CC BY
108
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2008 Биология Вып. 9(25)
Микробиология
УДК 557.175.6
ВЛИЯНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА СЕКРЕЦИЮ МОНОЦИТАМИ ЭЛАСТАЗЫ И КАТЕПСИНА С. РОЛЬ TOLL-ПОДОБНЫХ ПРОТЕИНОВ
С. А. Заморинаа, С. В. ШиршеваЬ
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,614081, г. Пермь, ул. Голева, 13 ь Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Изучены эффекты воздействия хорионического гонадотропина на секрецию моноцитами эла-стазы и катепсина G - сериновых протеиназ, участвующих в ремоделировании тканей. Показано, что регуляция гормоном секреции эластазы и катепсина G осуществляется с вовлечением молекул То11-подобных протеинов. Таким образом, установлен новый механизм взаимодействия гормона с моноцитами, опосредованный То11-подобными протеинами, которые выступают в качестве «альтернативных» рецепторов гормона.
Введение
Хорионический гонадотропин (ХГ) называют гормоном беременности, поскольку у мужчин и небеременных женщин он практически не определяется. По своей структуре это сиализированный гетеро-димерный гликопротеин, состоящий из двух нековалентно связанных субъединиц и содержащий прмер-но 30% углеводов. а-субъединица является общей для лютеинизирующего (ЛГ), фолликулостимулирующего (ФСГ) и тиреотропного (ТТГ) гормонов; р-субъединица значительно отличается от р-субъединиц ТТГ и ФСГ, однако на 80% (первые 115 аминокислот из 145) гомологична ЛГ (Acevedo, 2002). В силу структурного сходства ХГ и ЛГ реализуют свои эффекты через общий гормональный ЛГ/ХГ рецептор.
Однако, являясь по своей структуре гликопротеином, ХГ способен взаимодействовать с клетками иммунной системы через мембранные молекулы, которые не являются его «классическими» рецепторами, в частности, через молекулярные структуры, обозначаемые в современной литературе термином «паттерн-распознающие рецепторы», которые также являются неклональными филогенетически законсервированными рецепторами для распознавания патоген-ассоциированных молекулярных структур (Симбирцев, 2005).
Основными претендентами на роль «альтернативных» связывающих молекул для ХГ являются Toll-подобные рецепторы (TLR) (Ширшев, 2002). TLR принадлежат к семейству лейцинобогатых протеинов, они взаимодействуют как с гидрофобной, так и гидрофильной поверхностями рецепти-
рующих молекул через амфипатические петли, формируемые многократно повторяющимися структурами (Hashimoto et al., 1998). В то же время внеклеточный домен ЛГ/ХГ-рецептора также включает в себя множество лейцинобогатых повторов, формирующих гомологичные сайты с TLR (Rosemblit et al., 1988). Одной из экспрессируемых изоформ TLR являются TLR4, широко представленные на моноцитах и участвующие в связывании липополисахаридов (ЛПС) бактерий. В последние годы установлено, что TLR могут распознавать ряд эндогенных продуктов, появление которых не связано с инфицированием. К эндогенным активаторам TLR такого рода относят белки теплового шока и мочевую кислоту, а также продукты некроза и апоптоза (Tsan and Gao, 2004). Мы предполагаем, что ХГ также может являться эндогенным лигандом для TLR.
Основные иммуномодулирующие эффекты ХГ реализуются в присутствии моноцитов и/или макрофагов, которые во время беременности активно инфильтрируют децидуальную ткань и плаценту, осуществляя множество функций, включая секреторную (Hunt, 1989). В частности, продуктами секреции моноцитов являются сериновые протеиназы эластаза и катепсин G (Nathan, 1987), которые участвуют в ремоделировании тканей в период инвазивного роста плаценты, а также в процессах воспаления.
Целью работы являлось изучение роли TLR4 в реализации модулирующих эффектов ХГ на секрецию моноцитами эластазы и катепсина G.
© С. А. Заморина, С. В. Ширшев, 2008
Материалы и методы исследования
В работе использовали фракционированные моноциты периферической крови здоровых небеременных женщин, находящихся в фолликулярной фазе менструального цикла. Мононуклеарные клетки получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3); полученную суспензию после двойной отмывки средой 199 помещали на чашки Петри с 5% ЭТС и инкубировали 45 мин при 37° С, затем адгезировавшие моноциты снимали механическим способом, дважды отмывали и стабилизировали инкубированием в течение 45 мин при 40°С (Pertof, 1980). Чистота выделения моноцитов, оцениваемая иммуно-флуоресцентным методом с использованием моноклональных антител к CD14 (Primary Anti-Human CD14; «ICN Ph.», США), составляла 85%. Полученные клетки (106 в мл) инкубировали в течение часа при 37°С с ХГ в дозе 100 МЕ/мл, отражающей уровень гормона в крови женщин в I триместре беременности (Wide, 1962). В ряде исследований применяли моноклональные антитела к TLR4 (МКА-TLR4) («eBioscience», Канада; clone HTA125; 0,5 мг/мл) в количестве 5 мкл на пробу, которые инкубировали с клетками в течение часа при 4° С перед внесением гормона.
Учитывая, что взаимодействие ХГ с «классическим» ЛГ/ХГ рецептором, который представлен на моноцитах (Alexander et al. 1998), приводит к повышению внутриклеточного уровня циклического аденозинмонофосфата (цAMФ), активирующего протеинкиназу А (ПКА) (Rao, 2004), в исследовании применяли блокатор ПКА Н-89 («ICN Ph», США) в концентрации 10 мкМ/мл (Parvathenani, 1998).
Уровень эластазы в клеточных супернатантах определяли спектро-фотометрическим методом, основанным на гидролитической активности этого фермента с использованием специфического синтетического субстрата №альфа-бензол^-аргинин-этилового эфира гидрохлорид (N-alpha-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride) (BAEE, «Sigma», США), растворенного в ацетонитриле. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 340 нм в течение 15 мин с 5-минутными интервалами. Активность эластазы выражали в нМ гидролизованного субстрата за 1 мин на 1,0 мл супернатанта (нМ/мл/мин) (O’Connor, 1993; Митенькина, 2004).
Уровень катепсина G также оценивали спектрофотометрическим методом с использованием синтетического субстрата №альфа-бензол^-тиро-зин-этилового эфира гидрохлорид (N-alpha-Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester hydrochloride) (BTEE, «Sigma», США), растворенного в метаноле. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 340 нм в течение 10 мин с одноминутными интервалами. Активность катепсина G выражали в мкмоль гидролизованного субстрата за 1 мин на 1,0 мл супернатанта (мкмоль/мл/мин) (Гребенкин
и Шипулин, 1999; Митенькина, 2004).
При помощи внутригуппового дисперсионного анализа показана возможность применения t-критерия Стьюдента. Для определения достоверности различий использовали парный ^критерий Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Ранее нами было показано, что часовая инкубация ХГ с фракционированными моноцитами практически вдвое снижала уровень детекции молекул СБ14, ассоциированных с TLR4 (Ширшев и Заморина, 2004). Наиболее выраженным эффектом обладала высокая доза гормона (100 МЕ/мл), соответствующая 7-10-й неделе беременности, когда наблюдается пик экспрессии антигенов гистосовместимости клетками эмбриона. Поэтому в дальнейшем изучали эффекты высокой дозы гормона и роль TLR4 в их реализации.
Установлено, что ХГ повышал уровень эласта-зы в супернатантах кратковременных культур моноцитов. Однако, стимулирующий эффект ХГ(100 МЕ/мл) на фоне блокады TLR4 был достоверно выше самостоятельных эффектов анти-TLR4 и ХГ 100 МЕ/мл (рис. 1). Таким образом, блокада TLR4 способствовала реализации стимулирующего эффекта ХГ на продукцию эластазы, что связано, вероятно, с суммированием эффектов на уровне трансдукции гормонального сигнала.
нМ/мл/мин
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 1. Значение TLR4 и ПКА в ХГ-зависимой регуляции секреции эластазы моноцитами:
1 - контроль; 2 - ХГ 1GG ME/мл; 3 - MKA-TLR4; 4 -
ХГ 1GG ME/мл + MKA-TLR4; 5 - ХГ 1GG ME/мл + MKA-TLR4+H-89; 6 - H-89; 7 - ХГ 1GG ME/m+H-89
Примечание: здесь и в рис. 2: а - достоверные (p<G,G5) отличия по t-критерию Стьюдента с контролем; b - с гормоном; с - c abTLR4; d - с Н-В9
Показано, что ХГ на фоне блокады ПКА оказывал стимулирующий эффект на секрецию эластазы моноцитами. Важно отметить, что этот эффект был достоверно выше, чем самостоятельные стимулирующие эффекты блокадатора ПКА и ХГ.
Интересно, что в условиях двойной блокады гормонального сигнала (MКA-TLR4 и ПКА) гормон реализует стимулирующий эффект на секрецию эластазы, но связано это, по-видимому, с са-
Влияние хорионического гонадотропина
79
мостоятельным действием применяемых блокато-ров. Таким образом, в случае «выключения» тран-дукции с ЛГ/ХГ-рецептора гормон реализует свой стимулирующий эффект на секрецию эластазы, вовлекая молекулы TLR4.
Установлено, что гормон угнетал продукцию катепсина G. Однако эффект гормона полностью отменяется на фоне блокады TLR4 (рис. 2), что свидетельствует о вовлечении этих рецепторов в моноцит-модулирующее действие ХГ по отношению к секреции катепсина G.
Мкмоль/мл/мин
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 2. Значение ТЬЯ4 и ПКА в ХГ-зависимой регуляции секреции катепсина G моноцитами:
1 - контроль; 2 - ХГ 100 МЕ/мл; 3 - МКА-TLR4; 4 -
ХГ 100 МЕ/мл + МКА-TLR4; 5 - ХГ 100 МЕ/мл + МКА-TLR4+H-89; 6 - Н-89; 7 - ХГ 100 МЕ/мл+Н-89
В то же время на фоне блокады ПКА гормон не влиял на секрецию катепсина G. Парадоксально, но в условиях двойной блокады (МКА-TLR4 и ПКА) ХГ реализовал свой депрессивный эффект, который, по-видимому был связан с самостоятельным эффектом Н-89. Таким образом, в случае «выключения» трандукции с ЛГ/ХГ-рецептора самостоятельный депрессивный эффект гормона отменялся, что свидетельствует о частичном вовлечении этого рецептора в реализацию гормонального сигнала.
Анализируя полученные результаты, можно утверждать, что регуляция гормоном секреции эластазы и катепсина G осуществляется с вовлечением молекул TLR4.
Ранее нами было показано, что регуляция гормоном фагоцитарной активности моноцитов также осуществляется с вовлечением молекул TLR4. Однако ХГ-зависимая модуляция уровня секреторной и внутриклеточной миелопероксидазы не зависит от TLR4 и реализуется, по-видимому, через «классический» ЛГ/ХГ-рецептор (Ширшев и Заморина, 2006).
Возможно, связывание ХГ с TLR4 является одним из фетопротективных механизмов при физиологически протекающей беременности, поскольку теоретически способно ограничивать ЛПС-индуцированные патологические реакции, приводящие к самопроизвольным абортам. TLR и связанный с ними активационный сигнальный путь являются одной из наиболее древних эволюционно консервативных рецепторных и сигнальных сис-
тем, служащих для распознавания патогенов и активации защитных реакций. ХГ, в свою очередь, также является древним гликопротеином, хорошо сохранившимся в ходе эволюции. Аналоги этого гормона обнаружены у насекомых; кроме того, он синтезируется рядом опухолевых клеток и некоторыми бактериями (Acevedo, 2002). Возможно, способность ХГ взаимодействовать с TLR4 сформировалась в процессе эволюции и может затрагивать другие примитивные распознающие системы. Например, Kosaka K. et al. (2002) и другие авторы предполагают участие С-лектинов в реализации эффектов ХГ и воздействие их на продукцию моноцитами интерлейкина-8.
Таким образом, установлен новый механизм реализации ХГ-регулирующего действия на моноциты, опосредованный TLR4, которые могут выступать в качестве «альтернативных» рецепторов гормона.
Работа выполнена при поддержке Фонда содействия отечественной науке.
Список литературы
Митенькина, Е.В. Сериновые протеиназы в комплексной оценке тяжести преэклампсии: авто-реф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.01 / Митенькина Елена Викторовна. Пермь, 2003, 22 с. Симбирцев, А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета // Иммунология. 2005. №6. С. 368-377.
Способ оценки тяжести ОПГ-гестоза: пат. 2133037 Рос. Федерация / Гребенкин Б.Е., Шипулин А.Н. заявл. 10. 07.1999.
Ширшев, С.В. Механизмы иммуноэндокринного контроля процессов репродукции: в 2 т. Т. 2. / С.В. Ширшев. Екатеринбург: УрО РАН, 2002. 557 с.
Ширшев, С.В. Роль CDH-ассоциированных молекул в иммуно-модулирующей активности хорионического гонадотропина / С.В. Ширшев, С.А. Заморина // Докл. АН. 2006. Т. 395, № 2. C. 277-279.
Ширшев, С.В. Роль Toll-подобных протеинов в реализации эффектов хорионического гонадотропина на функциональную активность моноцитов / С.В. Ширшев, С.А. Заморина // Докл. АН. 2006. Т. 409, № 5. C. 699-701.
Acevedo, H.F. Human chorionic gonadotropin (hCG), the hormone of life and death: a review // J. Exp. Ther. Oncol. 2002. № 2(3). Р. 133-145.
Alexander, H. HCG Secretion by periperal mononuclear cells during pregnancy / H. Alexander, G. Zimmerman, M. Lehmann [et al.] // Domest. An. Endocrinol. 1998. Vol. 15, № 15. P. 377-387. Hashimoto, C. The Toll gene of Drosophila, required for dorsal-ventral embryonic polarity, appears to encode a transmembrane protein / C. Hashimoto, K.L.
Hudson, K.V. Anderson // Cell. 1988. Vol. 52. P. 269-279.
Hunt, J.S. Macrophages in human uteroplacental tissues: a review // Am. J. Reprod. Immunol. 1989. Vol. 21. P. 119-122.
Kosaka, K. Human chorionic gonadotropin (HCG) activates monocytes to produce interleukin-8 via a different pathway from luteinizing hormone/HCG receptor system / K. Kosaka, H. Fujiwara, K. Tat-sumi [et al.] // J. Clin. Endocrinol Metab. 2002. Vol. 87, № 11. P. 199-208.
Nathan, C.F. Secretory products of macrophages // J.
Clin. Invest. 1987. Vol. 79, № 2. P. 319-326. O'Connor, C.M. Alpha 1-Proteinase inhibitor, elastase activity, and lung disease severity in cystic fibrosis / C.M. O'Connor, K. Gaffney, J. Keane, A. Southey [et al.] // Am. Rev. Respir. Dis. 1993. Vol. 148, № 6. P. 1665-1670.
Parvathenani, L.K. Type I cAMP-dependent Protein Kinase Delays Apoptosis in Human Neutrophils at a Site Upstream of Caspase-3 / L.K. Parvathenani, E.S. Buescher, E. Chacon-Cruz, S.J. Beebe // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, t. 12. P. 6736-6743.
Pertof, H. Separation of human monocytes on density gradients of Percoll / H. Pertof, A. Johnsson, B. Warmegard, R. Seljelid // J. Immunol. Meth.. 1980. Vol. 33. P. 221-229.
Rao, Ch.VFunctional luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptors in human adrenal cortical H295R cells / Ch.V. Rao, X.L. Zhou, Z.M. Lei // Biol. Reprod. 2004. № 71(2). Р. 79-87.
Rosemblit, N. Characterization of an antiserum to the rat luteal luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor / N. Rosemblit, M. Ascoli, D.L. Segaloff // Endocrinology. 1988. Vol. 123. P. 2284-2290.
Tsan, M.F. Endogenous ligand of Toll-like receptor / M.F. Tsan, B. Gao // Leykocyte Biology. 2004. Vol. 76. P. 515-520.
Wide, L. An immunological method for the assay of human chorionic gonadotrophin //Acta Endocrinol. (Kbh). 1962. Vol. 41, suppl. 70. P. 1-100.
Поступила в редакцию 21.04.2008
Chorionic gonadotropin effect on monocyte secretion of elastase and cathepsin G. Role of Toll-like proteins
S.A. Zamorina, S.V. Shirshev
Chorionic gonadotropin effects on monocyte secretion of elastase and cathepsin G - serine proteases participating in tissue remodeling have been studied. It was shown that hormone regulation of elastase and cathepsin G secretion was accomplished with the Toll-like proteins involvement. Thus, a novel mechanism of hormone-monocyte interaction was determined that was mediated by Toll-like proteins that appeared to be the “alternative” hormone receptors.
