesis in tobacco: an optimized system for molecular studies / A. Touraev, A. Ilham, O. Vicente, E. Heberle-Bors // Plant Cell Rep. 1996. Vol. 15. P. 561-565. https://doi.org/10.1007/BF00232453
Influence of Initial Media and Duration of Cold Pretreatment on the Efficiency of Androgenesis in the Culture of Isolated Anthers of Winter Wheat (Triticum aestivum L.) Variety Irkutskaya
I. V. Lyubushkina1,2, A. V. Pomortsev1, M. S. Polyakova1, G. A. Arbuzova1,2, V. K. Voinikov1, B. B. Anapiyaev3
'Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, Irkutsk, Russian Federation 2Irkutsk State University, Irkutsk, Russian Federation 3Satbayev University, Almaty, Kazakhstan
Abstract. Haploid technologies are based on the regeneration of gamete cells to form whole plants. The main advantage of haploid technologies is the ability to quickly in one generation obtain homozygous plants with the required parameters. Nevertheless, the use of these technologies today is limited, what is associated with insufficient knowledge of the physiological and biochemical features of the application of this method. In this regard, this work is devoted to the study of the features of androgenesis in vitro in the culture of isolated anthers of winter wheat cultivar Irkutskaya and the determination of the methodological features of obtaining intact plants. In the autumn-winter period, donor plants were grown at the artificial climate station SIPPB SB RAS. In the spring-summer period, donor plants were grown in the field at the experimental plots of the Zalarinsky agroecological station (Tungui village). The plant material was selected at the booting stage. Anthers were isolated from 6-10 spikelets of the middle third of the spike. The features of androgenesis were assessed by the frequency of formation of calli and embryo-like structures to the total number of anthers and the frequency of formation of the total number of seedlings and the number of green seedlings to the number of embryo-like structures and calli. It was found that the optimal medium for the induction of androgenesis in the anther culture of this common wheat cultivar is the modification of medium N6 containing 9% sucrose, with the addition of glycine (2 mg/L), 2.4-D (1 mg/L) and NAA (1 mg/L). The maximum yield of embryoid-like structures was observed in the case of low-temperature pretreatment of donor plants at + 4 °C for 6-12 days. At the same time, the most intensive calli formation in the culture of isolated anthers occurred after 3-6 days of donor plant cold pretreatment. Regeneration of green plants took place on 190-2Cu medium with the addition of growth regulators (2.4-D, 0.5 mg/L; kinetin, 0.5 mg/L) with obligatory cold pretreatment of androclinic structures at +4 °C for 3-7 days. Obtained results indicate that low-temperature exposure at different stages, from pretreatment of donor ears to exposure to androclinic structures, is a key factor for winter wheat
that promotes androgenesis in the culture of isolated anthers and the successful formation of intact plants.
Acknowledgment: The reported study was funded by RFBR, project number 20-34-80003.
Keywords: winter wheat, isolated anther culture, induced androgenesis, haploid, embryoid-like structures, calli, initial media, cold treatment.
For citation: Lyubushkina I.V., Pomortsev A.V., Polyakova M.S., Arbuzova G.A., Voinikov V.K., Anapiyaev B. B. Influence of Initial Media and Duration of Cold Pretreatment on the Efficiency of Androgenesis in the Culture of Isolated Anthers of Winter Wheat (Triticum aestivum L.) Variety Irkutskaya. The Bulletin of Irkutsk State University. Series Biology. Ecology, 2020, vol. 34, pp. 20-32. https://doi.org/10.26516/2073-3372.2020.34.20 (in Russian)
References
Anapiyayev B.B. Kultura mikrospor i gaploidnaya biotekhnologiya pshenitsy [The microspores culture and haploid biotechnology of wheat]. Almaty, 2001, 220 p. (in Russian)
Zhonosar M.V. Optimizatsiia tekhnologii polucheniia udvoennykh gaploidov miagkoi-pshenitsy razlichaiushchikhsia po genam fotoperiodicheskoi chuvstvitelnosti (Ppd) I prodolzhite-lnosti iarovizatsii (Vrd) [Optimization of the technology for obtaining doubled haploids of common wheat, differing in genes for photoperiodic sensitivity (Ppd) and duration of vernalization (Vrd): Candidate in Biology dissertation abstract]. Odessa, 2009, 20 p. (in Russian)
Pershina L.A., Osadchaya T.S., Badaeva E.D., Belan I.A., Rosseeva L.P. Izuchenie oso-bennostei androgeneza v kulture pyl'nikov sortov i perspektivnoi formy yarovoi myagkoi pshenitsy zapadnosibirskoi selektsii, razlichayushchikhsya nalichiem ili otsutstviem pshenich-no-chuzherodnykh translokatsii [Features of androgenesis in anther cultures of varieties and a promising accession of spring common wheat bred in west siberia differing in the presence or absence of wheat-alien translocations]. Vavilovskij zhurnal genetiki i selekcii [Vavilov J. Genet. Breed.], 2013, vol. 17, no. 1, pp. 40-49. (in Russian)
Razmakhnin E.P., Razmakhnina T.M., Kozlov V.E., Gordeeva E.I., Goncharov N.P., Galitsyn G.Y., Veprev S.G., Chekurov V.M. Poluchenie vysokomorozostoikikh form pshenichno-pyreinykh gibridov [Raise of high frost-resistant Agropyron-Triticum hybrids]. Vavilovskij zhurnal genetiki i selekcii [Vavilov J. Gen. Breed.], 2012, vol. 16, no. 1, pp. 240249. (in Russian)
Bhojwani S.S., Dantu P.K. Haploid plants. Plant Cell Culture: Essential Methods. N. Y., John Wiley & Sons., 2010, pp. 61-78. https://doi.org/10.1002/9780470686522.ch4
Bohanec B. Doubled Haploids via Gynogenesis. Advanced in haploid production in higher plants. Dordrecht, SpringerScience + BusinessMedia, 2009, pp. 47-65. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-8854-4_2
Chaudhary H.K., Dhaliwal I., Singh S., Sethi G.S. Genetics of androgenesis in winter and spring wheat genotypes. Euphytica, 2003, vol. 132, pp. 311-319. https://doi.org/10.1023/A:1025094606482
Chuang C.C., Ouyang J.W., Chia H., Chou S.M., Ching C.K. A set of potato media for wheat anther culture. Proc. of Symposium on Plant Tissue Culture. Peking, Sci. Press., 1978, pp. 51-56.
Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of wheat and barley. Can. J. Biochem., 1968, vol. 46, no. 5, pp. 417-421. https://doi.org/10.1139/o68-063
Grauda D., Mikelsone A., Lisina N., Zagata K., Ornicans R., Fokina O., Lapina L., Ra-shal I. Anther culture effectiveness in producing doubled haploids of cereals. Proc. Latv. Acad. Sci. Sect. B, 2014, vol. 68, pp. 142-147. https://doi.org/10.2478/prolas-2014-0016
Hu T., Kasha K.J. Improvement of isolated microspore culture of wheat (Triticum aestivum L.) through ovary co-culture. Plant Cell Rep., 1997, vol. 16, pp. 520-525. https://doi.org/10.1007/BF01142316
Islam S.M.S., Tuteja N. Enhancement of androgenesis by abiotic stress and other pre-treatments in major crop species. Plant science, 2012, vol. 182, pp. 134-144. https://doi.org/10.10167j.plantsci.2011.10.001
Kasha K.J., Simion E., Oro R., Yao Q.A., Hu T.C., Carlson A.R. An improved in vitro technique for isolated microspore culture of barley. Euphytica, 2001, vol. 120, pp. 379-385. https://doi.org/10.1023/A:1017564100823
Lantos C., Jancso M., Pauk J. Microspore culture of small grain cereals. Acta Physiol. Plant. 2005, vol. 27, pp. 631-639. https://doi.org/10.1007/s11738-005-0067-6
Marsolais A.A., Seguin-Swartz G., Kasha K.J. The influence of anther cold pretreat-ments and donor plant genotypes on in vitro androgenesis in wheat (Triticum aestivum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1984, vol. 3, pp. 69-79. https://doi.org/10.1007/BF00035922
Niroula R.K., Bimb H.P. Overview of wheat X maize system of crosses for dihaploid Induction in wheat. WASJ, 2009, vol. 7, no 8, pp. 1037-1045.
Olmedilla A. Microspore embryogenesis. Plant Development Biology - Biotechnological Perspectives. Heidelberg, Springer-Verlag, 2010, vol. 2, pp. 27-44. https://doi.org/10.1007/978-3-642-04670-4_2
Pauk J., Mihaly R., Puolimatka M. Protocol for wheat (Triticum aestivum L.) anther culture. Doubled Haploid Production in Crop Plants. Dordrecht, Springer Science+Business Media Publ., 2003, pp. 59-64. https://doi.org/10.1007/978-94-017-1293-4_10
Soriano M., Li H., Boutilier K. Microspore embryogenesis: establishment of embryo identity and pattern in culture. Plant Reprod., 2013, vol. 26, pp. 181-196. https://doi.org/10.1007/s00497-013-0226-7
Touraev A., Ilham A., Vicente O., Heberle-Bors E. Stress induced microspore embryogenesis in tobacco: an optimized system for molecular studies. Plant Cell Rep., 1996, vol. 15, pp. 561-565. https://doi.org/10.1007/BF00232453
Weigt D., Kiel A., Siatkowski I., Zyprych-Walczak J., Tomkowiak A., Kwiatek M. Comparison of the androgenic response of spring and winter wheat (Triticum aestivum L.). Plants, 2020, vol. 9, no. 1, pp. 49. https://doi.org/10.3390/plants9010049
Wedzony M., Forster B.P., Zur I., Golemiec E., Szechynska-Hebda M., Dubas E., Got^biowska G. Progressed in doubled haploid technology in higher plants. Advances in haploid Production in Higher Plants. Heidelberg, Springer-Verlag, 2009, pp. 1-34. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-8854-4_1
Zamani I., Kovacs G., Gouli-Vavdinoudi E., Roupakias D.G., Barnabas B. Regeneration of fertile doubled haploid plants from colchicine-supplemented media in wheat anther culture. Plant Breed, 2000, vol. 119, pp. 461-465. https://doi.org/10.1046/j.1439-0523.2000.00538.x
Любушкина Ирина Викторовна кандидат биологических наук, научный сотрудник Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН Россия, 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 доцент
Иркутский государственный университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, e-mail: ostrov1873@yandex.ru
Поморцев Анатолий Владимирович кандидат биологических наук,
Lyubushkina Irina Viktorovna Candidate of Science (Biology), Research Scientist
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS 132, Lermontov st., Irkutsk, 664033, Russian Federation Assistant Professor Irkutsk State University 1 1, K. Marx st., Irkutsk, 664033, Russian Federation e-mail: ostrov1873@yandex.ru
Pomortsev Anatolii Vladimirovich Candidate of Science (Biology),
научный сотрудник Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН Россия, 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 e-mail: pomorcevanatolii@mail.ru
Полякова Марина Станиславовна
ведущий инженер
Сибирский институт физиологии
и биохимии растений СО РАН
Россия, 664033, г. Иркутск,
ул. Лермонтова, 132
e-mail: poljakova.m@gmail.com
Арбузова Галина Андреевна ведущий инженер Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН Россия, 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 магистрант
Иркутский государственный университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 e-mail: mingronland@mail.ru
Войников Виктор Кириллович доктор биологических наук, научный руководитель института Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН Россия, 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 e-mail: vvk@sifibr.irk.ru
Research Scientist
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
'32, Lermontov st., Irkutsk, 664033,
Russian Federation
e-mail: pomorcevanatolii@mail.ru
Polyakova Marina Stanislavovna Lead Engineer
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
'32, Lermontov st., Irkutsk, 664033,
Russian Federation
e-mail: poljakova.m@gmail.com
Arbuzova Galina Andreevna Lead Engineer
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS '32, Lermontov st., Irkutsk, 664033, Russian Federation Undergraduate Student Irkutsk State Univercity ', K. Marx st., Irkutsk, 664003, Russian Federation e-mail: mingronland@mail.ru Voinikov Victor Kirillovich Doctor of Sciences (Biology), Scientific Director
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS '32, Lermontov st., Irkutsk, 664033, Russian Federation e-mail: vvk@sifibr.irk.ru
Анапияев Бахытжан Бейсенбекович Anapiyaev Bahytzhan Beisenbekovich
доктор биологических наук Doctor of Sciences (Biology)
Казахский национальный исследовательский Satbayev University технический университет им. К. И. Сатпаева>22a, Satpaev st., Almaty, 050013,
050013, Казахстан, г. Алматы, Kazakhstan
ул. Сатпаева, 22а e-mail: bak_anapiyayev@mail.ru e-mail: bak_anapiyayev@mail.ru
Дата поступления: 27.08.2020 Received: August, 27, 2020
