CC BY
45
УДК 631.531.027.3:631.559:581.143
В. А. Павлова, Е. Э. Нефедьева, В. И. Лысак, И. Г. Шайхиев
ВЛИЯНИЕ ИМПУЛЬСНОГО ДАВЛЕНИЯ НА НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
СЕМЯН ГРЕЧИХИ ПРИ ПРОРАСТАНИИ
Ключевые слова: гречиха, импульсное давление, активность каталазы, всхожесть, дыхание.
Исследовано влияние импульсного давления на всхожесть, активность каталазы и интенсивность дыхания семян гречихи. Показано, что большей чувствительностью к обработке ИД отличаются семена из партий с изначально низкой всхожестью. Установлено, что стрессовая реакция на обработку в виде изменения всхожести согласуется с изменением активности каталазы в обработанных семенах. При высоких значениях ИД происходит нелинейное понижение активности каталазы и повышение интенсивности дыхания, что приводит к накоплению активных форм кислорода и развитию постгипоксического стресса.
Keywords: buckwheat, pulse pressure, catalase activity, germination, respiration intensity.
The influence of pulse pressure (PP) on germination, catalase activity and respiration rate of buckwheat seeds has been investigated. It has been shown that seeds from parties with initially low germination had higher sensitivity to PP processing. The stress response to the treatment which expressed in changes of germination was in accordance with the change of the catalase activity in the treated seeds. Nonlinear decrease of catalase activity and increase of the respiration rate under high values of PP led to accumulation of reactive oxygen and development of post-hypoxic stress.
Введение
В настоящее время существует проблема разнонаправленного действия больших и малых доз физических факторов на растения, вызывающих соответственно неадаптивные (повреждение) или адаптивные реакции. Проблеме стимулирующего действия малых доз посвящены многочисленные исследования [1-4].
В качестве фактора, действующего на растения, было выбрано импульсное давление (ИД)
[5]. При детонации взрывчатого вещества возникает ударная волна, которая передается через воду на семена и создает объемное сжатие в течение 14-25 мксек. Малая продолжительность действия давления позволяет назвать его импульсным.
Давление влияет на различные процессы у растений. Изменения осмотического давления могут вызывать стрессовые симптомы в растениях, в то время как нормальное осмотическое давление -важный фактор в клеточном развитии, росте и поглощении воды [6]. Флоэмный транспорт веществ
[6] и транспорт газов в стеблях погруженных водных растений [8] управляются градиентами давления. Давление и механические воздействия также являются факторами регуляции роста и развития растений [9, 10]. Особенности ИД заключаются в том, оно представляет собой объемное сжатие в течение 15-25 мксек, поэтому не приводит к грубым механическим нарушениям.
Важно отметить, что обработка семян, находящихся в состоянии покоя, импульсным давлением вызывает последующие изменения. Ввиду отсутствия возможности репарации у воздушно-сухих семян физические воздействия в малых дозах оставляют в семенах скрытые повреждения, которые реализуются во время перехода клеток в жизнедеятельное состояние.
Повреждения семян, вызванные действием разнообразных физических факторов, по многим
признакам имеют сходство со старением семян. В частности, в обоих случаях отмечается уменьшение всхожести семян [11-13]. Причинами старения считают окислительный стресс, с одной стороны, и неферментативные реакции, с другой стороны [3, 11-14].
При длительном хранении семена стареют, т.е. утрачивают всхожесть за счет накопления повреждений [3]: нарушения целостности мембран, повреждения ДНК [15] за счет неферментативного гликозилирования белков [16] и окислительных процессов [17]. Показано, что естественное старение семян сопровождается снижением активности супероксиддисмутазы, пероксидазы, каталазы и дегидрогеназ, а также увеличением содержания малонового диальдегида [12].
Из естественно состарившихся семян гороха (Pisum sativum L.), огурца (Cucumis sativus L.) и гречихи (Fagopyrum esculentum Moench.) методом фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ) выделили фракции семян, отличающиеся по качеству: фракцию I - сильные семена, фракцию II -ослабленные семена и фракцию III - мертвые семена. Методом термохемилюминесценции (ТХЛ) в области 50-110 °С установлено, что ПОЛ не является причиной перехода семян из фракции I во фракцию II. Обнаружено увеличение содержания продукта гидролиза олигосахаридов (глюкозы) в семенах фракции II по сравнению с фракцией I. Следовательно, переход воздушно-сухих семян из фракции I во фракцию II происходит при активации гидролиза углеводов у стареющих семян. Поскольку при старении в воздушно-сухих семенах нет свободной воды, при гидролизе их влажность уменьшается, вероятно, за счет участия связанной воды в реакции гидролиза. Уменьшение содержания глюкозы в "улучшенных" семенах и увеличение их влажности указывает на активацию аминокарбонильной реакции, которая ответственна
за «закрывание» водных каналов в «улучшенных» семенах и уменьшение проницаемости клеточных мембран семян для воды при набухании [3].
Показана термодинамическая возможность протекания неферментативных процессов гидролиза сложных углеводов, продукты которых ингибировали всхожесть семян при действии ИД и естественном старении семян [18].
Процессы, идущие при прорастании семян, требуют затрат энергии. Источником энергии являются запасные питательные вещества, которые предварительно расщепляются гидролазами до мономеров, окисляемых с участием дыхательных ферментов. В растительных клетках имеется дыхательная цепь с терминальной
цитохромоксидазой. Другие оксидазные и оксидоредуктазные системы - альтернативная терминальная оксидаза, аскорбатоксидазы, полифенолоксидазы, флавопротеиновые оксидазы и другие аэробные дегидрогеназы - способны передавать электроны от окисляемого субстрата на кислород с образованием воды и активных форм
кислорода (АФК): гидропероксида (Н2О2) и
•
супероксидного анион-радикала О2 [18]. Накопление этих веществ происходит за счет окислительно-восстановительных систем клетки и вторичных реакций. В настоящее время исследователи уделяют внимание роли антиоксидантных систем в стрессе [11].
Высокие концентрации гидропероксида и других АФК приводят к разрушению структур клетки, поэтому в растении имеются ферменты, которые утилизируют гидропероксид: каталаза, пероксидаза, полифенолоксидаза [19]. Поскольку АФК разрушаются с участием ферментов, представляло интерес оценить активность каталазы в прорастающих семенах (рис. 1, [20;21]).
В семенах Glycine max L. в условиях ускоренного старения (при температуре 40°С и относительной влажности 100%) скорость дыхания, скорость образования O2 и содержание H2O2 в зародышевых осях возрастали, достигали максимума на 10-й день ускоренного старения и впоследствии снижались. Активность
супероксиддисмутазы, аскорбатпероксидазы,
каталазы, глутатионредуктазы в зародышевых осях снижалась, а содержание малонового диальдегида заметно возрастало [22].
Предпосевная обработка семян кукурузы гидропероксидом водорода H2O2 (20, 40, 60, 80, 100, 120, и 140 мМ) способствовала увеличению всхожести и увеличению содержания белка, H2O2, малонового диальдегида и аскорбиновой кислоты в растениях в условиях водного дефицита. Также увеличилась активность антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы. Воздействие H2O2 способствовало активации антиоксидантной системы и повышению устойчивости растений к засухе [12].
При старении ослабляется антиоксидантная система у семян (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза), также снижается содержание
растворимых сахаров и белков. Активность ферментов изменяется во времени. Через 3 дня активность ферментов снизилась незначительно, снизилась электропроводность водной вытяжки из семян, а также всхожесть. Механизмы повреждения заключаются в повреждении антиоксидантной системы, снижение содержания питательных веществ, повреждение мембран [22].
Целью настоящей работы является установление влияния обработки импульсным давлением на всхожесть, активность каталазы и интенсивность дыхания семян гречихи.
Материалы и методы исследования
В экспериментах использовали растения гречихи (Fagopyrum асикп^т Мввпск.).
Семена обрабатывали импульсным давлением (ИД). Для обработки семян растений использовали ИД от 3 до 50 МПа. Семена, прошедшие обработку, хранили в упаковке из бумаги или ткани в сухом темном месте при комнатной температуре.
Определение всхожести проводили согласно ГОСТ 12038-84, отбирая четыре-пять проб по 100 семян.
Для определения активности каталазы по А.Н. Баху и А.И. Опарину 5-10 г гомогената семян количественно переносили в мерную колбу на 100 мл, добавляя воду (до метки) и карбонат кальция на кончике шпателя до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Ферменты экстрагировали 30-60 мин, затем фильтровали. В колбу наливали с помощью пипетки 10 мл 0,1 н пероксида водорода, добавляли 10 мл ферментного препарата. Через 30 мин действие фермента прекращали добавлением 3 мл 10%-ного раствора серной кислоты. Смесь титровали 0,1 н. раствором перманганата калия до образования устойчивого (не менее 1 мин) розового окрашивания. Титр КМп04 устанавливали по щавелевой кислоте. Одновременно ставили контрольный опыт. Ферментный раствор доводили до кипения, охлаждали и переносили 10 мл инактивированного раствора в колбу с 10 мл 0,1 н пероксида водорода. Остальные операции проводили аналогично первому опыту. По разности между опытным и контрольным титрованием находили количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода. Расчет вели в соответствии с уравнением реакции:
5Н2О2 + 2КМЮ4 + 3H2SO = = 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O,
(1)
согласно которому 1 мл 0,1 н. раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода. Активность каталазы выражали в мг Н2О2-мин-1-г-1. Опыт проводили в четырехкратной повторности в сухих (0 час) и прорастающих семенах (24, 48, 72 час).
Для определения интенсивности дыхания использовали метод Бойсена-Иенсена. Навеску выполненных плодов (1 г) помещали в мешочки из синтетического материала и проращивали в течение 6 час. Далее мешочки подвешивали в колбах с
притертыми пробками объемом 150 мл с 10 мл 0,02н раствора Ва(ОН)2. Одновременно с опытными колбами ставили и холостые (без плодов). Продолжительность экспозиции - 1 час. По окончании экспозиции избыток Ва(ОН)2 оттитровывали 0,02н соляной кислотой в присутствии фенолфталеина. По разности между опытным и контрольным титрованием находили количество гидроксида бария, эквивалентное количеству выделившегося СО2.
Интенсивность дыхания выражали в мкг СО2-г-1-ч-1.
Результаты и их обсуждение
Одним из важных физиологических и хозяйственных показателей является всхожесть семян. Изменение всхожести семян зависит как от дозы действующих факторов, так и от состояния самих семян. Семена разных видов растений проявляют неодинаковую чувствительность к воздействиям [24].
В опытах использовали семена с различной исходной всхожестью, что позволило классифицировать результаты (рис. 1) и выявить зависимость реакции семян на ИД от их исходного состояния.
100 1 90 -
0 70 -
е
1 50 ^
§ 40 №
30 -20 -10 0
120 100
60 -
11 14 17 20 23 26 29 Давление, МПа
I 40
О
в
Я 20
О 8 11 14 17 20 23 26 29 Давление, МПа
Рис. 1 - Изменение всхожести семян гречихи под влиянием ИД в зависимости от исходной всхожести: а - изменение всхожести, %; б -изменение всхожести, выраженное в % от контроля. 1 - семена с исходной всхожестью 8793%, 2 - семена с исходной всхожестью 80-87%, 3 - семена с исходной всхожестью 70%
На рис. 1 показано, что семена гречихи с различной исходной всхожестью неодинаково реагировали на ИД. В частности, у семян с исходной всхожестью около 90 % (рис.1, а, кривая 1) была обнаружена немонотонная зависимость: показатель закономерно убывал в диапазоне ИД 11-23 МПа, причем при 23 МПа были выявлены значительные колебания. При дальнейшем повышении ИД амплитуда колебаний снижалась, а всхожесть даже несколько увеличивалась при 29 МПа. Следует отметить, что у семян с высокой исходной всхожестью обнаружено наибольшее снижение этого показателя под влиянием ИД (рис.1, б, кривая 1).
У семян с исходной всхожестью 80-85 % (рис. 1, а, кривая 2) амплитуда колебаний всхожести под влиянием ИД была меньше, чем в предыдущем варианте, динамика была монотонной. Обнаружена стимуляция всхожести семян при ИД 11 МПа. Действие ИД вызвало меньшее снижение всхожести у данной группы семян по сравнению с предыдущей (рис. 1, б, кривая 2).
Для семян с исходной всхожестью 70 % также было характерно увеличение всхожести при ИД 11 МПа и дальнейшее снижение этого показателя при ИД 17-35 МПа (рис. 1, а, кривая 3). Относительное снижение всхожести, выраженное в процентах от контроля (или исходной всхожести) в этом варианте было минимальным (рис. 1, б, кривая 3). Отметим, что изменение всхожести, выраженное в процентах от контроля, в меньшей степени зависело от качества семян, и в большей степени -от величины ИД.
Приведенные результаты указывают на то, что отдельные семена проявляли неодинаковую чувствительность к воздействию. В выборке присутствуют всхожие, ослабленные и мертвые семена, причем при хранении доля всхожих семян уменьшается за счет увеличения прочих [3]. Видимо, к стимуляции более чувствительны ослабленные семена, представительство которых больше в партиях семян со сниженной исходной всхожестью.
Несмотря на то, что ослабленные семена отличаются большей чувствительностью к условиям окружающей среды, в полевых условиях всхожесть опытных и контрольных семян гречихи на 8-е сутки не отличалась.
Появление колебаний всхожести гречихи при ИД 23 МПа в партиях семян с высокой исходной всхожестью указывал на их переход в нестабильное состояние, а дальнейшее снижение амплитуды этих колебаний свидетельствовало о состоянии стресса [27]. Поскольку для семян со сниженной исходной всхожестью такие колебания были менее характерны, стрессу в большей степени были подвержены живые, а не ослабленные семена. Состояние ослабленных семян, видимо, напротив, стабилизировалось.
Из рис. 2 видно двухфазное увеличение активности каталазы в контроле в течение прорастания семян (кривая 1). В течение 48 час прирост активности был меньше, чем после 48 час. При ИД 11 МПа (кривая 2) зависимость по форме
кривой соответствовала контролю, но абсолютные значения были ниже после 24 час. Торможение могло быть связано либо со снижением интенсивности дыхания, либо было вызвано стрессовыми сигналами и приводило к накоплению АФК. При ИД 29 МПа (кривая 3) выявлено увеличение активности каталазы в 24 час и последующее закономерное снижение. Через 72 час прорастания активность каталазы при 29 МПа была в 7 раз ниже, чем в контроле. Колебания активности фермента в этом варианте могут указывать на нарушение обмена веществ. Поскольку каталазу относят к ферментам, защищающим клетки при стрессе, раннее увеличение ее активности при ИД 11 МПа можно считать защитным. Напротив, снижение активности фермента при ИД 29 МПа, вероятно, способствовало развитию окислительного стресса. Повреждения, полученные семенами при обработке ИД, были реализованы в процессе прорастания. Отметим, что торможение прорастания семян соответствовало изменению активности фермента. Следовательно, если развитие стрессовой реакции на ИД приводит к снижению всхожести, то важным механизмом этой реакции является изменение активности каталазы.
О -I-1-1-1-1
О 24 48 72
Время, час
Рис. 2 - Влияние ИД на активность каталазы прорастающих семян гречихи: 1 - контроль, 2 -11 МПа, 3 - 29 МПа
Интенсивность дыхания - показатель энергетического состояния прорастающих семян -зависит от внешних и внутренних условий. ИД оказало влияние на интенсивность дыхания прорастающих семян [20]. Как видно из рис. 3, через 6 час набухания наименьшая интенсивность дыхания была в контроле (72 мкг СО2т-1-ч-1). При дальнейшем прорастании интенсивность дыхания увеличивалась на 41,7-59,7 % в возрасте 12 час и 24 час соответственно по сравнению с уровнем 6 час. Интенсивность дыхания при ИД 11 МПа превосходила контроль через 6 час на 11,1 %, а через 12 час - на 22,5 %, а при ИД 29 МПа -соответственно на 12,5 % и 38,2 % [20]. Видимо, незначительное увеличение интенсивности дыхания при ИД 11 МПа имеет для растения адаптивное значение, а более существенное (при 29 МПа) может указывать на повреждения.
б 12 24 Время, час
Рис. 3 - Влияние ИД на интенсивность дыхания прорастающих семян гречихи: 1 - контроль, 2 -11 МПа, 3 - 29 МПа [22]
Сопоставляя данные, полученные при исследовании активности каталазы и интенсивности дыхания, можно заключить, что при слабом воздействии (11 МПа) раннее увеличение активности каталазы имело адаптивное или, что более вероятно, сигнальное значение; адаптивным было также незначительное увеличение интенсивности дыхания. Через 24 час активность каталазы и интенсивность дыхания снизились, что объясняло раннее торможение роста, которое, вероятно, имело временный характер. Высокое ИД (29 МПа) вызвало качественно иную реакцию, выражающуюся в снижении активности каталазы до начала проращивания, последующем (24 час) усилении дыхания и активности каталазы и, затем, резком снижении активности названного фермента. Можно предположить, что в этот период происходило стрессовое накопление АФК и более глубокое повреждение клеток. Отметим особо, что причиной повреждения являлось не первичное действие ИД, а последующее развитие стрессовых реакций (торможение роста, накопление продуктов расщепления запасных веществ семени, торможение роста). Дыхание - важный процесс при прорастании [25, 26], но его побочными продуктами являются активные формы кислорода (АФК). Постгипоксический окислительный стресс в семенах ведет к образованию ненормальных проростков [27]. Увеличение активности каталазы в контроле после 48 час проращивания согласовывалось с данными о развитии постгипоксического стресса [13]. При ИД 11 МПа этот подъем отсутствовал, интенсивность дыхания незначительно превышала контроль, могло происходить накопление АФК. При ИД 29 МПа активность каталазы увеличивалась в 24 час, затем снижалась и через 72 час была в 7 раз ниже, чем в контроле, а интенсивность дыхания возрастала, что могло вести к накоплению АФК и развитию постгипоксического окислительного стресса [13], тормозящего прорастание семян.
Проведенные исследования позволяют сделать следующие выводы.
1. Всхожесть семян под влиянием возрастающих доз ИД характеризуется зависимостью, включающей два метастабильных состояния и область
перехода. Всхожесть в первом метастабильном состоянии при ИД 3-20 МПа практически не изменялась, в области перехода (ИД 20-26 МПа) снижалась линейно до 30-60%, во втором метастабильном состоянии (29-35 МПа) оставалась стабильно низкой (менее 30-60% для отдельных видов растений). Колебания всхожести в переходной области указывали на нестабильное состояние, а снижение амплитуды колебаний во втором метастабильном состоянии свидетельствовало о состоянии стресса.
2. В первом метастабильном состоянии при ИД 11 МПа интенсивность дыхания незначительно превышала контроль, могло происходить накопление АФК. Во втором метастабильном состоянии при ИД 29 МПа активность каталазы увеличивалась в 24 час, затем резко снижалась, а интенсивность дыхания возрастала, что могло вести к накоплению АФК и развитию постгипоксического окислительного стресса, тормозящего прорастание семян.
Литература
1. A.M. Kuzin, Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 123, 4, 313-315 (1997).
2. S. Geras'kin, A. Oudalova, T. Evseeva, Journal of Environmental Radioactivity, 121, 22-32 (2013).
3. V. A. Veselovsky, T. V. Veselova, Russian Journal of Plant Physiology, 59, 6, 811-817 (2012).
4. E.M. Mil, O.V. Myshlyakova, E.B. Burlakova, Biophysics, 50, 1, 69-73 (2005).
5. E. E. Nefed'eva , T.V. Veselova , V.A. Veselovsky , V.I. Lysak , European Journal of Molecular Biotechnology, 1, 1, 12-27 (2013).
6. G. Felix, M. Regenass, T. Boller, Plant Physiol., 124, 3, 1169-1180 (2000).
7. D. S. Fensom, R. G. Tompson, C. D. Caldwell, Russ. J. Plant Physiol., 41, 138-145 (1994).
8. F. Afreen, S. M. A. Zobayed, J. Armstrong, W. Armstrong, Journal of Experimental Botany, 58, 1651-1662
(2007).
9. J. Dumais, C. S. Steele, Journal of Plant Growth Regulation, 19, 7-18 (2000).
10. D. Kwiatkowska, Journal of Experimental Botany, 57, 3, 571-580 (2006).
11. R. Mitteler, Trends Plant Sci., 7, 405-409 (2002).
12. D. Raj, O.S. Dahiya, A.K. Yadav, R.K. Arya, K. Kumar, Indian Journal of Agricultural Sciences, 84, 2, 280-286 (2014).
13. T.V. Veselova, V.A. Veselovsky, V.B. Turovetsky, S.V. Galchuk, A.B. Rubin, B.F. Vanyushin, N.I. Aleksandrushkina, Seed Science and Technology, 32, 2, 283296 (2004).
14. V. A. Veselovsky, T. V.Veselova, Russian Journal of Plant Physiology, 59, 6, 811-817(2012).
15. J. D. Bewley, Plant Cell., 9, 1055-1066 (1997).
16. N.U.M. Murthy, W.Q. Sun, Journal of Experimental Botany, 51, 348, 1221-1228 (2000).
17. R. R. C. Stewart, J. D. Bewley, Plant Physiology, 65, 245248 (1980).
18. V. Pavlova, E. Vasichkina, E. Nefed'eva, V. Lysak, European Journal of Molecular Biotechnology, 1, 1, 38-44 (2013).
19. O.G. Polesskaya, E.I. Kashirina, N.D. Alekhina, Russian Journal of Plant Physiology, 53, 2, 186-192 (2006).
20. Н.Г. Мазей, дисс. канд. биол. наук, ННГУ им. Лобачевского, Н. Новгород, 2002, 26 с.
21. А.В. Шиленков, дисс. канд. биол. наук, ННГУ им. Лобачевского, Н. Новгород, 2006, 30 с.
22. X. Tian, S. Song, Y. Lei, Russian Journal of Plant Physiology, 55, 1, 33-40 (2008).
23. R.-Y. Yao, X.-F. Chen , Q.-Q. Shen, X.-X. Qu, F. Wang, X.-W. Yang, Chinese Traditional and Herbal Drugs, 45, 6, 844-848 (2014).
24. I. Bernal-Lugo, A. Leopold, Journal of Experimental Botany, 49, 1455-1461 (1998).
25. И.А. Хусаинов, А.В. Канарский, З.А. Канарская, М.А. Поливанов, Вестник Казанского технологического университета, 3,174-179 (2011).
26. Л.А. Ганеева, И.С. Докучаева, Вестник Казанского технологического университета, 6, 115-120 (2009).
27. V.A. Veselovsky, T.V. Veselova, D.S. Chemavsky, Plant Physiology, 40, 553 (1993).
© В. А. Павлова - аспирант кафедры «Промышленная экология и безопасность жизнедеятельности» Волгоградского государственного технического университета, [email protected]; Е. Э. Нефедьева - д.б.н., доцент кафедры «Промышленная экология и безопасность жизнедеятельноститого же ВУЗа, [email protected]; В. И. Лысак - д.т.н., член-корреспондент РАН, ректор того же ВУЗа, [email protected]; И. Г. Шайхиев - д.т.н., профессор, зав. кафедрой «Инженерная экология», Казанский национальный исследовательский технологический университет, [email protected].
© V. A. Pavlova - post-graduate student, department "Industrial ecology and life safety", Volgograd State Technical University, [email protected]; E.E. Nefedyeva - Ph.D., Associate Professor, department "Industrial Ecology and Life", Volgograd State Technical University, [email protected]; V. I. Lysak - Doctor of technical sciences, Professor, corresponding member of the Russian Academy of Sciences, department of "Equipment and technology of welding", Volgograd State Technical University, e-mail: [email protected]; I. G. Shaikhiev - Doctor of technical sciences, Professor, Head of "Environmental Engineering " department, Kazan National Research Technological University, [email protected].
