CC BY
60
УДК 615.214:616.45-001.1/.3
ВЛИЯНИЕ ИММУНОТРОПНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА АКТИВНОСТЬ МЕМБРАННЫХ ФЕРМЕНТОВ ЛИМФОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ КУРСОВОГО ВВЕДЕНИЯ ДОКСОРУБИЦИНА
В опытах на 228 беспородных крысах изучали динамику изменений активности мембранлокализованных ферментов АДА и 5'-НК в лимфоцитах мезентериальных лимфатических узлов на фоне курсового введения доксорубицина и профилактического применения иммуномодуляторов амиксина, имунофана и полиоксидония. Установлено, что курсовое введение доксорубицина в дозе 5 мг/кг приводит к разнонаправленным изменениям активности АДА и 5'-НК. При этом наиболее выраженные изменения ферментативной активности лимфоцитов развиваются после 4-разового введения цитостатика, а профилактическое применение амиксина, иммунофана и полиоксидония уменьшает выраженность указанных нарушений. Показано, что иммуномодулятор полиоксидоний наиболее радикально снижает индуцированные доксорубицином нарушения активности АДА и 5'-НК в лимфоцитах, что свидетельствует о его более выраженных мембранопротекторных свойствах.
Ключевые слова: доксорубицин, иммунокоррекция, активность мембранных ферментов лимфоцитов.
Работа является фрагментом НИР «Молекулярные механизмы дейсвия и конструирования биологически активних веществ (нейротропних, антивирусных, антимикробных) (№ госрегистрации 0102У001629).
Антибиотики из группы антрациклинов широко применяют в лечении гемобластозов и злокачественных новообразований различной локализации. Большинство схем комбинированного лечения злокачественных новообразований содержит противоопухолевый антибиотик доксорубицин, который, наряду с высокой эффективностью и широким спектром противоопухолевого действия, обладает высокой системной токсичностью [6, 8, 14]. Одним из наименее изученных объектов токсического действия доксорубицина является иммунная система, которая играет ключевую роль в обеспечении общей резистентности организма и генетической неизменности его внутренней среды. Поскольку клетки иммунной системы, в результате высокой пролиферативной активности, обладают повышенной чувствительностью к цитотоксическому действию доксорубицина, химиотерапия этим средством может дополнительно углублять негативные изменения иммунорезистентности и инициировать развитие серьезных инфекционных осложнений, которые имеют место в условиях онкопатологии. В связи с этим перспективным является поиск эффективных и безопасных путей снижения иммунотоксического действия доксорубицина без ослабления его специфической активности. Учитывая ведущую роль оксидативного стресса в механизмах цитотоксического действия доксорубицина, вполне логичным был поиск средств профилактики иммунотоксических эффектов этого препарата среди иммуномодуляторов с мембранотропной и антиоксидантной активностью. В этом плане особое внимание привлек отечественный индуктор эндогенного интерферона амиксин, а также современные иммуномодуляторы пептидной структуры имунофан и полиоксидоний [4, 7, 12, 13, 15]. Однако молекулярные механизмы иммунотропного действия указанных препаратов в условиях доксорубицин-индуцированных расстройств иммунитета фактически не исследовались.
Известно, что изменения активности мембранлокализованных ферментов лимфоцитов, в частности аденозиндезаминазы (АДА) и 5' - нуклеотидазы (5'-НК), может влиять на формирование и регуляцию иммунного ответа организма [10, 11]. Указанные ферменты являются липидзависимыми и их активность в значительной степени опосредована структурными изменениями мембран, которые, как известно, имеют место в условиях оксидативного стресса, индуцированного доксорубицином. Следовательно, определение изменений активности указанных ферментов в лимфоцитах, на наш взгляд, было актуальным как с целью изучения одного из вероятных патогенетических механизмов доксорубициновой иммуносупрессии, так и выяснения молекулярних механизмов иммунотропного действия исследуемых иммуномодуляторов.
Целью работы бшо изучить динамику изменений активности мембранлокализованных ферментов лимфоцитов АДА и 5'-НК на фоне курсового введения доксорубицина и профилактического применения иммуномодуляторов амиксина, имунофана и полиоксидония.
Материал и методы исследования. Экспериментальные исследования выполнены на 228 беспородных крысах массой 180-200 г, выращенных в питомнике вивария Одесского национального медицинского университета на стандартном рационе согласно санитарно - гигиеническими нормами и требованиями ОЬР. Все манипуляции на животных проводили согласно требованиям «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других © Москвичев Е.П., Рожковский Я.В., 2014
научных целей» (Страсбург, 1985). Доксорубициновую иммуносупрессию на животных моделировали в/м введением доксорубицина «АЯТБЫиМ» (Украша) в дозе 5,0 мг/кг один раз в неделю в течение 4-х недель [9]. В качестве иммунокорректоров использовали препараты: амиксин-1С «1нтерхим» (Украина) в дозе 2,0 мг/кг, в/брюшинно; имунофан «Бионокс» (РФ) - 20,0 мкг/кг, в/брюшинно; полиоксидоний «Бионокс» (РФ) - 0,3 мг/кг, в/брюшинно. Выбор доз препаратов базировался на даннях об их токсичности и эффективности как иммунотропных препаратов. Контрольная группа животных получала соответственно 0,5 мл воды для инъекций.
Активность аденозиндезаминазы (АДА) и 5' - нуклеотидазы (5'-НК ) исследовали в лимфоцитах мезентериальных лимфоузлов. Для этого выделенные и предварительно измельчённые лимфоузлы осторожно гомогенизировали в культуральной бреде до полного опустошения стромы. Полученную суспензию фильтровали и центрифугировали трижды при 800 g в течение 10 минут. Клетки выделяли в градиенте плотности фиколл - гипак. Использовали готовую среду разделения "Н181:орадие" (ё = 1,077 г/см3). Для этого на 3,0 мл указанной среды осторожно наносили 3,5 мл полученной суспензии клеток. Центрифугированием (30 мин при 300 g) получали следующие фракции: 1 - верхний слой, обогащенный лимфоцитами; 2 - нижний слой - эритроциты. Осторожно отделяли верхнюю фракцию и дважды отмывали клетки в среде Хэнкса. В полученных таким образом лимфоцитах изучали активность АДА и 5'-НК [2, 5]. Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью критерия Стьюдента [3].
Результаты исследования и их обсуждение. Исследования показали значительную зависимость изменения активности указанных ферментов от продолжительности курса доксорубицина (табл. 1).
Таблица 1
Изменения активности АДА и 5'-НК (нмоль/мин на 108 клеток) в лимфоцитах _мезентериальных лимфатических узлов (п= 8 -10) (М±т)_
Показатель Интактная группа Количество введений доксорубицина
1 раз 2 раза 3 раза 4 раза
Активность АДА 120,5+6,7 138,4+8,3* 93,3+7,0* 90,1+5,4* 68,8+5,7*
Активность 5'-НК 9,1+0,6 9,2+0,5 8,0+0,3* 13,1+0,8* 14,0+0,9*
Примечание: * - изменения достоверны по сравнению с интактной группой, (Р < 0,05).
В частности после однократного введения доксорубицина активность АДА в лимфоцитах мезентериальных ЛВ достоверно повышалась на 14,8 %, а активность 5' -НК оставалась неизменной. Двукратное введение цитостатика вызвало уменьшение активности АДА и 5'-НК относительно интактной группы соответственно на 22,6 % и 12,1 % (Р < 0,05). При трёхкратном введении доксорубицина дальнейшие изменения активности обоих ферментов приобретали обратный характер - повышение активности 5'-НК сопровождалось существенным снижением активности АДА. Максимальный характер подобных изменений фиксировался после 4-кратного введения цитостатика и составил относительно интактной группы +53,8 % для 5'-НК (Р < 0,05) и -42,9 % для АДА (Р < 0,05) (рис.1).
150 -i 100 -50 0
%
-50 --100 -
Интактные
1 раз
2 раза
3 раза
4 раза
Введения доксорубицина
—■—АДА —Ь- 5'-НК
Рис.1. Динамика изменений активности АДА и 5'-НК в лимфоцитах мезентериальных лимфатических узлов у крыс на фоне курсового введения доксорубицина в дозе 5,0 мг/кг (в % по сравнению с показателями интактной группы).
Известно, что активность 5'-НК находится в обратной связи с интенсивностью клеточного метаболизма. Так показано, что высокая активность этого фермента сопровождается низким содержанием в клетках РНК и включением в ДНК тимидина, что дало основание считать 5'-НК ферментом "деградации". Степень его активности практически полностью определяется функциональным состоянием мембраны и характером связи с её структурными элементами, особенно с фосфолипидами. При этом связь фермента с мембраной несет на себе "функцию подавления " его
активности [10, 11]. Существенная активация 5' -НК в лимфоцитах мезентериальных ЛВ в условиях доксорубицин - индуцированной иммуносупрессии свидетельствует не только о преобладании клеточного катаболизма в лимфоцитах, но и о возможном высвобождении этого фермента вследствие возможного перекисного повреждения мембраны. С другой стороны, повышению активности 5'-НК может способствовать и снижение вследствие оксидативного стресса уровня АТФ и креатинфосфата, которые являются естественными ингибиторами этого фермента [1, 10].
Таким образом, выявленные нарушения ферментативной активности и метаболизма лимфоцитов может выступать одним из важных факторов снижения функциональной активности этих клеток в иммунных реакциях.
Фармакологическая коррекция существенно смягчает инициированные доксорубицином нарушения ферментативной активности мембранных маркеров во все сроки наблюдения. На фоне профилактического введения исследуемых иммунокорректоров активность АДА и 5' -НК в лимфоцитах крыс в течение первых двух недель наблюдений достоверно не отличалась от уровня интактной группы. В условиях более глубоких ферментативных сдвигов, вызванных трех- и четырехкратным введением доксорубицина, профилактическая активность полиоксидония оказалась выше по сравнению с амиксином и имунофаном (табл.2 ).
Таблица 2
Влияние иммунотропных препаратов на изменения активности АДА и 5'-НК (нмоль/мин на
108 клеток) в лимфоцитах мезентериальных лимфатических узлов (п= 8 -10) (М±т)
Показатель Интактная група Контроль Иммунокорректоры
Амиксин Имунофан Полиоксидоний
Одноразовое введение доксорубицина
Активность АДА 120,5±6,7 138,4±8,3* 130,1±10,1 133,4±11,3 128,4±8,8
Активность 5'-НК 9,1±0,6 9,2±0,5 8,8±0,7 9,4±0,7 9,4±0,6
Двухразовое введение доксорубицина
Активность АДА 120,5±6,7 93,3±7,0* 113,5±9,7# 105,5±8,6 115,0±7,8#
Активность 5'-НК 9,1±0,6 8,0±0,3 9,4±0,7# 8,9±0,4# 9,0±0,7
Трёхразовое введение доксорубицина
Активность АДА 120,5±6,7 90,1±5,4* 100,4±9,7* 99,5±6,0* 102,3±8,7*
Активность 5'-НК 9,1±0,6 13,1±0,8* 11,8±0,9* 11,1±0,7*# 10,4±0,7#
Четырёхразовое введение доксорубицина
Активность АДА 120,5±6,7 68,8±5,7* 88,9±7,0*# 85,8±6,6*# 97,5±8,1*#
Активность 5'-НК 9,1±0,6 14,0±0,9* 11,5±1,1*# 12,0±0,5*# 10,8±0,6*#
Примгтки: 1. * - (Р< 0,05) по сравнению с интактной группой; 2. # - (Р< 0,05) по сравнению с интактной группой.
В частности у животных, которые на фоне 4-разового доксорубицина получали полиоксидоний, активность АДА превышала соответствующий показатель контрольной группы в 1,42 раза (Р < 0,05). При этом у животных без иммунокоррекции активность этого фермента снижалась почти вдвое - с 120,5±6,7 до 68,8±5,7 нмоль/мин на 108 лимфоцитов (Р < 0,05). Все иммунокорректоры предотвращали значительную активацию 5'-НК в лимфоцитах. Если после четырехкратного ввода доксорубицина максимальное отклонение от нормы активности АДА и 5' -НК составляло соответственно -42,9% (Р < 0,05) и +53,8 % (Р < 0,05), то на фоне профилактического введения полиоксидония соответствующие изменения ферментативной активности мембранных маркеров составляли -19,1 % (Р < 0,05) и +18,7 % (Р < 0,05), на фоне профилактического введения амиксина - 26,2 % (Р < 0,05) и +26,4 % (Р < 0,05), и у животных, получавших имунофан -соответственно -28,8 % (Р < 0,05) и +31,9 % (Р < 0,05) (Рис.2).
Рис. 2. Влияние иммуномодуляторов на изменения активности АДА и 5'-НК в лимфоцитах мезентериальных лимфатических узлов у крыс на фоне 4-разового введения доксорубицина в дозе 5,0 мг/кг (в % отклонения от показателей интактной группы).
По нашему мнению, подобное профилактическое воздействие исследуемых препаратов в условиях моделируемой иммуносупрессии объясняется прежде всего их антиоксидантными свойствами, способностью к активной коррекции нарушений компонентов липидной фазы мембран лимфоцитов. Вероятно, что при этом подобные свойства в полиоксидония по отношению к мембранам лимфоцитов выше, чем у амиксина и имунофана.
ж
1. Курсовое введение доксорубицина сопровождается разнонаправленными изменениями активности АДА и 5'-НК в лимфоцитах мезентериальных лимфатических узлов. Наиболее выраженные изменения ферментативной активности розвиваються после 4-разового введения цитостатика.
2. Одним из механизмов имунокоригирующего действия амиксина, иммунофана и полиоксидония в условиях экспериментальной доксорубицин - индуцированной иммуносупрессии является стабилизация активности ферментов обмена аденозина в лимфоцитах.
3. Полиоксидоний наиболее радикально устраняет индуцированные доксорубицином нарушения активности АДА и 5'-НК в лимфоцитах, что свидетельствует о его более выраженных мембранопротекторных свойствах.
Перспективы дальнейших исследований. Будут изучены механизмы иммунотоксичного действия доксорубицина и предложена их наиболее оптимальная коррекция с учётом индивидуальных особенностей действия иммуномодуляторов на разные звенья патогенеза указанных нарушений.
Ж
1.Барабой В. А. Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и при патологии / В. А. Барабой, Д. А. Сутковой // К.: Наукова думка, - 1997. - 420 с.
2.Дмитренко Н. М. Субклеточное распределение некоторых ферментов обмена аденозина и АМФ в лимфоцитах тимуса крысы / Н. М. Дмитренко, С. В. Комиссаренко, В. Ю. Уманский // Докл. АН УССР. Серия биология. - 1980. - № 4. - С. 68 -71.
3.Лапач С. Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Exel / С. Н. Лапач, А. В. Чубенко, П. Н. Бабич // - К.: Морион, - 2001. - 320 с.
4.Кктн £. В. Вивчення впливу штерфероногену «Амжсин-1С» на штерфероногенез i цитотоксичну актившсть КК-кл^ин у хворих на хрошчний гепатит С / £. В. Кктн, К. Л. Сервецький, К. М. Усиченко [та ш.] // Досягнення бюлогп та медицини. - 2008. - №2(12). - С. 4-8.
5. Рыбальченко В. К. Структура и функции мембран / В. К. Рыбальченко, М. М. Коганов // - Киев: Выща школа, - 1988. - 312 с.
6.Саенко Ю. В. Изучение органоспецифических механизмов оксидативного стресса: дис... на соиск. учён. степен. канд. биол. наук: 14.00.25 - фармакология / Ю.В.Саенко. - Ульяновск, - 2006. - 168 с.
7.Феденко А. Ф. Влияние некоторых иммуномодуляторов на иммунную систему и переносимость адъювантной химио- и лучевой терапии у больных раком молочной железы: дис. на соиск. учён. ст. канд. мед. наук: 14.00.14.- онкология / А. Ф. Феденко // - М., - 2007. - 181 с.
8.Фандеев О. А. Клиническое значение кардиотоксичности антрациклинов: современные подходы к диагностике, профилактике и лечению / О. А. Фандеев, С. С. Васечкин, М. Н. Алехин [и др.] // Кардиология. - 2011. - №7. - С.40-47. 9.Чекман I. С. Ефектившсть застосування тютриазолшу за умов доксорубщиново! кардюмюпатп / I. С. Чекман, Т. С. Трофiмова, I. А. Мазур [та ш.] // Запорожский медицинский журнал. - 2010. - Т.12,№5. - С.207-210.
10. Chalmers A. H. Lymphocyte 5'-ectonucleotidase: an indicator of oxidative stress in humans? / A. H. Chalmers, J. S. Blake-Mortimer, A. H. Winefield // Redox Rep. - 2000. - Vol. 5. - P. 89 - 91.
11. Colgan S. P. Physiological roles for ecto-5'-nucleotidase / S. P. Colgan, H. K. Eltzschig, T. Eckle [et al.] // Purinergic Signalling. - 2006. - Vol. 2, № 2. - P. 351 - 360.
12. Gein O. N. Influence of polyoxidonium on IL-1 beta, TNF-alpha and IL-6 production by mononuclears and monocytes under the dexamethasone effect / O. N. Gein, K. G. Gorshkova, S. V. Gein // Patol. Fiziol. Eksp. Ter. - 2010. - №1. - P.10-13.
13. Mar'in G. G. Effect of imunofan on several indexes of immunity and pyoderma incidence among cadets of educational institutes / G. G. Mar'in, V. G. Akimkin, V. A. Novikov [et al.] // Voen. Med. Zh. - 2009. - Vol.330, №9. - P.27-31.
14. Simtaek T. Anthracycline-induced cardiotoxicity: overview of studies examining the roles of oxidative stress and free cellular iron / T. Simtaek, M. Sterba, O. Popelova [et al.] // Pharmacol. Rep. - 2009. - Vol.61,№1. - P.154-171.
15. Silin D. S. Synthetic and natural immunomodulators acting as interferon inducers / D.S. Silin, O.V. Lyubomska, F.I. Ershov [et al.] // Current Pharmaceutical Design.- 2009. - Vol.15. - P.1238-1247.
ВПЛИВ 1МУНОТРОПНИХ ПРЕПАРАТ1В НА АКТИВШСТЬ МЕМБРАННИХ ФЕРМЕНТ1В Л1МФОЦИТ1В ЗА УМОВ КУРСОВОГО УВЕДЕННЯ ДОКСОРУБ1ЦИНУ Москвичов С. П., Рожковський Я. В.
В дослщах на 228 безпородних щурах дослщжували динамжу змш мембранлокалiзованих ферменив АДА i 5'-НК в лiмфоцитах мезентерiальних лiмфатичних вузлiв на фош курсового уведення доксорубщину i профшактичного
EFFECTS OF IMMUNOTROPIC PREPARATIONS ON ACTIVITY OF LYMPHOCYTES' MEMBRANE ENZYMES UNDER RATE INPUT DOXORUBICIN
Moskvichev E. P, Rozhkovsky Ya. V.
In experiments on 228 outbred rats studied the dynamics of changes in the activity of enzymes membran adenosine deaminase (ADA) and 5'-nucleotidase (5'-NK) lymphocytes in the mesenteric lymph nodes on the background
застосування iмуномодуляторiв амжсину, iмунофану i полiоксидонiю. Встановлено, що курсове уведення доксорубiцину в дозi 5 мг/кг призводить до рiзноспрямованих змiн активностi АДА i 5'-НК. При цьому найбiльш глибою змiни ферментативно1 активностi лiмфоцитiв проявляють себе пiсля 4-разового уведення цитостатика, а профiлактичне застосування амiксину, iмунофану i полiоксидонiю зменшуе виразнiсть вказаних порушень. Показано, що iмуномодулятор полюксидонш найбiльш ефективно знижуе iндукованi доксорубщином порушення активностi АДА i 5'-НК, що вказуе на його бшьш потужнi мембранопротекторнi властивостi стосовно лiмфоцитiв.
Ключовi слова: доксорубiцин, iмунокорекцiя, актившсть мембранних ферментiв лiмфоцитiв.
Стаття надшшла 10.06.2014 р.
of a course of administration of doxorubicin and the prophylactic use of immunomodulators amixin, imunofan and polyoxidonium. Established that the course administration of doxorubicin at a dose of 5 mg / kg resulted in a multidirectional changes the activity of ADA and 5'-NK. The most pronounced changes in the enzymatic activity of lymphocytes develop after 4 single administration of cytostatic and prophylactic amixin, immunofan and polyoxidonium and reduces the severity of such violations. It is shown that immunomodulator polioxidonium most radically reduces doxorubicin-induced activity of ADA violations and 5'-NK lymphocytes, which indicates its more pronounced membrane-protective properties.
Key words: doxorubicin, immunotherapy, activity of lymphocytes' membrane enzymes.
Pe^roeHT EoônpbOB B.M.
ВПЛИВ АМ1НОГУАН1ДИНУ НА ПОКАЗНИКИ СИСТЕМИ ОКСИДУ АЗОТУ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ ЦИРОЗ1 ПЕЧ1НКИ
Вивчали вплив амшогуашдину (10 мг/ кг i.m, 10 дшв) на показники системи оксиду азоту та морфолопчну структуру печшки при експериментальному цирозЦ викликаному тривали введенням тетрахлорметану. Встановлено, що розвиток циротичного ураження печшки, морфолопчно тдтвердженого наявшстю вираженого склерозу перипортальних полiв та формуванням псевдочасточок, супроводжуеться зниженням вмюту ендотелiальноï та наростанням шдуцибельно1 NO-синтази (iNOS), збшьшенням концентрацiï стабшьного метаболiту оксиду азоту нiтрит-анiону в кровi та ïï зменшення у печшщ. Активацiя показникiв системи оксиду азоту супроводжуеться зростанням продукцп прозапальних цитоюшв IL-1 в, IL-6 та TNF-a. Застосування селективного iнгiбiтора iNOS амшогуашдину при цирозi призводить до зниження вмюту нiтрит-анiону та iндуцибельноï NOS, як у кров^ так i у печшщ та зменшення вмюту TNF-a у кров^ Застосування препарату не призводить до значного покращення морфолопчного стану печiнки.
Ключов1 слова: амшогуашдин, оксид азоту, печшка, цироз.
Структурна перебудова органу та гшокс1я при цироз1 печшки ведуть до порушення внутрiшньопечiнковоï гемодинамши [1, 7]. Портальна гшертенз1я поступово призводить i до системних змш гемодинамши, до яких належать шдвищення частоти серцевих скорочень i серцевого 1ндексу, а також зменшення системного судинного опору.
Вщомо, що у патогенез! цирозу печшки, а саме, порушень системноï гемодинамши та розвитку метабол1чних порушень при данш патологiï, провщну роль вщ1грае оксид азоту. Вченими Valance i Moncada (1991) було висунуто гшотезу про те, що гшерпродукщя NO при цироз1 печшки пов'язана з1 зростанням ендотоксемИ, яка через систему цитоюшв стимулюе синтез оксиду азоту [14]. Результати шших дослщниюв засвщчили, що в умовах цирозу виникае зниження бюдоступност1 NO та наростання явищ органноï вазоконстрикцИ, що веде до розвитку портальноï гшертензи при дан1й патологiï [6, 13].
Метою роботи було вивчення рол1 системи оксиду азоту в патогенез1 циротичного ураження печ1нки нами було проведено дослщження впливу селективного шпб1тора синтезу NO ам1ногуан1дину на стан системи оксиду азоту та структуру печшки при експериментальному цироз1, що викликаний тривалим введенням тетрахлорметану.
Матер1ал i методи дослщження. В експерименп використано 18 бших щур1в-самц1в вагою вщ 220-300 г. Тварини перебували у в1вари ДВНЗ Терноп1льський державний медичний ушверситет 1м. 1.Я. Горбачевського МОЗ Украши» з контрольованим температурним режимом, на стандартному рац1он1 з вшьним доступом до 1ж1 та води i 12-годинним циклом день-шч. Робота з тваринами виконувалась зпдно Gвропейськоï конвенцiï про гуманне ставлення до лабораторних тварин [3]. Цироз печшки моделювали за методикою, описаною Kurabe S. та ствав [10]. 50 % розчин тетрахлорметану вводили перорально дв1ч1 на тиждень протягом 3-х м1сяц1в з розрахунку 2 мл на кг маси тварини. Амшогуашдин вводили щоденно повторно 1трапер1тонеально в доз1 10 мг/кг протягом протягом 10 дшв шсля заюнчення моделювання досл1ду [9]. Контрольн1й груш вводили вщповщний об'ем 1зотон1чного розчину. Декап1тац1ю тварин проводили п1д кетамшовим наркозом через 24 год шсля останнього введення засобу корекцй.
© Олещук О.М., 2014
