CC BY
14
© Е.М. Франциянц, И.М. Котиева, В.А. Бандовкина, Е.И. Сурикова, И.В. Каплиева, И.В. Нескубина, Н.Д. Черярина, 2020
УДК 616.5-006.81-06-085:615.35
ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛИ НА НЕКОТОРЫЕ МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ТКАНИ МЕЛАНОМЫ 816/F10 У САМОК МЫШЕЙ
Е.М. Франциянц, И.М. Котиева, В.А. Бандовкина, Е.И. Сурикова, И.В. Каплиева, И.В. Нескубина, Н.Д. Черярина
ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону
INFLUENCE OF CHRONIC PAIN ON SOME METABOLIC PROCESSES IN TISSUES OF B16/F10 MELANOMA IN FEMALE MICE
E.M. Frantsiyants, I.M. Kotieva, V.A. Bandovkina, E.I. Surikova, I.V. Kaplieva, I.V. Neskubina, N.D. Cheryarina
National Medical Research Center of Oncology, Rostov-on-Don
Сурикова Екатерина Игоревна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России
344037, г. Ростов-на-Дону, 14 линия, д. 63, тел.: (863) 200-10-00 доб. 482 или -483, +7-904-501-83-62, e-mail: sunsur2000@mail.ru Surikova Ekaterina I. — PhD in Biol. Sc., senior researcher at Laboratory of Malignant Tumor Pathogenesis Study of National Medical Research Center of Oncology,
63 14th line, Rostov-on-Don, Russian Federation, 344037, tel.: (863) 200-10-00 ext. 482 or -483, +7-904-501-83-62, e-mail: sunsur2000@mail.ru
Реферат. Несмотря на значительный прогресс в понимании нейрофизиологии и психологии боли, фундаментальные и клинические аспекты проблемы хронической боли остаются во многом нерешенными. Развитие опухоли и хроническая боль являются выраженными стрессорными факторами, в механизмах которых участвуют многие факторы роста, гормоны, нейромедиаторы.
Цель исследования — изучить механизмы формирования условий стимуляции роста опухоли и активации ангиогенеза под влиянием хронической нейропатической боли (ХНБ).
Материал и методы. Работа выполнена на 56 самках мышей линии С57В1./6. Животным основной группы меланому В16/ Р10 перевивали через 2 недели после двусторонней перевязки седалищных нервов, в группе сравнения — только перевивка меланомы. В коже (животные интактные и с ХНБ) и в ткани опухоли (группа сравнения и основная) методами ИФА и РИА определяли концентрации УЕвР (А и С) и растворимых форм их рецепторов и R3), половых гормонов, их рецепторов и пролактина, биогенных аминов, компонентов ЫО-системы. Статистическую обработку результатов проводили программой Statistica 6,0, значимость различий оценивали с помощью критерия Стьюдента и критерия Манна — Уитни. Различия считали значимыми при р<0,05.
Результаты. В основной группе выявлено снижение средней продолжительности жизни мышей, более раннее появление метастазов, в том числе и в нетипичные зоны. При этом в опухоли обнаружено увеличение концентрации УЕвР-Д и УЕвР-С, NOS-3, NOS-2, цитруллина и АДМА. Выявлено увеличение концентрации эстрона, прогестерона, пролактина и рецепторов к эстрогенам, андрогенам и прогестерону. Отмечено изменение баланса биогенных аминов: увеличение содержания адреналина и серотонина и снижение норадреналина и дофамина.
Заключение. Представленные результаты могут являться подтверждением системного влияния ХНБ, под воздействием которой значительно изменяется функционирование вазоактивной N0- и нейрогуморальной систем, приводя к формированию условий активации ангиогенеза и роста опухоли.
Ключевые слова: мыши, меланома В16/Р10, хроническая боль, патогенез опухолевого роста, ангиогенез, кожа, опухоль, половые гормоны, биогенные амины, оксид азота.
Abstract. Despite significant progress in understanding the neurophysiology and psychology of pain, fundamental and clinical aspects of the problem of chronic pain remain largely unresolved. Tumor development and chronic pain are pronounced stress factors with the mechanisms involving many growth factors, hormones and neurotransmitters.
The aim of the study was to reveal mechanisms of the condition formation for stimulating tumor growth and activating angiogenesis under the influence of chronic neuropathic pain (CNP).
Material and methods. The study included 56 female C57BL/6 mice. Animals of the main group underwent transplantation of B16/F10 melanoma 2 weeks after bilateral sciatic nerve ligation, in the comparison group — only melanoma transplantation. Levels of VEGF (A and C) and their soluble receptors (R1 and R3), sex hormones and their receptors, prolactin, biogenic amines and components of the NO-system were measured by standard ELISA and RIA methods in the skin (intact animals and with only CNP) and tumor tissues (comparison and main groups). Statistical analysis of results was performed in the Statistica 6.0 program, the significance of differences was assessed by the Student's t-test and the Mann — Witney criterion. Differences were considered significant at p<0.05.
Results. The main group demonstrated lower survival of mice, earlier metastasis onset and atypical metastatic sites. Tumor levels of VEGF-A and VEGF-C, NOS-3, NOS-2, citrulline and ADMA were elevated. Increased concentrations of estrone, progesterone, prolactin and receptors to estrogens, androgens and progesterone were found. The balance of biogenic amines was changed: adrenaline and serotonin levels increased, while noradrenaline and dopamine decreased.
Conclusions. The results can confirm the systemic CNP influence that significantly changes the functions of vasoactive NO- and neurohumoral systems leading to the formation of conditions for angiogenesis activation and tumor growth. Key words: mice, B16/F10 melanoma, chronic pain, pathogenesis of tumor growth, skin, tumor, growth factors, angiogenesis, sex hormones, biogenic amines, nitric oxide.
Введение
В настоящее время в медицине сформировалось новое направление — медицина боли. Наряду с этим приходится признать, что в нашей стране наблюдается значительное отставание как в активности научных исследований, так и в медицинской помощи больным с различными болевыми синдромами. Несмотря на значительный прогресс в понимании нейрофизиологии и психологии боли, фундаментальные и клинические аспекты проблемы хронической боли остаются во многом нерешенными [1]. Учитывая,
что в настоящее время методы лечения хронической нейропатической боли (ХНБ) являются неудовлетворительными, исследование механизмов, с помощью которых повреждение нерва вызывает боль, остается в центре внимания исследований [2]. Основные механизмы ХНБ плохо изучены, что усложняет управление ею. Высокая распространенность хронических болевых синдромов, их тяжелое гуманитарное и социально-экономическое бремя вызвало значительную активизацию фундаментальных и клинических исследований [1]. Одним из результатов иссле-
Таблица 1. Факторы ангиогенеза в коже и опухоли Table 1. Angiogenesis factors in the skin and tumor
Группы VEGF-A пг/г ткани sVEGF-R1 нг/г ткани VEGF-C нг/г ткани sVEGF-R3 нг/г ткани
Кожа интактная 169,4±8,3 0,95±0,1 6,8±0,5 6,7±0,6
Кожа ХНБ (контроль) 453,7±41,81 2,8±0,31 41,4±4,31 1,1±0,131
3 недели роста меланомы B16/F10 — ткань опухоли
Группа сравнения 930,1±83,91 2,8±0,31 60,2±6,31 11,5±1,31
Основная группа 10634,9±797,61,2 6,8±0,91,2,3 90,6±8,81,2,3 1,1±0,11,3
Примечание: статистически значимые различия: 1 — по сравнению с интактной кожей; 2 — по сравнению с кожей ХНБ (контроль); 3 — по сравнению с группой сравнения Note: statistically significant differences: 1 — compared with intact skin; 2 — compared with skin CNB (control); 3 — compared with the comparison group
Таблица 2. Уровень половых гормонов и пролактина в коже и опухоли Table 2. The level of sex hormones and prolactin in the skin and tumor
Группы Эстрадиол нМоль/г ткани Эстрон пМоль/г ткани Тестостерон общ. нМоль/г ткани Тестостерон своб. пМоль/г ткани Прогестерон нМоль/г ткани Пролактин мМЕ/г ткани
Кожа интактная 0,57±0,04 262,4±21,1 12,8±1,0 0,78±0,05 1,0±0,07 6,6±0,50
Кожа ХНБ (контроль) 1,7±0,141 769,0±621 9,8±0,81 0,43±0,041 2,1±0,21 1,4±0,121
3 недели роста меланомы B16/F10 — ткань опухоли
Группа сравнения 0,74±0,041 494,5±30,81 12,8±1,2 0,37±0,031 1,1±0,1 5,5±0,21
Основная группа 2,0±0,21,3 1037±99,51,2,3 10,3±0,97 0,4±0,031 3,4±0,281,2,3 3,3±0,31,2,3
Примечание: статистически значимые различия: 1 — по сравнению с интактной кожей; 2 — по сравнению с кожей ХНБ (контроль); 3 — по сравнению с группой сравнения Note: statistically significant differences: 1 — compared with intact skin; 2 — compared with skin CNB (control); 3 — compared with the comparison group
дований механизмов боли и патогенетически обоснованных подходов к ее терапии стало понимание, того что болевое воздействие, сопровождающее патологические процессы в живом организме, способно вызывать значительные изменения показателей гомеостаза.
Было высказано обоснованное утверждение о том, что отсутствие экспериментальных работ на грызунах, представляющих аналог модели человеческой боли, способствует плохому пониманию основных результатов исследования боли [3].
В настоящее время создано достаточно много экспериментальных моделей, в которых боль возникает на фоне роста злокачественных опухолей или под влиянием химиотерапии. С другой стороны, нередко ХНБ возникает задолго до появления рака.
Целью исследования явилось изучение механизмов формирования условий стимуляции роста меланомы B16/F10 и активации ангиогенеза у самок мышей под влиянием хронической нейропатической боли (ХНБ).
Материал и методы
Работа выполнена на самках мышей линии C57BL/6 (n=56), 8 недельного возраста с началь-
ной массой 21-22 г. Животные были получены из ФГБУН Научный центр биомедицинских технологий «Андреевка» ФМБА (Московская область). В работе использовали клеточную линию мышиной, метастазирующей в легкие меланомы В16/Р10, полученную из РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (г. Москва). Животные содержались при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Протокол исследования был одобрен Комиссией по биоэтике ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ.
Все самки находились в состоянии диэстру-са. Животные были распределены на группы: интактные мыши (п=14), контрольная группа — воспроизведение модели ХНБ (п=14), группа сравнения — меланома В16/Р10 (п=14) и основная — мыши с меланомой В16/Р10, воспроизведенной на фоне ХНБ (п=14).
Все манипуляции с животными производили в боксе. Каждому животному контрольной и основной групп вводили ксила-золетиловый наркоз: за 10 минут до основного наркоза с целью премедикации животному внутримышечно вводили ксилазин (препарат Ксила) в дозе 0,05 мл/кг массы тела (по инструкции), затем — Золетил-50 в дозе 10 мг/100 г массы тела. Мышам основной группы осуществляли перевязку седалищного нерва с 2-х сторон. Через 2 недели после за-
Таблица 3. Содержание рецепторов стероидных гормонов в коже и опухоли Table 3. The content of steroid hormone receptors in the skin and tumor
Группы ERa нг/г ткани ERß нг/г ткани RP4 пг/г ткани RA нг/г ткани ERa/ERß
Кожа интактная 2,2±0,2 2,02±0,19 0,21±0,02 0,22±0,02 1,09±0,01
Кожа ХНБ (контроль) 8,1±0,71 8,03±0,71 0,215±0,02 0,122±0,011 1,01±0,1
3 недели роста меланомы B16/F10 — ткань опухоли
Группа сравнения 9,1±0,91 11,77±1,11 0,41±0,041 0,29±0,021 0,77±0,061
Основная группа 13,3±1,31,2,3 11,54±1,11,2 0,41±0,041,2 0,26±0,022 1,15±0,13
Примечание: статистически значимые различия: 1 — по сравнению с интактной кожей; 2 — по сравнению с кожей ХНБ (контроль); 3 — по сравнению с группой сравнения Note: statistically significant differences: 1 — compared with intact skin; 2 — compared with skin CNB (control); 3 — compared with the comparison group
живления операционной раны мышам основной группы перевивали меланому B16/F10. Животным группы сравнения только перевивали меланому B16/F10 [4].
Через 3 недели после перевивки опухоли мышей всех групп быстро декапитировали. Опухоль выделяли сразу после декапитации. Из ткани получали 10% цитозольные фракции, приготовленные на 0,1М калий-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 0,1% Твин-20 и 1% БСА, в которых с помощью стандартных тест-систем ИФА определяли: свободную форму тестостерона (ХЕМА, Россия); эстрон (DBC, Канада); VEGF-А, VEGFR-1, VEGF-С, sVEGFR-3 (Bender Med Systems, США); ги-стамин, адреналин, норадреналин, дофамин, се-ротонин, 5-оксииндолуксусной кислоту (5-ОИУК) (Cusabio, Китай); уровень рецепторов эстрогенов — ERa и ERp, андрогенов — RA и прогестерона — RP4 (CUSABIO BIOTECH Co., Ltd., Китай); NOS-2, NOS-3 (Cloud-Clone Corp., США); L-аргинин, L-цитруллин, асимметричный диметиларгинин АДМА (Immundiagnostik, Германия); общий нитрит (R&D systems, США) и нитротирозин (Hycult Biotech, Нидерланды). Радиоиммунным методом определяли уровень эстрадиола, общего тестостерона, прогестерона и пролактина (стандартные тест-наборы фирмы Иммунотех, Чехия; анализатор «Ариан», Россия).
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы Statis-tica 6,0. Данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка. Часть показателей имела распределение, соответствующее нормальному, часть — отличающееся от нормального, поэтому значимость различий оценивали с помощью ^критерия Стьюдента и критерия Манна — Уитни. При р<0,05 различия считали значимыми. При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.
Результаты
Для решения вопроса об участии ХНБ в про-грессировании экспериментальных спонтанно метастазирующих опухолей мы остановились на меланоме В16/И0. Средняя продолжительность жизни для мышей основной группы составила 19,17±1,35 дней, максимальная — 24 дня. В группе сравнения — первая смерть наступила на 24 сутки, средняя продолжительность их жизни составила 30,25±1,67 дня, максимальная — 36 дней. У мышей из основной группы меланома В16 вела себя более агрессивно, поскольку мета-стазировала чаще, иногда в несколько органов и имела нетипичные для себя зоны метастазиро-вания. Метастазы у мышей основной группы регистрировались уже через неделю после пере-
Таблица 4. Уровень биогенных аминов в коже и опухоли Table 4. The level of biogenic amines in the skin and tumor
Группы Гистамин нг/г ткани Адреналин нг/г ткани Норадреналин нг/г ткани Дофамин нг/г ткани Серотонин нг/г ткани 5ОИУК Мг/г ткани
Кожа интактная 1357,7±105 3,2±0,3 5,8±0,48 30,9±2,8 0,41±0,04 0,32±0,03
КожаХНБ (контроль) 786,1±691 3,4±0,29 12,0±1,01 43,4±3,51 0,28±0,021 0,38±0,03
Опухоль 3 неделя роста меланомы B16/F10 — ткань опухоли
Группа сравнения 109,3±9,81 4,2±0,41 12,6±1,21 64,3±6,11 0,52±0,051 0,23±0,021
Основная группа 21,0±1,91,2,3 5,2±0,51,2,3 8,8±0,81,2,3 19,4±1,51,2,3 0,39±0,032,3 0,48±0,041,2,3
Примечание: статистически значимые различия: 1 — по сравнению с интактной кожей; 2 — по сравнению с кожей ХНБ (контроль); 3 — по сравнению с группой сравнения Note: statistically significant differences: 1 — compared with intact skin; 2 — compared with skin CNB (control); 3 — compared with the comparison group
вивки, а у мышей из группы сравнения — через 4 недели. У мышей с ХНБ опухоль метастазирова-ла кроме типичных мест — в печень, селезенку и легкие, еще и в нетипичные — сердце, матку.
Хроническая боль вызывала повышение уровня УЕвР-А и УЕвР-С в коже контрольных мышей-самок в 2,7 раза и 6,1 раза соответственно (табл. 1). Не равнозначным было влияние хронической боли на рецепторы факторов роста в этих образцах: уровень sVEGF-R1 повышался в 2,9 раза, а sVEGF-R3, напротив, снижался в 6,1 раза. Вместе с тем, уровень свободного VEGF-А, определяемого как соотношение VEGF-А/sVEGF-R1 не имело достоверных отличий между показателями в коже интактных животных и мышей с ХНБ (178,3±15,2 против 162,0±11,3). Содержание свободного VEGF-С в коже самок при этом увеличивалось под влиянием хронической боли — VEGF-С/sVEGF-R3 был равен 37,6±2,4 против 1,0±0,2 в коже интакт-ных мышей.
Через 3 недели после перевивки опухоли в ткани опухоли мышей группы сравнения отмечено резкое нарастание по сравнению с интактными животными содержания факторов семейства VEGF: уровень VEGF-А возрос в 5,5 раза, sVEGF-R1 — в 2,9 раза, уровень свободной фракции VEGF-А увеличился в 1,9 раза (VEGF-А/sVEGF-R1=332,2±35,1 против
178,3±11,3 в коже интактных мышей, р<0,05). Уровень VEGF-С увеличился в ткани опухоли самок группы сравнения в 8,9 раза, а содержание sVEGF-R3 — в 1,7 раза по сравнению с интактны-ми животными. В этой связи показатель уровня VEGF-С/sVEGF-R3 падал в коже мышей-самок группы сравнения в 5,2 раза (5,2±0,4 против 1,0±0,2 в коже интактных мышей, р<0,05).
Через 3 недели после перевивки опухоли на фоне ХНБ в ткани опухоли мышей основной группы уровень VEGF-А возрос в 23,4 раза, sVEGF-R1 — в 2,4 раза относительно показателей в контрольной группе мышей с ХНБ. Уровень свободной фракции VEGF-А у мышей основной группы увеличился в 4,7 раза (VEGF-А/sVEGF-R1=1564,0±163,1 против 332,2±35,1 в коже мышей с ХНБ, р<0,05). Содержание VEGF-С увеличилось в ткани опухоли у самок контрольной группы в 2,2 раза, а содержание sVEGF-R3 не изменилось по сравнению с контрольными животными. В этой связи соотношение VEGF-С/sVEGF-R3 в коже самок мышей этой группы увеличилось в 2,2 раза (82,4±6,4 против 37,6±2,4, р<0,05).
В коже мышей контрольной группы с хронической болью был повышен уровень эстради-ола относительно ткани интактных животных в 3 раза, эстрона — в 2,9 раза, прогестерона — в 2,1 раза (табл. 2). Содержание общего тестосте-
Таблица 5. Соотношение биогенных аминов в коже и опухоли Table 5. The ratio of biogenic amines in the skin and tumor
Группы ДА/НА НА/А Серотонин/5-ОИУК А/серотонин
Кожа интактная 5,3±0,5 1,8±0,14 1,3±0,11 7,8±0,65
Кожа ХНБ (контроль) 3,6±0,321 3,5±0,311 0,74±0,071 12,1±1,11
Опухоль 3 неделя роста меланомы B16/F10 - ткань опухоли
Группа сравнения 5,8±0,45 2,5±0,241 4,0±0,351 8,1±0,75
Основная группа 2,2±0,191,2,3 1,7±0,162,3 0,81±0,0741,3 13,3±1,11,3
Примечание: статистически значимые различия: 1 — по сравнению с интактной кожей; 2 — по сравнению с кожей ХНБ (контроль); 3 — по сравнению с группой сравнения Note: statistically significant differences: 1 — compared with intact skin; 2 — compared with skin CNB (control); 3 — compared with the comparison group
рона, свободного тестостерона и пролактина в коже мышей с хронической болью было снижено в 1,3 раза, 1,8 раза и 4,7 раза соответственно. Через 3 недели роста в ткани опухоли мышей группы сравнения повысился относительно показателя в коже интактных животных уровень эстрадиола в 1,3 раза и эстрона в 1,9 раза, при этом содержание общего тестостерона и про-лактина оставалось без изменения, а уровень свободного тестостерона снижался в 2,1 раза. В этот же срок в ткани опухоли мышей основной группы увеличение содержания относительно показателей контрольной группы животных отмечено для эстрона — в 1,3 раза, прогестерона — в 1,6 раза и пролактина — в 2,6 раза, при этом уровень эстрадиола, общего и свободного тестостерона оставался без изменений.
Наряду с содержанием гормонов, изменение рецепторного аппарата является одним из важных патогенетических механизмов роста злокачественных опухолей. Найдено, что у самок контрольной группы в коже в ответ на ХНБ резко возросло содержание эстрогеновых рецепторов — БРа и БРр в 3,7 раза и в 4 раза соответственно в сравнении с интактной кожей, и снизилась в 1,8 раз концентрация андрогеновых рецепторов (табл. 3). На уровень в коже рецепторов прогестерона ХНБ существенного влияния не оказала. Такие изменения, в совокупности с
возрастанием содержания эстрадиола и эстро-на и падением тестостерона, усугубляют создавшийся гормональный дисбаланс.
В ткани опухоли самок группы сравнения через 3 недели роста уровень рецепторов эстрогенов превышал показатели интактных животных: БРа в 4,1 раза, а БРр в 5,9 раза, рецепторов прогестерона РР4 — практически в 2 раза. Не найдено изменения уровня РА. В ткани опухоли у самок основной группы на этом сроке уровень всех рецепторов превышал показатели контрольной группы: БРа — в 1,6 раза, а БРр — в 1,4 раза, РР4 — в 1,9 раза, РА — в 2,1 раза.
Результаты изучения концентрации биогенных аминов и их соотношения представлены в таблицах 4, 5. Обнаружено, что у самок контрольной группы в коже содержалось в 1,7 раза меньше гистамина и в 1,5 раза серотонина, чем у интактных животных. В то же время уровень но-радреналина и дофамина оказался в 2,1 раза и в 1,4 раза больше, чем у интактных мышей (табл. 4). Коэффициенты дофамин/норадреналин (ДА/НА) и серотонин/5-ОИУК у животных с хронической болью были снижены в 1,5 раза и 1,8 раза соответственно, а норадреналин/адреналин (НА/А) — повышен в 1,9 раза (табл. 5). Коэффициент адреналин/серотонин, демонстрирующий реципрокные отношения адренергической — стрессреализующей и серотонинергической —
Таблица 6. Концентрация компонентов NO-системы в коже и опухоли Table 6. The concentration of components of the NO-system in the skin and tumor
Показатели Животные без опухоли Животные с меланомой B16/F10 через 3 недели — ткань опухоли
Кожа интактная Кожа ХНБ (контроль) Группа сравнения Основная группа
N0S-2 (нг/г ткани) 1,1±0,10 1,6±0,141 3,1±0,291 3,8±0,351,2
N0S-3 (нг/г ткани) 0,75±0,07 2,7±0,021 3,7±0,351 5,06±0,491,2,3
АДМА (мкМ/г ткани) 0,27±0,02 0,15±0,011 0,37±0,041 0,34±0,0312
Аргинин (мкМ/г ткани) 44,6±4,2 25,7±2,51 14,1±1,351 21,5±2,11,3
Общий нитрит (мкМ/г ткани) 10,48±0,9 11,6±1,1 12,95±1,25 14,1±1,391
Ьцитруллин (мкМ/г ткани) 8,2±0,78 7,6±0,74 15,9±1,481 13,7±1,311,2
Нитротирозин (нМ/г ткани) 0,81±0,07 1,05±0,091 1,16±0,101 1,06±0,091
Примечание: статистически значимые различия: 1 — по сравнению с интактной кожей; 2 — по сравнению с кожей ХНБ (контроль); 3 — по сравнению с группой сравнения Note: statistically significant différences: 1 — compared with intact skin; 2 — compared with skin CNB (control); 3 — compared with the comparison group
стресслимитирующей систем, оказался в 1,6 раза выше в коже у мышей с болью, по сравнению с интактными самками.
В ткани опухоли мышей группы сравнения через 3 недели после перевивки найдено резкое снижение уровня гистамина относительно показателя в коже интактных животных в 12,4 раза и 5-ОИУК в 1,4 раза на фоне повышения уровня адреналина в 1,3 раза, норадреналина — в 2,2 раза, дофамина — в 2,1 раза и серотони-на — в 1,3 раза. При этом были повышены только коэффициенты НА/А в 1,4 раза и серотонин/5-ОИУК в 3,1 раза.
Через 3 недели после перевивки в опухоли самок основной группы найдено снижение содержания норадреналина в 1,4 раза и дофамина в 2,2 раза, по сравнению с величинами в контроле. В то же время концентрация адреналина и серотонина в опухоли оказалась выше, чем в контроле в 1,5 раза и в 1,4 раза, соответственно. Повышение содержания серотонина сопровождалось снижением уровня 5-ОИУК в 1,3 раза.
В результате этого в меланоме изменилось соотношение биогенных аминов: дефицит дофамина выявлялся не только по абсолютным величинам, но и по коэффициенту ДА/НА, который был снижен относительно показателя в контроле в 1,6 раза, в то же время превалировала адренер-гическая система, так как коэффициент НА/А в опухоли снижался в 2,1 раза.
Результаты исследования концентрации компонентов NO-системы в у самок мышей представлены в таблице 6. Было обнаружено, что у мышей контрольной группы концентрация ферментов NOS-2 и NOS-3 была увеличена, соответственно, в 1,5 раза и в 3,6 раза, концентрация нитротиро-зина — в 1,3 раза по сравнению с группой интактных животных. Концентрация эндогенного ингибитора NO-синтазы АДМА была снижена в 1,8 раза, а концентрация субстрата ферментов — аргинина — в 1,7 раза.
Через 3 недели роста меланомы у мышей группы сравнения концентрация ферментов NOS-3 и NOS-2 в ткани опухоли была соответственно в
4,9 и в 2,8 раза выше, чем в коже интактных животных, также был повышен уровень АДМА в 1,4 раза, цитруллина — в 1,9 раза и нитротирози-на — в 1,4 раза. Концентрация аргинина на данном сроке была ниже уровня в здоровой коже в 3,1 раза. Через 3 недели роста меланомы у мышей основной группы концентрация ферментов NOS-3 и NOS-2 в ткани опухоли была выше, чем в коже животных контрольной группы в 1,9 и в 2,4 раза соответственно, уровень АДМА был повышен в 2,3 раза, цитруллина — в 1,8 раза.
Обсуждение
Активация сенсорной нервной системы в области злокачественной опухоли часто приводит к ощущению боли. Боль может предвещать развитие рака и может предоставить информацию о неопластической прогрессии, включая метастазы. Характер боли и продолжительность ее у онкологических больных полезно знать врачам и ученым, изучающим болезнь [5]. Стимуляция периферических афферентных ноцицепторов способствует боли при раке, однако молекулярные медиаторы и прямое взаимодействие, с помощью которых злокачественные или резидентные клетки модулируют ноцицепторы, точно не известны. Исследование основных элементов межклеточных путей позволило лучше понять этот процесс [6].
Ангиогенез порождает новые капилляры и, следовательно, приводит к васкуляризации тканей [7]. Ангиогенная активность у взрослых, как правило, низкая, за исключением заживления ран и женского репродуктивного тракта, где не-оваскуляризация происходит как нормальный аспект менструального цикла [8]. УБСБ является ключевым регулятором развития, физиологической и патологической неоваскуляризации, особенно вовлеченной в рост опухоли.
В настоящем исследовании показано, что ХНБ самок мышей активирует факторы ангиогене-за не только в коже, но и в ткани опухоли. При этом найдено значительное повышение уровня эстрогенов и прогестерона в указанных образцах. Считается, что неоваскуляризация в репродуктивных тканях регулируется стероидными гормонами, в частности 17-р-эстрадиолом [9]. Известно, что рецепторы эстрогена тесно связаны с ангиогенезом при различных видах рака
[10]. Кроме того, при лечении эстроген-рецептор-положительного рака молочной железы селективные модуляторы эстрогенных рецепторов могут эффективно ингибировать ангиогенез [11].
VEGF является высокоспецифичным фактором стимуляции пролиферации сосудистых эндотелиальных клеток и образования коллатеральных сосудов [12]. Результаты исследования [13] продемонстрировали, что лечение 17-р-эстрадиолом стимулировало ангиогенез in vitro, указывая на то, что эстроген или его сигнальный путь могут представлять собой новый терапевтический метод в лечении артериальной недостаточности. Результаты исследования [14] показали, что параметры ангиогенеза могу быть изменены под влиянием экзогенных факторов, таких как гонадотропины и прогестерон.
Кроме увеличения уровня эстрогенов в настоящем исследовании показано, что ХНБ вызывала значимое увеличение уровня рецепторов эстрогенов в коже и ткани меланомы B16/F10. Эстра-диол связывается со своими классическими рецепторами — ERa и ERp и запускает геномные и негеномные эффекты. Экспрессия и функция рецепторов эстрогена являются тканеспецифич-ными. Классические механизмы взаимодействия эстрадиола с рецептором включают связывание лиганда, димеризацию рецептора и активацию эстрогенных элементов ответа в генах-мишенях, приводящих к активации или репрессии генов. Например, HIF-1 a представляет собой транскрипционный фактор, предложенный в качестве кандидата для эстрадиол-индуцированной регуляции гена VEGFA [15].
Данные [16] показали, что эстроген может способствовать связыванию ER с сайтом ERE в промоторе р-катенин. Авторы заключают, что эстроген активирует р-катенин по-разному. На уровне генов эстроген побуждает ERa напрямую связываться с сайтом ERE промотора р-катенина. На уровне белка эстроген инактивирует GSK3p, чтобы уменьшить его деградацию. Накопленный р-катенин поступает в ядро для запуска передачи сигналов Wnt/p-катенин, что впоследствии приводит к усилению регуляции VEGF. Вкратце, передача сигналов Wnt/p-catenin действует как мост, соединяющий эстроген и VEGF.
У самок мышей под влиянием ХНБ в коже формировалось доминирование адренергической
системы над серотонинергической, а также активация норадренергической системы. Можно провести некоторую параллель в реакции биогенного баланса кожи на ХНБ и развитие ме-ланомы. Это касается повышения уровня нор-адреналина, дофамина и снижения серотонина. Очевидно, что изменения нейроэндокринного фона кожи являлись неспецифической реакцией организма, как на болевые воздействия, так и на введение злокачественных клеток, однако в первом случае, длительность воздействия привела к истощению защитных возможностей органа. Такое нарушение баланса между стрессреализующими и стресслимитирующими системами могло сказаться на локальной противоопухолевой защите и способствовать быстрому росту меланомы. Изменение нейроэн-докринного фона под влиянием ХНБ, очевидно, оказало влияние на защитную функцию кожи, ослабив ее барьерные свойства.
Особый интерес представила редукция уровня гистамина в коже самок мышей. Гиста-мин влияет на многие иммунные процессы, модулирует функции кератиноцитов и мелано-цитов, влияет на внутриклеточные сигнальные каскады, регулирующие пролиферацию клеток и меланогенез. Н4-рецепторы гистамина участвуют в активации лимфоцитов, эозинофилов и тучных клеток [17], доказана их роль в развитии аллергических заболеваний [18]. Низкий уровень гистамина под влиянием ХНБ может быть связан со снижением содержания тучных клеток в коже, что свидетельствует об угнетении местного иммунитета. Предполагают, что соблюдение равновесия в содержании гистамина и работе ферментов, метаболизирующих диамин, играет важную роль в неспецифической резистентности организма [19]. Некоторые экспериментальные исследования указывают на возможность применения синтетических агонистов Н4-рецептора гистамина или самого диамина, в качестве таргетных препаратов при меланоме кожи [20]. Эксперименты in vivo с первичной меланомой показали, что у мышей, получавших гистамин или клозапин, агонист для Н4-рецепторов гистамина, произошло увеличение медианы выживаемости, связанное с уменьшением опухолевого роста и внутриопу-холевой неоваскуляризации [21].
Опухоли так же, как и органы, иннервируют-ся волокнами симпатической нервной системы и способны к синтезу и/или захвату из окружающих тканей нейротрансмиттеров с целью аутокринно/паракринной регуляции своего роста [22]. Данные литературы о применении в эксперименте р-адреноблокаторов для снижения метастатического потенциала меланомы кожи подтверждают возможность такого воздействия хронической боли [23].
Результаты исследования различных моделей боли свидетельствуют об участии всех изоформ N0-синтаз и, следовательно, самого оксида азота в механизме развития воспалительной, ней-рогенной, онкологической боли, герпетической аллодинии [24].
Анализируя результаты работы, очевидно, что функционирование вазоактивной N0-системы претерпевает значительные изменения, как в процессе обычного роста меланомы, так и в процессе роста опухоли на фоне ХНБ. Следует обратить внимание на то, что у самок мышей при развитии хронической боли наблюдается активация N0-системы в коже как за счет увеличения концентрации ферментов — N0S-3 и N0S-2, так и за счет снижения уровня их эндогенного ингибитора АДМА. Обнаруженное на уровне статистической тенденции увеличение концентрации нитротирозина, может свидетельствовать о токсичности образующегося N0, например, в результате образования пероксинитрита. Это может способствовать ингибированию Т-клеточного ответа на опухолевые антигены [25, 26], вносимые в виде клеток перевиваемой меланомы В16/Р10. Т.е., состояние хронической боли способствует развитию в коже состояния иммунологической толерантности, что может быть одной из причин показанного нами более раннего появления подкожных опухолей у мышей с ростом мелано-мы на фоне хронической боли [4].
Оксид азота является важным регулятором процессов, связанных с выживанием опухолевых клеток, их пролиферацией, инвазией [27]. Проопухолевые эффекты N0' дозозависимы и реализуются через регулирование экспрессии и активности N0-синтаз, активности процессов (де-)нитрозилирования. Установлена важная роль системы оксида азота (наряду с экспрессией проангиогенных факторов роста) в процес-
сах ангиогенеза и лимфангиогенеза [28]. Ангио-генный эффект VEGF-А опосредуется действием оксида азота, т.к. активация сигнального пути VEGF-А активирует NOS-3, стимулируя образование NO в различных опухолях, в том числе и в меланоме [29]. Действие VEGF-C также связано со стимуляцией эндотелиальной NOS-3: ингиби-рование NOS-3 приводит к уменьшению количества опухолевых клеток, достигающих сторожевого лимфатического узла, и, таким образом, снижается вероятность образования макроскопических метастазов [30]. У пациентов с мелано-мой при повышенной экспрессии NOS-2 наблюдалось снижение выживаемости [29].
Результаты нашего исследования показывают, что при развитии у самок мышей меланомы В16 после стандартной перевивки в ткани опухоли наблюдается увеличение концентрации NOS-3 и NOS-2. При росте меланомы В16 на фоне ХНБ концентрация NOS-3 и NOS-2 в ткани опухоли также увеличивалась, при этом концентрация NOS-3 была выше, чем у мышей с обычным ростом меланомы. Как правило, более высокая экспрессия NOS и, соответственно, продуцирование NO' увеличивают вероятность S-нитрозилирования клеточных белков, которые могут способствовать онкогенезу [27]. Кроме того можно предположить, что увеличение концентрации ингибитора NO-синтаз АДМА может указывать на возможную активацию NOS-независимых путей метаболизма аргинина на определенных этапах роста меланомы B16/F10 с образованием, например, полиаминов, имеющих определенное значение в пролиферации опухолевых клеток и их выживании [31]. Некоторое накопление цитруллина в ткани опухоли при росте меланомы как после стандартной перевивки опухоли, так и на фоне ХНБ может быть следствием ингибирования его реакции с аспартатом (при превращении цитруллина в аргинин) — поддержание пула аспартата для синтеза нуклеотидов в опухолевых клетках и обеспечения активности их пролиферации [32].
Заключение
Представленные в работе результаты могут являться подтверждением системного влияния хронической нейрогенной боли как фонового процесса, под воздействием которого значительно изменяется функционирование вазоактивной
NO-системы и нейрогуморальной системы, приводя к формированию условий активации процессов ангиогенеза и стимуляции роста опухоли.
Литература
1. Яхно Н.Н., Кукушкин М.Л. Хроническая боль: медико-биологические и социально-экономические аспекты // Вестник РАМН. — 2012. — Т. 67, №9. — С. 54-58. https://doi.org/10.15690/vramn.v67i9.407
2. Machelska H., Chelik M.O. Recent advances in understanding neuropathic pain: glia, sex differences, and epigenetics // F1000Research. — 2016. — №5. — P. 2743.
3. Sheahan T.D., Siuda E.R., Bruchas M.R., et al. Inflammation and nerve damage minimally affect the voluntary behavior of the mouse, suggested as indicators of pain // Neurobiology of Pain. — 2017. — №2. — P. 1-12.
4. Кит О.И., Франциянц Е.М., Котиева И.М., и др. Некоторые механизмы повышения злокачественности меланомы на фоне хронической боли у самок мышей // Российский журнал боли. — 2017. — №2 (53). — С. 14-20.
5. Schmidt B.L. What Pain Tells Us About Cancer // Manage Pain. — 2015. — №156 (Suppl 1). — P. 32-34.
6. Schmidt B.L. The Neurobiology of Cancer Pain // Neuroscientist. — 2014. — Vol. 20, №5. — P. 546-562.
7. Ambrose C.T. The role of capillaries in the lesser ailments of old age and in Alzheimer's disease and vascular dementia: The potential of pro-therapeutic angiogenesis // Journal of Alzheimer's Disease. —
2016. — №54. — Р. 31-43.
8. Elkilani O.A., Soliman M.A. Angiogenesis mediators in women with idiopathic heavy menstrual bleeding // International Journal of Gynecology & Obstetrics. —
2017. — №136. — P. 280-284.
9. Dhole B., Gupta S., Venugopal S.K., Kumar A. Triiodothyronine stimulates VEGF expression and secretion via steroids and HIF-1a in murine Leydig cells // Syst. Biol. Reprod. Med. — 2018. — Vol. 64, №3. — P. 191-201.
10. Bharti J.N., Rani P., Kamal V., Agarwal P.N. Angiogenesis in breast cancer and its correlation with estrogen, Progesterone receptors and other prognostic factors // Journal of Clinical and Diagnostic Research. — 2015. — Vol. 9, №1. — P. 5-7.
11. Shim J.S., Li R., Lv J., et al. Inhibition of angiogenesis by selective estrogen receptor modulators through blockade of cholesterol trafficking rather than
estrogen receptor antagonism // Cancer Letters. — 2015. — Vol. 362, №1. — P. 106-115.
12. Cartland S.P., Genner S.W., Zahoor A., Kavurma M.M. Comparative evaluation of TRAIL, FGF-2 and VEGF-A-induced angiogenesis in vitro and in vivo // International Journal of Molecular Sciences. — 2016. — Vol. 17, №12. — P. 2025.
13. Liu H., Tao Y., Chen M., et al. 17ß-Estradiol Promotes Angiogenesis of Rat Cardiac Microvascular Endothelial Cells In Vitro // Medical Science Monitor. — 2018. — №24. — P. 2489-2496.
14. Rashidi B., Mardani M., Karizbodagh M.P. Evaluation of Progesterone and Ovulation-stimulating Drugs on the Glandular Epithelium and Angiogenesis in Mice // Advanced biomedical research. — 2017. — №6. — P. 116.
15. Fatima L.A., Campello R.S., Santos R.S., et al. Estrogen receptor 1 (ESR1) regulates VEGFA in adipose tissue // Scientific reports. — 2017. — Vol. 7, №1. — P. 16716.
16. Ling Zhang, Wenqian Xiong, Yao Xiong, et al. 17 b-Estradiol promotes vascular endothelial growth factor expression via the Wnt/b-catenin pathway during the pathogenesis of endometriosis // Molecular Human Reproduction. — 2016. — Vol. 22, №7. — P. 526-535. https://doi.org/10.1093/molehr/ gaw025.
17. Takeshita K., Sakai K., Bacon K.B., Gantner F. Critical Role of Hista-mine H4 Receptor in Leukotriene B4 Production and Mast Cell-Dependent Neutrophil Recruitment Induced by Zymosan in Vivo // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. — 2003. — Vol. 307, №3. — P. 1072-1078.
18. Lazewska D., Kiec-Kononowicz K. Azines as histamine H4 receptor antagonists // Frontiers in Bioscience (Scholar Edition). — 2012. — Vol. 1, №4. — P. 967-987.
19. Akhalaya M.Ya., Goncharenko E.N., Kudryashova N.Yu. Influence of natural radioprotector carnosine on histamine-diaminooxydase system in myocardium of rats after action of various extreme factors. // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2001. — Т. 41, №1. — С. 56-58.
20. Massari N.A., Medina V.A., Cricco G.P., et al. Antitumor activity of histamine and clozapine in a mouse experimental model of human melanoma // Journal of Dermatological Science. — 2013. — Vol. 72, №3. — P. 252-262.
21. Massari N.A., Nicoud M.B., Sambuco L., et al. Histamine therapeutic efficacy in metastatic melanoma: Role of
histamine H4 receptor agonists and opportunity for combination with radiation // Oncotarget. — 2017. — Vol. 8, №16. — P. 26471-26491.
22. Li S., Sun Y., Gao D. Role of the nervous system in cancer metastasis (Review) // Oncology Letters. — 2013. — Vol. 5, №4. — P. 1101-1111.
23. Wnorowski A., Sadowska M., Paul R.K., et al. Activation of p2-adrenergic receptor by (R,R')-4'-methoxy-1-naphthylfenoterol inhibits proliferation and motility of melanoma cells // Cellular Signalling. — 2015. — Vol. 27, №5. — P. 997-1007.
24. Yang Y., Zhang J., Liu Y., et al. Role of nitric oxide synthase in the development of bone cancer pain and effect of L-NMMA // Molecular Medicine Reports. — 2016. — Vol. 13, №2. — P. 1220-1226.
25. Rodriguez P.C., Quiceno D.G., Ochoa A.C. L-arginine availability regulates T-lymphocyte cell-cycle progression // Blood. — 2007. — №109. — P. 1568-1573.
26. Viola A., Bronte V. Metabolic mechanisms of cancer-induced inhibition of immune responses // Seminars in Cancer Biology. — 2007. — Vol. 17, №4. — P. 309316.
27. Rizi B.S., Abhinav Achreja, Deepak Nagrath. Nitric oxide — the forgotten child of tumor metabolism // Trends in Cancer. — 2017. — Vol. 3, №9. — P. 659-672.
28. Saleh A., Stathopoulou M.G., Dade S., et al. Angiogenesis related genes NOS3, CD14, MMP3 and IL4R are associated to VEGF gene expression and circulating levels in healthy adults // BMC Medical Genetics. — 2015. — Vol. 5, №16. — P. 90.
29. Vahora H., Khan M.A., Alalami U., Hussain A. The Potential Role of Nitric Oxide in Halting Cancer Progression Through Chemoprevention // European Journal of Cancer Prevention. — 2016. — Vol. 21, №1. — P. 1-12.
30. Lahdenranta J., Hagendoorn J., Padera T.P., et al. Endothelial nitric oxide synthase mediates lymphangiogenesis and lymphatic metastasis // Cancer Research. — 2009. — №69. — P. 2801-2808.
31. Peters M.C., Minton A., Phanstiel O., Gilmour S.K. A Novel Polyamine-Targeted Therapy for BRAF Mutant Melanoma Tumors // Medical Sciences (Basel). — 2018. — Vol. 6, №1. — P. 3.
32. Rabinovich S., Adler L., Yizhak K., et al. Diversion of aspartate in ASS1-deficient tumours fosters de novo pyrimidine synthesis // Nature. — 2015. — №527. — P. 379-383.
