CC BY
53
10. Cheknev S.B., Apresova M.A., Efremova I.E., Piskovskaya L.S., Babayants A.A. Involvement of the y-globulin metal complexes in regulation of the interleukin-10 production. Immunologiya. 2013; 34 (4): 189-93. (in Russian)
11. Cheknev S.B., Apresova M.A., Moryakova N.A., Efremova I.E., Mezdrokhina A.S., Piskovskaya L.S., Babayants A.A. Production of the growth factors GM-CSF, G-CSF, and VEGF by human peripheral blood cells induced with metal complexes of human serum y-globulin formed with copper or zinc ions. Mediat. Inflamm. 2014; 2014: art. ID518625.
12. Winchurch R.A. Activation of thymocyte responses to interleukin-1 by zinc. Clin. Immunol. Immunopathol. 1988; 47: 174-80.
13. Mazzatti D.J., Uciechowski P., Hebel S., Engelhardt G., White A.J., Powell J.R. et al. Effects of long-term zinc supplementation and deprivation on gene expression in human THP-1 mononuclear cells. J. Trace Elem. Med Biol. 2008; 22: 325-36.
14. Cuturi M.C., Anegon I., Sherman F., Loudon R., Clark S.C., Perussia B., Trinchieri G. Production of hematopoietic colony-stimulating factors by human natural killer cells. J. Exp. Med 1989; 169 (2): 569-83.
15. Mallone R., Funaro A., Zubiaur M., Baj G., Ausiello C.M., Tacchetti C. et al. Signaling through CD38 induces NK cell activation. Intern. Immunol. 2001; 13 (4): 397-409.
16. Jain S.K., Rains J.L., Croad J.L. High glucose and ketosis (aceto acetate) increases, and chromium niacinate decreases, IL-6, IL-8, and MCP-1 secretion and oxidative stress in U937 monocytes. Antioxidants Redox Signal. 2007; 9: 1581-90.
17. Li X., Tai H.-H. Activation of thromboxane A2 receptor (TP) increases an expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)/ chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2) and recruits macrophages to promote invasion of lung cancer cells. PLoS One. 2013; 8 (1): e54073.
18. Sahoo M., Ceballos-Olvera I., del Barrio L., Re F. Role of the inflam-masome, IL-1P and IL-18 in bacterial infections. Scientific. World J. 2011; 11: 2037-50.
original article
19. Orjalo A.V., Bhaumik D., Gengler B.K., Scott G.K., Campisi J. Cell surface-bound IL-1a is an upstream regulator of the senescence-associated IL-6/IL-8 cytokine network. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106 (40): 17 031-6.
20. Schuhmann D., Godoy P., Weiss C., Gerloff A., Singer M.V., Dooley S., Böcker H. Interfering with interferon-y signaling in intestinal epithelial cells: selective inhibition of apoptosis-maintained secretion of anti-inflammatory interleukin-18 binding protein. Clin. Exp. Immunol. 2011; 163 (1): 65-76.
21. Slavic V., Stankovic A., Kamenov B. The role of inlerleukin-8 and monocyte chemotactic protein-1 in rheumatoid arthritis. Facta Universität. 2005; 12 (1): 19-22.
22. Tisoncik J.R., Korth M.J., Simmons C.P., Farrar J., Martin T.R., Katze M.G. Into the eye of the cytokine storm. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012; 76 (1): 16-32.
23. Villiger P.M., Terkeltaub R., Lotz M. Monocyte chemoatractant protein-1 (MCP-1) expression in human articular cartilage. J. Clin. Invest. 1992; 90: 488-96.
24. Deshmane S.L., Kremlev S., Amini S., Sawaya B.E. Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1): an overview. J. Interferon Cytokine Res. 2009; 29 (6): 313-26.
25. Bonfield T.L., John N., Malur A., Barna B.P., Culver D.A., Kavurn M.S., Thomassen M.J. Elevated monocyte chemotactic proteins 1, 2, and 3 in pulmonary alveolar proteinosis are associated with chemokine receptor suppression. Clin. Immunol. 2005; 114: 79-85.
26. Intemann C.D., Thye T., Förster B., Owusu-Dabo E., Gyapong J., Horstmann R.D., Meyer C.G. MCP1 haplotypes associated with protection from pulmonary tuberculosis. BMC Genet. 2011; 12: art. 34.
27. Gu L., Okada Y., Clinton S.K., Gerard C., Sukhova G.K., Libby P., Rollins B.J. Absence of chemoattractant protein-1 reduces atherosclerosis in low density lipoprotein receptor-deficient mice. Mol. Cell. 1998; 2: 275-81.
Поступила 07.12.15 Принята в печать 18.02.16
ЦИТОКИНЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 615.373:578.245].015.44
Шитикова О.Г.1, Шерстобоев Е.Ю.1, Масная Н.В.1, Данилец М.Г.1, Трофимова Е.С.1, Лигачева А.А.1, Мадонов П.Г.2, Киншт Д.Н.2, Ершов К.И.2, Шилова М.А.2
ВЛИЯНИЕ ИММОБИЛИЗИРОВАННОГО ИНТЕРФЕРОНА-а2Ь НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК IN VITRO
1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдбер-га», 634028, г. Томск; 2ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии», 630056, г Новосибирск
Добавление in vitro иммобилизированного интерферона-а2Ь (иммИФН-а2Ь) в дозах 15, 150 и 1500 МЕ/мл в культуру человеческих мононуклеаров не оказывало существенного влияния на фагоцитоз нейтрофилов, синтез иммуноглобулинов и пролиферативную активность лимфоцитов. При этом препарат сравнения реаферон-ЕС в отдельных дозах снижал пролиферацию лимфоцитов и индекс стимуляции В-клеток. ИммИФН-а2Ь, так же как и препарат сравнения реаферон-ЕС, не влиял на спонтанную и стимулированную продукцию IL-1 в и IL-4, но повышал выработку IL-2, а также иФН-y без дополнительной стимуляции митогеном. ИммИФН-а2Ь более эффективно, чем препарат сравнения реаферон-ЕС, усиливал стимулированную продукцию IL-2. При этом исследуемый препарат снижал функциональную активность естественных киллеров более значительно, чем препарат сравнения - реаферон-ЕС.
К л ю ч е в ы е с л о в а: иммобилизированный интерферон-а2Ь; мононуклеары; естественные киллеры.
Для цитирования: Шитикова О.Г., Шерстобоев Е.Ю., Масная Н.В., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Лигачева А.А., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Ершов К.И., Шилова М.А. Влияние иммобилизированного интерферона-а2Ь на функциональную активность иммунокомпетентных клеток in vitro. Иммунология. 2016; 37 (3): 155-161. DOI: 10.18821/02064952-2016-37-3-155-161
Для корреспонденции: Шитикова Ольга Геннадьевна, аспирант лаб. иммунофармакологии НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга, E-mail: [email protected]
оригинальные статьи
Shitikova O.G.1, Sherstoboev E.Yu.1, Masnaya N.V.1, Danilets M.G.1, Trofimova E.S.1, Ligacheva A.A.1, Madonov P.G.2, Kinsht D.N.2, Ershov K.I.2, Shilova M.A.2
EFFECT OF IMMOBILIZED INTERFERON ALPHA-2B ON FUNCTIONAL ACTIVITY OF IMMUNOCOMPETENT CELLS IN VITRO
'Federal State Budgetary Scientific Institution "E.D. Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine", 634028, Tomsk; 2"Siberian Center for Pharmacology and Biotechnology", Novosibirsk, 630056
Adding in vitro immobilized interferon alfa-2b in doses 15, 150 and 1500 IU/ml to the culture of human mononuclear cells had no significant effect on phagocytosis of neutrophils, synthesis of immunoglobulins and proliferative activity of lymphocyte. Reaferon EC was taken as a reference drug. In certain individual doses it decreased the lymphocyte proliferation and stimulation index of B-cells. Immobilized interferon alfa-2b, as well as the reference drug reaferon EC, had no effect on spontaneous and stimulated the production of IL-1P and IL-4, but increased the production of IL-2 and IFN-y without any additional stimulation by mitogen. The immobilized interferon alfa-2b was found to be more efficient than the reference drug reaferon EC in intensification of stimulated production of IL-2. The investigated drug (immobilized interferon alfa-2b) has reduced the functional activity of natural cell-killers mush more than the reference drug (reaferon EC).
Keywords: immobilized interferon alfa-2b; mononuclear cells; cytokines; natural killer.
For citation: Shitikova O.G., Sherstoboev E.Yu., Masnaya N.V., Danilets M.G., Trofimova E.S., Ligacheva A.A., Madonov P.G., Kinsht D.N., Ershov K.I., Shilova M.A. Effect of immobilized interferon alpha-2b on functional activity of immunocompetent cells in vitro. Immunologiya. 2016; 37 (3): 155-161. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-3-155-161
For correspondence: Shitikova Ol'ga Gennad'evna, postgraduate student of the laboratory of immunopharmacology "Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine named after E.D. Goldberg", E-mail: [email protected]
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Funding. The study had no sponsorship.
Received 03.03.15 Accepted 18.02.16
введение
В настоящее время в терапии многих заболеваний все шире и чаще применяются препараты интерфе-ронов (ИФН). В отличие от химиотерапевтических препаратов ИФН обладают уникальным свойством: сочетанием противовирусной, антибактериальной, противоопухолевой, иммуномодулирующей и другими видами активности [1]. Препараты ИФН-a2b особо выделяются из числа используемых в клинической практике цитокинов [2]. Однако, являясь белком, ИФН^2Ь легко разрушается ферментами желудочно-кишечного тракта и протеазами крови, что снижает его биодоступность и вынуждает клиницистов увеличивать дозу и частоту введения препарата [3-5]. Парентеральное назначение высоких доз ИФН влечет за собой проявления различных побочных эффектов: гриппоподобный синдром, артралгия, депрессивные состояния, галлюцинации, кожные высыпания, аллергия, заболевания кроветворной системы [6]. У больных, принимающих высокие дозы ИФН, вырабатываются нейтрализующие препарат антитела, что сопровождается развитием резистентности к ин-терферонотерапии [5]. Современная технология иммобилизации ИФН^2Ь с полиэтиленгликолем (ПЭГ) с помощью электронно-лучевого синтеза позволяет модифицировать фармакокинетические характеристики соединения для увеличения биодоступности препарата и предотвращения возникновения побочных явлений [7]. Несмотря на это, на сегодняшний день нет описания иммунотропных эффектов иммо-билизированного интерферона-a2b (иммИФН-а2^, в связи с чем целью настоящего исследования явилось изучение специфического влияния иммИФН^2Ь на функциональную активность иммунокомпетентных клеток in vitro.
Материал и методы
Исследования проводились на мононуклеарах (МНК), выделенных из периферической крови 10 здоровых доноров мужского пола 22-36 лет. Кровь забирали у добровольцев утром натощак в пробирку с гепарином (ЗАО «Брынцалов-А», Россия) из расчета 25 ЕД/мл исследуемой крови. Выделение МНК проводили центрифугированием на градиенте плотности фиколл-пака (Pharmacia, Швеция) с плотностью 1,077. Белое кольцо МНК, образующееся на разделе фаз, собирали и отмывали средой 199 (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, США). Полученные клетки ресуспендировали в полной ростовой среде (ПРС), состоящей из RPMI-1640 (HyClone, США), 10% ЭТС, 10 мМ HEPES (Sigma, США), 2 мМ L-глютамина (Sigma, США) и 40 мкг/мл гентамицина (ОАО «Дальхимфарм», Россия). Жизнеспособность МНК оценивали по включению трипанового синего и доводили клетки до концентрации 2 млн/мл ПРС.
В работе использовали иммобилизированный с помощью ионизирующего излучения на ПЭГ с молекулярной массой 1,5 кДа иммИФН^2Ь (ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии», г. Новосибирск). Противовирусная биологическая активность иммИФН^2Ь изучалась в сравнении с международным стандартным образцом, выражалась в международных единицах (МЕ) и составила 4 • 106 МЕ на 1мг белка. Мольное соотношение ИФН : ПЭГ в молекуле иммИФН^2Ь - 1:2,86. В качестве препарата сравнения применяли «Реаферон-ЕС» (РФН-ЕС) (ЗАО «Вектор-Медика», г. Новосибирск). ИммИФН-a2b и препарат сравнения добавляли в культуру клеток в дозах 15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл (в пересчете на интерферон).
Для оценки влияния препаратов на фагоцитоз in vitro кровь доноров смешивали с 3% раствором желатина, приготовленного на среде 199. Готовили клеточную суспензию, содержащую 2 млн нейтрофилов в 1 мл, и параллельно - взвесь Staph. aureus, штамм 209 (получена с кафедры микробиологии ГБОУ ВПО СибГМУ), в концентрации 20 млн/мл. Бактерии были предварительно опсонизированы пуловой человеческой сывороткой в течение 20 мин при 37 0С и отмыты. При постановке реакции в 96-луночных кругло-донных планшетах смешивали клеточную суспензию и стафилококк (соотношение 1:10) и инкубировали при 37 0С в течение 30 мин. Для изучения влияния иммИФН^2Ь и РФН-ЕС на фагоцитоз к смеси добавляли исследуемые препараты. После инкубации планшеты центрифугировали, из осадка готовили мазки на предметном стекле, фиксировали этанолом и окрашивали азур-П-эозином. На мазках учитывали процент нейтрофилов, поглотивших микробы (фагоцитарный индекс - ФИ), и среднее число стафилококков, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ) [8].
Пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов оценивали с помощью реакции бласттрансформации, которая в известной степени является интегральным методом определения их функциональной активности [8]. Для активации Т-лимфоцитов использовали фитогемагглютинин (ФГА) (Sigma, США), для активации В-лимфоцитов - митоген лаконоса (МЛ) (Sigma, США). Реакцию проводили в плоскодонных планшетах для иммунологических реакций по следующей схеме: в опытные лунки вносили МНК с митогеном ФГА или МЛ в субоптимальной дозе (10 и 1 мкг/мл соответственно; доза митогена была определена в предварительных экспериментах) и ПРС (индуцированная бласттрансформация); в контрольные лунки вносили клетки и ПРС (спонтанная бласттрансформация). Изучение влияния препаратов иммИФН^2Ь и РФН-ЕС на пролиферативный ответ Т- и В-лимфоцитов проводили на моделях как индуцированной, так и спонтанной бласттрансформации.
Планшеты инкубировались в течение 72 ч при температуре 370С в СО2-инкубаторе, содержащем 5% СО2. За 6 ч до окончания культивирования в каждую лунку вносили раствор соли тетразолия (ХТТ, Sigma, США). Оценку реакции проводили на основании измерения оптической плотности (в усл. ед.) при длине волны 492 нм, определяли у. е. в лунках без добавления митогена и индекс стимуляции (ИС), последний определяли по формуле: ИС = О/К, где О - оптическая плотность в лунках с митогеном, К - оптическая плотность в лунках без митогена.
Концентрацию цитокинов (IL-1, IL-2, IL-4, ИФН-у) в супернатантах культур МНК определяли с помощью иммуноферментного метода, используя соответствующие наборы производства ЗАО «Вектор-Бест», Россия. Этот метод позволяет оценить способность исследуемых препаратов усиливать (МНК, стимулированные ЛПС или ФГА и препаратом) и индуцировать (МНК, стимулированные только препаратом)
original article
выработку цитокинов. Получали 4 вида супернатан-та: 1) от клеток, стимулированных ЛПС для индукции продукции IL-1, либо ФГА - IL-2, IL-4, ИФН-у в присутствии иммИФН^2Ь или РФН-ЕС в различных концентрациях; 2) от клеток, стимулированных ЛПС, либо ФГА; 3) от клеток, культивируемых в присутствии исследуемых препаратов; 4) от клеток, культивируемых только в ПРС [8].
Для оценки влияния исследуемых препаратов на синтез основных иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA) в культуры МНК добавляли иммИФН^2Ь или РФН-ЕС в концентрациях 15, 150 и 1500 МЕ/мл. В контрольные культуры добавляли ПРС. МНК активировали МЛ в субоптимальной дозе (1 мкг/мл) и инкубировали в термостате в течение 10 сут [8]. Количество иммуноглобулинов различных классов в культуральной среде определяли иммуноферментным методом, используя соответствующие наборы производства ЗАО «Вектор-Бест», Россия.
Изучение влияния препаратов на функциональную активность естественных киллеров (ЕК) определяли в цитотоксической реакции по их способности лизи-ровать клетки миелобластоидной линии К-562, используя колориметрический метод [9]. Индекс естественной киллерной активности (ЕКА) определяли по формуле:
ЕКА (%) = (То - Тк)/То • 100%,
где То - оптическая плотность в опыте, Тк - в контроле.
Статистическую обработку результатов осуществляли с применением пакета программ Statistica for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента.
результаты
В ходе эксперимента было установлено, что добавление иммИФН^2Ь и РФН-ЕС в различных концентрациях (15, 150 и 1500 МЕ/мл) к нейтрофилам периферической крови здоровых доноров не приводило к достоверным изменениям ни в доле активных фагоцитов, ни в количестве поглощенных одной клеткой бактерий по сравнению с группой без добавления препарата (рис. 1). Однако необходимо отметить, что по мере увеличения концентрации иммИФН^2Ь в куль-туральной среде повышались фагоцитарный индекс и фагоцитарное число, а при дозе 150 и 1500 МЕ/мл эти показатели превышали контрольные значения, хотя и статистически не значимо.
Спонтанная пролиферативная активность клеток достоверно не изменялась по сравнению с контрольной группой (без добавления препарата) как при добавлении в культуру лимфоцитов иммИФН-а2^ так и РФН-ЕС в различных концентрациях (15, 150 и 1500 МЕ/мл), за исключением группы с добавлением РФН-ЕС в дозе 150 МЕ/мл. В этой группе наблюдалось статистически значимое снижение пролиферативной активности лимфоцитов как по сравнению с контролем, так и с группой с добавлением иммИФН^2Ь в такой же дозе (рис. 2).
оригинальные статьи
ративной активности В-лимфоцитов к МНК периферической крови здоровых доноров достоверных изменений индекса стимуляции по сравнению с группой контроля не наблюдалось. Внесение же РФН-ЕС в культуру МНК в дозах 15 и 150 МЕ/мл совместно с МЛ статистически значимо снижало пролифератив-ную активность В-лимфоцитов как по сравнению с контролем, так и с группой с добавлением иммИФН-а2Ь в такой же концентрации (см. рис. 2).
При добавлении в культуру МНК иммИФН-а2Ь и РФН-ЕС в концентрациях 15, 150 и 1500 МЕ/мл спонтанная и стимулированная продукция ^-1р и ^-4 достоверно не изменялась по сравнению с показателями контрольной группы (^-10: 130,42±11,3 и 358,06±1,85 пг/мл; ^-4: 0,74±0,29 и 1,03±0,31 пг/мл соответственно). Спонтанная и стимулированная продукция ^-2 повышалась по сравнению с контролем (1,32±0,39 и 3,31±0,95 пг/мл соответственно) при добавлении в культуру МНК иммИФН-а2Ь во всех исследованных дозах. Препарат сравнения РФН-ЕС в исследуемых концентрациях способствовал усилению спонтанного синтеза ^-2 и увеличивал индуцированную продукцию цитокина только в дозе 150 МЕ/мл (рис. 3). При внесении иммИФН-а2Ь в дозе 150 МЕ/мл наблюдалось достоверное усиление спонтанной выработки ИФН-у относительно контроля (7,78±1,52 пг/мл), остальные исследуемые концентрации не влияли на спонтанную и индуцированную продукцию цитоки-на. Добавление РФН-ЕС в культуру МНК в дозах 15 и 150 МЕ/мл без митогена статистически значимо повышало продукцию изучаемого цитокина как по сравнению с контролем, так и с группой с внесением иммИФН-а2Ь в дозе 15 МЕ/мл.
Инкубация МНК периферической крови здоровых доноров с иммИФН-а2Ь и РФН-ЕС в изучаемых концентрациях не приводила к достоверным изменениям в продукции основных иммуноглобулинов (IgG, ^М, ^А) по сравнению с группой контроля
Рис. 2. Влияние иммИФН^2Ь и реаферона-ЕС на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов in vitro, M±m. * - статистическая значимость различий с контролем,p < 0,05; # - различие реаферона-ЕС с соответствующей дозой иммИФН-a2b, p < 0,05.
1 МЕ/мл 1500
1 МЕ/мл 1500
Рис. 1. Влияние иммобилизированного ИФН-а2Ь (сплошная линия) и реаферона-ЕС (пунктирная линия) на фагоцитоз нейтрофилов периферической крови доноров in vitro.
При изучении влияния исследуемых препаратов на пролиферативную активность Т-лимфоцитов в системе in vitro достоверных изменений индекса стимуляции в ответ на ФГА обнаружено не было (см. рис. 2).
При добавлении иммИФН-а2Ь в различных концентрациях совместно со стимулятором пролифе-
original article
Оценка влияния препаратов иммобилизированного ИФН-а2Ь и РФН-ЕС на функциональную активность естественных киллерных клеток in vitro (Х±т, р)
ЕКА, соотно- Экспериментальная группа
шение мишень/ 1-я контроль 2-я иммИФН-а2Ь 3-я иммИФН-а2Ь 4-я иммИФН-а2Ь 5-я РФН-ЕС 6-я РФН-ЕС 7-я РФН-ЕС
эффектор, % (без препарата) (15 МЕ/мл) (150 МЕ/мл) (1500 МЕ/мл) (15 МЕ/мл) (150 МЕ/мл) (1500 МЕ/мл)
1:10 40,03±2,61 30,0±3,12 19,98±2,39 11,77±1,88 33,01±2,62 22,51±1,74 18,88±1,63
pi_2 < 0,05 pi 3 < 0,001 Р1-4 < 0,001 p1 < 0,001 p17 < 0,001
Р„ < 0,05
1:25 45,38±3,54 31,12±2,82 20,42±2,51 13,79±2,22 36,57±2,02 23,24±2,05 21,45±3,09
Л-2 < 0,01 p1-3 < 0,001 Р1-4 < 0,001 Р1-5 < 0,05 p < 0,001 г 1-6 ' p1-7 < 0,001
1:50 49,89±5,55 31,02±3,50 22,72±3,28 15,01±2,63 37,95±2,72 25,37±3,21 23,22±2,19
Л-2 < 0,05 p13 < 0,001 Р1-4 < 0,001 p1-6 < 0,01 Р17 < 0,001
< 0,05
П р и м е ч а н и е. p1-2 < 0,05 - различия между соответствующими группами достоверны.
(ДО - 0,435±0,09; ^М - 0,144±0,07; ^А - 0,262±0,04 мкг/мл). Максимум выработки IgG и IgA МНК отмечали при внесении иммИФН-а2Ь в дозе 150 МЕ/мл (0,535±0,12 и 0,429±0,14 мкг/мл соответственно), а IgM - в дозе 15 МЕ/мл (0,273±0,13 мкг/мл).
При добавлении иммИФН-а2Ь в различных концентрациях к МНК периферической крови здоровых доноров наблюдали достоверное снижение функциональной активности ЕК при всех исследованных соотношениях мишень/эффектор (1:10, 1:25 и 1:50) (см. таблицу). При этом отмечали дозозависимый эффект: насколько в большей концентрации вносили иммИФН-а2Ь, настолько более значительно подавлялась киллерная активность. Добавление РФН-ЕС в культуру МНК в дозе 15 МЕ/мл при соотношении мишень/эффектор снижало активность ЕК в пропорциях 1:10 (но недостоверно по сравнению с контро-
5 1
ИЛ-2 спонт И ИЛ-2 стим
ИФН-д спонт ИФН-д стим
Рис. 3. Влияние препаратов иммИФН-а2Ь и реаферона-ЕС на спонтанный и стимулированный синтез IL-2 и ИФН-у in vitro. За контрольные значения взята единица; * - статистическая значимость различий с контролем, p < 0,05; # - различие реаферона-ЕС с соответствующей дозой иммИФН-а2Ь, p < 0,05; сп/ст - спонтанный/стимулированный.
лем), а при увеличении дозы вносимого препарата (150 и 1500 МЕ/мл) при таком же соотношении мишень/эффектор, а также в пропорциях 1:25 и 1:50, во всех исследованных дозах отмечалось статистически значимое подавление киллерной активности. Однако инкубация клеток с РФН-ЕС в меньшей степени снижала активность ЕК по сравнению с группами с внесением иммИФН-а2Ь в сопоставимых концентрациях. Так, естественная киллерная активность при добавлении РФН-ЕС в дозе 1500 МЕ/мл в культуру МНК при соотношении мишень/эффектор 1:10 и 1:50 была достоверно выше по сравнению с соответствующими группами с внесением иммИФН-а2Ь.
Обсуждение
На сегодняшний день доказано, что система ИФН, участвуя в самых ранних процессах имму-нореактивности и координируя деятельность им-мунокомпетентных клеток, предупреждает проникновение чужеродных агентов в организм человека [10]. ИФН формируют защитный барьер на пути внедрения антигена намного раньше, чем возникают специфические иммунные реакции, стимулируют неспецифический клеточный ответ через активацию макрофагально-фагоцитарной системы, Т-лимфоцитов и ЕК [11, 12]. ИФН-а активируют ци-тотоксическую функцию макрофагов и нейтрофилов благодаря усилению продукции в них свободных форм кислорода и оксида азота, а также за счет повышения экспрессии молекул HLA I, II классов [13, 14], Fc- и TLR-рецепторов на цитоплазматической мембране клеток, через которые распознаются антигены [14-16]. Тем не менее в результате проведенного нами исследования было выяснено, что добавление иммИФН-а2Ь и препарата сравнения РФН-ЕС в культуру МНК здоровых доноров в различных концентрациях не влияло на фагоцитарную функцию нейтрофилов. Хотя и статистически незначимо, прослеживалась положительная тенденция в увеличении показателей ФИ и ФЧ с увеличением концентрации иммИФН-а2Ь в культуральных средах. Вероятно, конформационные изменения молекулы в процессе иммобилизации явились причиной нарушения взаимодействия ИФН со специфическими рецепторами
оригинальные статьи
[3, 4, 17]. Однако сниженный уровень активности иммИФН-а2Ь in vitro может компенсироваться его улучшенными фармакокинетическими свойствами in vivo, прежде всего за счет снижения клиренса, увеличения стабильности в плазме крови и удлинения периода полужизни препарата [7, 17]. Можно предположить, что для проявления иммуностимулирующего эффекта иммИФН-а2Ь на фагоцитарное звено иммунитета необходимы биотрансформация препарата в организме и присутствие функциональной связи ИФН с другими цитокинами иммунного ответа, которая возможна только в условиях макроорганизма [11].
Дозозависимый эффект иммИФН-а2Ь наблюдали при исследовании функциональной активности ЕК - чем в более высокой дозе вносился иммИФН-а2Ь, тем более значительно подавлялась киллерная активность клеток. При этом исследуемый ИФН снижал функциональную активность ЕК значительнее, чем препарат сравнения - РФН-ЕС. Из литературы известно, что ИФН I типа способны как стимулировать, так и блокировать активность ЕК через регуляцию продукции IL-12 [13]. Тем не менее необходимо отметить, что стимулирующее действие ИФН-а2Ь проявляется при исходно низких показателях литической активности, а подавляющее - при исходно высокой активности ЕК [18]. Кроме того, влияние ИФН на активность субпопуляций имму-нокомпетентных клеток неоднозначно и зависит как от дозы ИФН, так и от времени его введения относительно фазы иммунного ответа, что позволяет охарактеризовать эффект ИФН-а2Ь как иммуномо-дулирующий [19].
Одна из иммунорегулирующих функций ИФН связана с его ингибирующим влиянием на пролифе-ративную фазу иммунного ответа, что снижает воспаление и деструкцию тканей [20]. Показано, что в системе in vitro ИФН (особенно в высоких дозах) су-прессируют пролиферацию как Т-лимфоцитов, так и В-лимфоцитов человека на митогены и антигены [11, 21]. В нашем исследовании при добавлении в культуру лимфоцитов как иммИФН-а2Ь, так и РФН-ЕС в концентрациях 15, 150 и 1500 МЕ/мл спонтанная пролиферация клеток достоверно не изменялась по сравнению с группой без добавления препарата, за исключением группы с добавлением РФН-ЕС в дозе 150 МЕ/м, в которой наблюдалось снижение пролифера-тивной активности лимфоцитов. Внесение иммИФН-а2Ь в культуру МНК не влияло на пролиферацию Т- и В-клеток: напротив, РФН-ЕС в дозах 15 и 150 МЕ/мл совместно с МЛ снижали пролиферативную активность В-лимфоцитов как по сравнению с контролем, так и с группой с добавлением иммИФН-а2Ь в такой же концентрации.
ИФН I типа, участвуя в каскаде цитокиновых реакций, является связующим звеном между врожденными и приобретенными иммунными ответами и регулирует клеточные и гуморальные механизмы защиты от антигенов [13]. ИФН-а очень тонко воздействует на гуморальное звено иммунной си-
стемы. Имеются данные, что ИФН-а мало влияет на рост пре-В-лимфоцитов, однако тормозит рост клеток более зрелых линий, способен как усиливать, так и подавлять процесс антителообразования [11]. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что иммИФН-а2Ь и РФН-ЕС не влияют на синтез иммуноглобулинов класса А, М, G. Из литературы известно, что ИФН-а в некоторой степени подавляет развитие гуморального иммунного ответа - через снижение экспрессии рецепторов IL-4R для IL-4 [14] на поверхности В-клеток и увеличения синтеза антагонистических цитокинов (ИФН-у и IL-2) [11, 20], а через STAT-независимые пути способствуя дифференциации В-лимфоцитов в плазмоциты, которые не способны продуцировать большие количества иммуноглобулинов [15]. В результате проведенного исследования мы убедились, что иммИФН-а2Ь и РФН-ЕС не влияли на спонтанную и стимулированную продукцию IL-10 и IL-4, но повышали спонтанную выработку IL-2 и ИФН-у. ИммИФН-а2Ь более эффективно, чем препарат сравнения РФН-ЕС, усиливал стимулированную продукцию IL-2, который играет центральную роль в активации и пролиферации лимфоцитов, в деятельности Т-лимфоцитов, естественных киллеров и В-лимфоцитов на различных этапах их функционирования.
Заключение
Таким образом, опыты in vitro показали, что иммИФН-а2Ь может принимать активное участие в регуляции механизмов специфического иммунного ответа, индуцируя синтез ИФН-у и IL-2. ИммИФН-а2Ь более эффективно, чем препарат сравнения РФН-ЕС, усиливает стимулированную продукцию IL-2 и так же, как и препарат сравнения РФН-ЕС, повышает синтез ИФН-у без дополнительной стимуляции ми-тогеном. При этом исследуемый препарат снижает функциональную активность естественных киллеров более значительно, чем препарат сравнения РФН-ЕС. Исследование не имело спонсорской поддержки. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
1. Симбирцев А.С. Достижения и перспективы использования рекомбинантных цитокинов в клинической практике. Медицинский академический журнал. 2013; 1 (13): 7-22.
2. Наровлянский А.Н., Ершов Ф.И., Гинцбург А.Л. Интерфероны: перспективные направления исследований. Иммунология. 2013; (3): 168-72.
3. Никитин И.Г, Байкова И. Е., Гогова Л.М. Пегилированные лекарственные препараты: современное состояние проблемы и перспективы. Лечебное дело. 2005; (4): 18-24.
4. Grace M., Cutler D., Bordens R. Пегилированные интерфероны при хроническом гепатите C. Рецепт: научно-практический журнал для фармацевтов и врачей. 2006; (6): 118-28.
5. Thomas T., Foster G. Nanomedicines in the treatment of chronic hepatitis C-focus on pegylated interferon alpha-2a. Int. J. Nanomed. 2007; 1 (2): 19-24.
6. Fried M.W. Side effects of therapy of hepatitis C and their management. Hepatology. 2002; 36 (5): 237-44.
7. Дыгай А.М., Артамонов А.В., Бекарев А.А., Жданов В.В., Зюзь-
ков Г.Н., Мадонов П.Г., Удут В.В. Нанотехнологии в фармакологии. М.: Издательство РАМН; 2011.
8. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К; 2013; ч. 1.
9. Кузовкова Н.А. Оценка активности естественных киллеров колориметрическим методом. Иммунология. 1991; (4): 59-61.
10. Goodbourn S., Didcock L., Randall R.E. Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures. J. Gen. Virol. 2000; 81 (10): 2341-64.
11. Кузнецов В.П. Интерфероны в каскаде цитокинов: исторический и современный аспекты. Антибиотики и химиотерапия. 1998; 43 (5): 28-39.
12. Monroe K.M., McWhirter S.M., Vance R.E. Induction of type I interferons by bacteria. Cell Microbiol. 2010; 12 (7): 881-90.
13. Boasso A. Type I interferon at the interface of antiviral immunity and immune regulation: The curious case of HIV-1. Scientifica. 2013; Available at: http://dx.doi.org/10.1155/2013/580968.
14. Brassard D.L., Grace M.J., Bordens R.W. Interferon-alpha as an im-munotherapeutic protein. J. Leukocyte Biol. 2002; 71 (4): 565-81.
15. Абатуров А.Э., Юлиш Е.И. Роль интерферонов в защите респираторного тракта. Здоровье ребенка. 2007; 5 (8). Available at: http://www.mif-ua.com/archive/article/3656.
16. Лисяный Н.И., Семенова В.М., Любич Л.Д. Достижения и проблемы применения интерферонов в нейроонкологии. Укратський нейрохiрургiчний журнал. 2004; (3): 29-36.
17. Карабельский А.В., Падкина М.В. Рекомбинантные интерфероны-альфа пролонгированного действия. Вестник СПбГУ. 2007; 4 (3): 45-53.
18. Петровская И.А., Кушко Л.Я., Федорченко С.В. и др. Влияние рекомбинантного a2-интерферона (реаферона) на функциональную активность естественных киллеров при остром вирусном гепатите В. Микробиология. 1995; (6): 56-7.
19. Кадагидзе З.Г. Цитокины. Практическая онкология. 2003; 3 (4): 131-9.
20. González-Navajas J.M., Lee J., David M., Raz E. Immunomodulatory functions of type I interferons. Nat. Rev. Immunol. 2012; 12 (2): 125-35.
21. Carotenuto P., Riel D., Artsen A., Bruijns S., Uytdehaag F.G., Laman J.D. et al. Antiviral treatment with alpha interferon up-regulates cD14 on liver macrophages and its soluble form in patients with chronic hepatitis B. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49 (2): 590-9.
references
1. Simbirtsev A.S. Achievements and prospects for the use of recombinant cytokines in clinical practice. Meditsinskiy akademicheskiy zhurnal. 2013; 1 (13): 7-22. (in Russian)
2. Narovlyanskiy A.N., Ershov F.I., Gintsburg A.L. Interferons: prospective directions of research. Immunologiya. 2013; (3): 168-72. (in Russian)
3. Nikitin I.G., Baykova I.E., Gogova L.M. Pegylated drugs: state of the problem and perspectives. Lechebnoe delo. 2005; (4): 18-24. (in Russian)
original article
4. Grace M., Cutler D., Bordens R. Пегилированные интерфероны при хроническом гепатите C. Retsept: nauchno-prakticheskiy zhurnal dlya farmatsevtov i vrachey. 2006; (6): 118-28.
5. Thomas T., Foster G. Nanomedicines in the treatment of chronic hepatitis C-focus on pegylated interferon alpha-2a. Int. J. Nanomed. 2007; 1 (2): 19-24.
6. Fried M.W. Side effects of therapy of hepatitis C and their management. Hepatology. 2002; 36 (5): 237-44.
7. Dygay A.M., Artamonov A.V., Bekarev A.A., Zhdanov V.V., Zyuz'kov G.N., Madonov P.G., Udut V.V. Nanotechnology in Pharmacology. [Nanotekhnologii v farmakologii]. Moscow: RAMN Publ.; 2011. (in Russian)
8. Mironov A.N., Bunatyan N.D. et al. Guidelines for Preclinical Studies of Drugs. [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issle-dovaniy lekarstvennykh sredstv]. Moscow: Grief and K; 2013; Part 1. (in Russian)
9. Kuzovkova N.A. Evaluation of the activity of natural killer cells colorimetric method. Immunologiya. 1991; (4): 59-61. (in Russian)
10. Goodbourn S., Didcock L., Randall R.E. Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures. J. Gen. Virol. 2000; 81 (10): 2341-64.
11. Kuznetsov V.P. Interferons in the cascade of cytokines: historical and modern aspects. Antibiotiki i khimioterapiya. 1998; 43 (5): 28-39. (in Russian)
12. Monroe K.M., McWhirter S.M., Vance R.E. Induction of type I interferons by bacteria. Cell Microbiol. 2010; 12 (7): 881-90.
13. Boasso A. Type I interferon at the interface of antiviral immunity and immune regulation: The curious case of HIV-1. Scientifica. 2013; Available at: http://dx.doi.org/10.1155/2013/580968.
14. Brassard D.L., Grace M.J., Bordens R.W. Interferon-alpha as an im-munotherapeutic protein. J. Leukocyte Biol. 2002; 71 (4): 565-81.
15. Abaturov A.E., Yulish E.I. The role of interferons in the protection of the respiratory tract. Zdorov'e rebenka. 2007; 5 (8). Available at: http://www.mif-ua.com/archive/article/3656. (in Ukraine)
16. Lisyanyy N.I., Semenova V.M., Lyubich L.D. Achievements and problems of application of interferons in neurooncology. Ukrains'kiy neyrokhirurgichniy zhurnal. 2004; (3): 29-36. (in Russian)
17. Karabel'skiy A.V., Padkina M.V. Recombinant interferon alpha prolonged action. VestnikSPbGU. 2007; 4 (3): 45-53. (in Russian)
18. Petrovskaya I.A., Kushko L.Ya., Fedorchenko S.V. et al. Effect of recombinant a2-interferon (reaferona) on functional activity of natural killer cells in acute viral hepatitis B. Mikrobiologiya. 1995; (6): 56-7. (in Russian)
19. Kadagidze Z.G. Cytokines. Prakticheskaya onkologiya. 2003; 3 (4): 131-9. (in Russian)
20. González-Navajas J.M., Lee J., David M., Raz E. Immunomodulatory functions of type I interferons. Nat. Rev. Immunol. 2012; 12 (2): 125-35.
21. Carotenuto P., Riel D., Artsen A., Bruijns S., Uytdehaag F.G., Laman J.D. et al. Antiviral treatment with alpha interferon up-regulates CD14 on liver macrophages and its soluble form in patients with chronic hepatitis B. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49 (2): 590-9.
Поступила 03.03.15 Принята в печать 18.02.16
