CC BY
40
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2012 БИОЛОГИЯ Вып. 3
УДК 612.018:612.017.1:611.018.53
ВЛИЯНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА ПРОДУКЦИЮ ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 ИНТАКТНЫМИ МОНОЦИТАМИ. РОЛЬ ТОЬЬ-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
С. А. Заморина3, С. В. Ширшев3 ь
11 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13;
mantissa7@mail.ru; (342)2808431 ь Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; shirshev@iegm.ru
Изучены эффекты хорионического гонадотропина (ХГ) на продукцию интелейкина-8 (ИЛ-8) интактными моноцитами женщин. Показано, что стимуляция гормоном (100 МЕ/мл) продукции ИЛ-8 осуществляется с вовлечением молекул То11-подобных протеинов 4 (Т1Л4), так как блокада этих рецепторов антителами частично отменяла эффект ХГ. Таким образом, установлен новый механизм взаимодействия гормона с моноцитами, опосредованный молекулами Т1Л4, которые выступают в качестве «альтернативных» рецепторов гормона.
Ключевые слова: хорионический гонадотропин; интерлейкин-8; 1о11-подобные рецепторы 4 типа.
Введение
Хорионический гонадотропин (ХГ) - гликопроте-иновый гормон, трофобластный аналог лютеинизи-рующего гормона (ЛГ), активно участвует в контроле иммунных процессов, сопровождающих беременность [Magnie et al. 1990; Ширшев, 1998; Ширшев, Куклина, Ярилин, 2003; Ширшев, Куклина, 2005; Ширшев, Заморина, 2011]. Согласно концепции H.F. Acevedo (2002 г.), ХГ не имеет своего «истинного» рецептора, реализуя эффекты через гормональный ЛГ-рецептор за счет высокой степени гомологии с ЛГ. Однако в моноцитах периферической крови небеременных женщин обнаружены лишь следовые количества ДНК ЛГ -рецептора [Kosaka et al., 2002], в то время как ХГ эффективно модулирует функциональную активность моноцитов женщин.
Ранее нами было показано, что ХГ вовлекает в реализацию своих эффектов на уровне моноцитов молекулы То11-подобных протеинов (TLR4), относящихся к паттерн-распознающим рецепторам (ПРР) [Ширшев, Заморина, 2006]. В основе этого взаимодействия лежит структурное сходство внеклеточных доменов ЛГ-рецептора и TLR4-pcucn-тора, основанное на высоком содержании лейцина (так называемые leucin rich repeat (LRR)) [Rosemblit, Ascoli, Segaloff, 1988; Bhowmick et al., 1996]. Молекулы TLR могут распознавать ряд эндогенных продуктов, появление которых не связа-
но с инфицированием [Tsan, Gao, 2004], и, таким образом, ХГ является эндогенным лигандом для TLR.
Известно, что введение ■ ^субъединицы ХГ (или синтетических олигопептидов, родственных по структуре) в критических состояниях, индуцированных присутствием большого количества бактериальных липополисахаридов (ЛПС), способно останавливать воспалительные реакции [van den Berg et al., 2011]. Вероятнее всего, это происходит в силу способности гормона выступать как конформацион-ный антагонист ЛПС. Таким образом, расшифровка молекулярного механизма действия ХГ, связанного с ПРР на уровне клеток иммунной системы, является фундаментальной задачей, связанной с изучением филогенетически древнего механизма реализации гормон-модулирующей активности.
Неоднозначную роль во время беременности играет интерлейкин-8 (ИЛ-8), являясь цитокином, обеспечивающим ангиогенез и защиту плацентарных оболочек. Вызывая направленную миграцию лейкоцитов в очаг воспаления, он повышает внутриклеточную гибель микроорганизмов, активируя освобождение ими коллагеназы и эластазы, ферментов, расщепляющих внеклеточный матрикс, вырабатываемый цервикальными фибробластами, вовлекается в патологический процесс при преждевременных родах [цит. по: Чистякова и др., 2005]. В 2002 г. показана ХГ -индуцируемая продукция ИЛ-8
О Заморина С. А., Ширшев С. В., 2012
моноцитами небеременных женщин, авторы исследования предполагают, что ХГ вовлекает в реализацию своих эффектов маннозные рецепторы, относящиеся к ПРР [Kosaka et al., 2002].
Целью работы являлось изучение роли молекул TLR4 в реализации эффектов ХГ на продукцию ИЛ-8 моноцитами небеременных женщин.
Материалы и методы
Объектами исследования являлись фракционированные моноциты небеременных женщин репродуктивного возраста, находящихся в ранней фолликулярной фазе менструального цикла. Мо-нонуклеарные клетки получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1.077 г/см3); полученную суспензию после двойной отмывки средой 199 помещали на чашки Петри с 5% ЭТС и инкубировали 45 мин. при 372Ш, затем адгезировавшие моноциты снимали механическим способом, дважды отмывали и стабилизировали инкубированием в течение 45 мин. при 42Ш [Pertof et al., 1980]. Полученную суспензию (1x106 мл) инкубировали в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 mM HEPES; 2 шМ L-глутамина; 100 мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС) с гормоном в течение 2 сут. при 37 2Ш в условиях 5% СО-. Продукцию ИЛ-8 в супернатантах культур моноцитов оценивали иммунофер-ментным методом при помощи коммерческого набора («Вектор-Бест», Россия).
Для изучения влияния ХГ на синтез ИЛ-8, гормон («Profasi», Италия) использовали в концентрации 100 ME/мл, что соответствует его пику на 9-11 нед. беременности. [Cole, 2012]. Для изучения взаимодействия гормона с TLR4 использовали также запредельную дозу ХГ 1000 ME/мл. Экспрессия CD 14 и TLR4 на клетках оценивалась после инкубации с ХГ (100, 1000 ME/мл) при помощи моноклональных антител (TLR4(CD284)/PE; CD14/FITC «eBioscience», Канада) на проточном цитофлуриметре «BD Calibur» (США) в разные сроки инкубации (1, 5, 10, 15 мин.). Для «выключения» То11-зависимого пути реализации гормонального эффекта применяли немеченые антитела к TLR4 (ab TLR4, «eBioscience», Канада; 0,5 мг/мл, изотипический контроль Mouse IgG2a, k), которые вносили в культуру моноцитов до гормона. Учитывая, что взаимодействие ХГ с «классическим» ЛГ/ХГ рецептором приводит к повышению внутриклеточного уровня циклического аде-нозинмонофосфата (цАМФ), активирующего про-теинкиназу А (ПКА) [Rao, Zhou, Lei, 2004], в исследовании применяли блокатор ПКА Н-89 («ICN Ph», США) в концентрации 10 мкМ/мл [Parvathenani et al., 1998].
Статистическая обработка данных проводилась с помощью парного t-критерия Стьюдента,
для малых групп с помощью и-критерия Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение
Ранее нами было показано, что в присутствии высоких доз ХГ снижался уровень С014+-позитив-ных клеток [Ширшев, Заморина, 2004]. Так как молекула СО 14 функционирует как корецептор TLR4, в данном случае речь идет не о регуляции экспрессии, а о детекции этих молекул. Таким образом, ХГ, взаимодействуя с молекулами 'ПЛМ, экранирует их от антител против СО 14.
В настоящем исследовании установлено, что в присутствии ХГ (100, 1000 МЕ/мл) снижался и уровень CD14+TLR4+-пoзитивныx клеток на 1-, 5-и 10-й мин. эксперимента (рис. 1).
60
“40
н
контроль 1 мин 5 мин 10 мин 15 мин
□ ХГ 100 МЕ/мл □ ХГ1000 МЕ/мл
Рис. 1. Влияние ХГ на детекцию CD14+TLR4+-клеток в системе in vitro в динамике (п = 4).
*- достоверные (р < 0.05) по u-критерию Манна-Уитни различия с контролем
Показано, что наиболее активно ХГ (1000 МЕ/мл) взаимодействует с молекулами TLR4 на 5-й мин. инкубации (Ъ12Ш), почти вдвое снижая уровень CD14+TLR4+ (рис. 2). Гейтирование пула моноцитов в экспериментах осуществляли по боковому и прямому светорассеянию, а не по CD 14, в силу экранирования CD 14 молекулами ХГ. Таким образом, показано, что ХГ активно связывается с поверхностью моноцитов, взаимодействуя с молекулами TLR4.
Из литературы известно, что меченый FITC ХГ связывается с более чем 80% С014+-моноцитов, причем процесс связывания дозозависимо блокируется в присутствии нативного ХГ [Kosaka et al., 2002]. Как уже было отмечено выше, на поверхности моноцитов небеременных женщин не обнаружен ЛГ -рецептор методом проточной цитофлуори-метрии, а клетки содержат лишь следовые количества ДНК ЛГ-рецептора, то есть, существует несоответствие ме5вду связыванием гормона на поверхности моноцитов и отсутствием рецептора. Таким
образом, нами установлено, что ХГ связывается с альтернативными рецептору структурами на поверхности моноцитов, которые нами идентифицированы как ТІЛ4.
эШёг-’ :• 24,7%
ХГ 10 1 МИІ )0 Е/мл і
’юв Ю1 Юа Ю* Ю*
FL1-H
19,4%
'Щу-1; - ХГ100 5 мин ) МЕ/мл
'"10° 10' 10; 10’ 10* PL1.H
______________СП14______________^
Рис. 2. Влияние ХГ на детекцию CD14TLR4- к лето к в системе in vitro.
Гистограммы отражают влияние ХГ (1000 МЕ/мл) на количество CD4+TLR4+-raeTOK на примере одного эксперимента. В правом верхнем квадранте указан процент СБ14+Т1Л4+-клеток в гейте моноцитов (по FSS/SS). По оси абсцисс - флуоресценция по каналу FL1, FITC; по оси ординат - по каналу FL2,
РЕ
При изучении влияния гормона на продукцию моноцитами ИЛ-8 показано, что ХГ достоверно стимулировал продукцию этого цитокина, что согласуется с исследованиями К. Kosaka с коллегами [2002]. Мы в аналогичных условиях подтвердили также, что стимулирующий эффект ХГ на уровень ИЛ-8 воспроизводился на фоне блокады ПКА. Однако принципиально важным моментом является то, что ИЛ-8-стимулирующий эффект ХГ воспроизводился и на фоне заблокированных антителами TLR4 (рис. 3). Установлено, что в условиях двойной блокады, когда были «выключены» как ПКА, так и TLR4, стимулирующий эффект гормо-
на полностью отменялся (рис. 3). Таким образом, можно сделать вывод о том, что в зависимости от доступности рецепторов гормон может связываться и «работать» как через ЛГ/ХГ-рецептор, так и через молекулы ТІЛ4, не исключая взаимодействия с маннозными рецепторами.
350
я 300
ч 250 ■■ “ “ “ I“
К
200 --------- -
150 -Р—UUU—Lrl—I^J—I^J—Lrl—L,
1 2 3 4 5 6 7 8
экспериментальное воздействие
Рис. 3. Влияние ХГ на продукцию ИЛ-8 моноцитами женщин. Роль TLR4 и ПКА (п =
12).
1 - контроль; 2 - ХГ 100 МЕ/мл; 3 - Н-89; 4 — Н-89 + ХГ 100 МЕ/мл; 5 - контроль изотипа; 6 -AbTLR4; 7 - ХГ 100 MEAvm+abTLR4; 8-ХГ100 ME/Mn+abTLR4+E[-89;#- достоверные (р<0.05) по t-критерию Стьюдента различия с контролем
В 2002 г. K. Kosaka с коллегами предположили, что ХГ на поверхности моноцитов связывается с маннозными рецепторами (C-lectin). Предварительный контакт моноцитов с D-маннозой ослаблял стимулирующий эффект ХГ в отношении синтеза ИЛ-8, однако блокада ПКА не влияла на реализацию гормонального эффекта. Известно, что ПКА вовлекается в транмиссию гормонального сигнала через ЛГ-рецептор. В то же время, в большинстве моноцитов после стимуляции ХГ, наблюдалась транслокация NF-kB в ядро, несмотря на отсутствие рецептора [Kosaka et al., 2002]. Таким образом, очевидно существование альтернативного пути для ХГ, который мы идентифицировали как TLR4-nyTb. Подтверждением этого служит также тот факт, что запуск ТТЛ4-пути непосредственно вызывает активацию ядерного фактора NF-kB [Tsan, Gao, 2004].
Необходимо отметить, что сама идея так называемой «альтернативной» рецепции актуальна для ряда гормонов. Так, в 1999 г. D.Z. Simpson с коллегами показал, что питуитарные гормоны, такие как ЛГ и ТТГ, способны взаимодействовать с маннозными рецепторами, которые известны, прежде всего, как лектиновые рецепторы для фагоцитоза. Высказано предположение, что клетки иммунной системы участвуют в клиренсе этих гормонов [Simpson et al., 1999]. Эти рецепторы распознают
гликозилированные остатки маннозы, фукозы и GlcNA в Са2+-зависимой манере через карбокси-гидратный распознающий домен [Taylor, 2001]. Известно, что маннозные рецепторы появляются на моноцитах в процессе их дифференцировки в макрофаги, и только что выделенные из периферической крови МПК и культивированные 2 сут. МПК не экспрессируют маннозные рецепторы. Однако маннаны и полимерные комплексы, содержащие маннозу, также хорошо усиливают секрецию ИЛ-8 моноцитами [Kosaka et al., 2002]. Таким образом, очевидно наличие неидентифицированных рецепторов, играющих ключевую роль в продукции ИЛ-8 моноцитами, которые нами идентифицированы как TLR4.
Таким образом, нами существенно расширены представления о механизме действия ХГ на уровне моноцитов. Вероятно, возможность подобного взаимодействия могла сложиться в процессе эволюции, так как ХГ и То11-подобные белки являются филогенетически древними молекулами [Acevedo, 2002]. Можно предположить, что связывание ХГ с TLR4 является одним из фетопротективных механизмов в период беременности, поскольку теоретически способно ограничивать ЛПС-индуциро-ванные патологические реакции, приводящие к самопроизвольным абортам. В пользу этого предположения служит тот факт, что введение ß-субъединицы ХГ (или родственных синтетических олигопептидов) в критических состояниях, индуцированных присутствием большого количества ЛПС, способно останавливать воспалительные реакции [van den Berg et al., 2011]. Показано, что ХГ-зави-симые олигопептиды имеют терапевтический потенциал для ослабления угрожающего жизни воспаления и повреяедения органов, ассоциированного с травмой и геморрагическим шоком и in vivo на мышиной модели супрессирует Т1Л4-опосредо-ванное воспаление [van den Berg et al., 2011]. Блокада глюкокортикостероидных рецепторов приводит к отмене этих эффектов. Помимо этого, олиго-пептид работает и через АКТГ-рецептор, в то время как роль ЛГ-рецептора в этих процессах пока не изучена [van der Zee et al., 2010]. Эти результаты раскрывают новую стратегию поиска потенциальных терапевтических средств. Вероятнее всего, продукты деградации ХГ, а также ХГ-подобные олигопептиды оказывают выраженные противовоспалительные эффекты в силу своей способности выступать как конформационные антагонисты ЛПС. В отношении взаимодействия цельной молекулы ХГ с TLR4 хотелось бы добавить, что активация этих рецепторов также ведет к повышению уровня цАМФ внутри клетки, что снимает существующие противоречия [Song et al., 2007]. Данные, полученные в 2012 г. С. Feng с коллегами, показывают, что сиаловые остатки (а молекула ХГ является высокосиализированной) модулируют
ЛПС-сигналинг через TLR4. Таким образом, предложенная нами концепция «альтернативной» рецепции ХГ находит все больше экспериментальных подтверждений. Существование множественной рецепции для ключевого гормона беременности существенно расширяет существующие представления о фундаментальных основах взаимодействия гормон-рецептор.
Библиографический список
Чистякова Г.Н. и др. Оценка продукции цитоки-нов при беременности, осложненной угрозой прерывания в первом триместре // Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии. 2005. № 5. С. 96-98.
Ширшев С.В. Клеточные и молекулярные механизмы иммуно-модулирующего действия хорионического гонадотропина // Успехи совр. биол. 1998. Т. 118. С. 69-85.
Ширшев С.В., Заморина С.А. Роль То11-подобных протеинов в реализации эффектов хорионического гонадотропина на функциональную активность моноцитов // Докл. АН. 2006. Т. 409, №5. С. 699-701.
Ширшев С.В., Заморина С.А. Роль хорионического гонадотропина в формировании иммуно-логиче-ской толерантности при беременности // Проблемы эндокринологии. 2011. № 5. С. 52-56. Ширшев С.В., Куклина Е.М. Регуляция окислительного потенциала нейтрофилов репродуктивными гормонами в зависимости от уровня активации клеток // Докл. АН. 2005. Т. 401, № 6. С. 825-828.
Ширшев С.В., Куклина Е.М., Ярилин А.А. Роль репродуктивных гормонов в контроле апоптоза Т-лимфоцитов // Биохимия. 2003. Т. 68, № 4. С. 577-583.
Acevedo H.F. Human chorionic gonadotropin (hCG), the hormone of life and death: a review // J. Exp. Ther. Oncol. 2002. Vol. 2, № 3. P. 133-145. Bhowmick N. et al. Determination of residues important in hormone binding to the extracellular domain of the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor by site-directed mutagenesis and modeling // Mol. Endocrinol. 1996. Vol. 10, № 9. P. 1147-1159.
Cole LA. hCG, the wonder of today's science // Reprod Biol Endocrinol. 2012. Vol. 10. P. 24. Kosaka K. et al. Human chorionic gonadotropin (HCG) activates monocytes to produce interleukin-8 via a different pathway from luteinizing hormone/HCG receptor system // J. Clin. Endocrinol Metab. 2002. Vol. 87, № 11. P. 199-208.
Magnie M. et al. Effects of chorionic gonadotropin (hCG) therapy on the immune system // Medicina (Firenze). 1990. Vol. 10, № 2. P. 148-149. Parvathenani L.K. et al. Type I cAMP-dependent Protein Kinase Delays Apoptosis in Human
Neutrophils at a Site Upstream of Caspase-3 // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, T. 12. P. 6736-6743.
Pertof H. et al. Separation of human monocytes on density gradients of Percoll // J. of immunological methods. 1980. Vol. 33. P. 221-229.
Rao Ch.V., Zhou X.L., Lei Z.M. Functional luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptors in human adrenal cortical H295R cells // Biol. Reprod. 2004. № 71. P. 579-587.
Rosemblit N., Ascoli M., Segaloff D.L. Characterization of an antiserum to the rat luteal luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor // Endocrinology. 1988. Vol. 123, № 5. P. 2284-2290.
Simpson D.Z. et al. Multiple interactions between pituitary hormones and the mannose receptor // Biochem J. 1999. Vol. 343. P. 403-411.
Song J. et al. TLR4 initiated and cAMP mediated abrogation of bacterial invasion of the bladder // Cell Host Microbe. 2007. Vol. 1(№4). P. 287-298.
Taylor M.E. Structure and function of the macrophage mannose receptor // Results Probl. Cell Differ. 2001. Vol. 33. P. 105-121.
Tsan M.F., Gao B. Endogenous ligand of Toll-like receptor//Leykocyte Biology. 2004. Vol. 76, № 3. P. 514-519.
van den Berg J.W. et al. The (3-human chorionic gonadotropin-related peptide LQGV reduces mortality and inflammation in a murine polymicrobial sepsis model // Crit. Care Med. 2011. Vol. 39, № 1. P. 126-134.
van der Zee M. et al. Synthetic human chorionic gonadotropin-related oligopeptides impair early innate immune responses to Listeria monocytogenes in Mice // J. Infect. Dis. 2010. Vol. 201, №7. P. 1072-1080.
Поступила в редакцию 02.11.2012
Effect of human chorionic gonadotropin on production of interleukin-8 by intact
monocytes. Role of toll-like receptors
S. A. Zamorina, candidate of biology, senior researcher
Institute of ecology and genetics of microorganisms, Ural Branch of the RAS, 13, Golev Str., Perm, Russia, 614081; mantissa7@mail.ru; (342)2808431 S. V. Shirshev, doctor of medicin, professor
Institute of ecology and genetics of microorganisms, Ural Branch of the RAS, 13, Golev Str., Perm, Russia, 614081 Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; shirshev@iegm.ru
Effects of human chorionic gonadotropin (hCG) on interleukin-8 production (IL-8) by female intact monocytes were studied. It was demonstrated that hormone stimulation (100 IU/ml) of IL-8 production was realized with the involvement of molecules of Toll-like proteins 4 (TLR4), as the blockade of these receptors by antibodies partially abolished the IL-8-promoting effect of hCG. Thus, novel mechanism of hormone interaction with monocytes was determined that was mediated by Toll-like proteins that act as «alternative» hormone receptors.
Key words: human chorionic gonadotropin; interleukin-8; toll-like receptor 4 type.
Заморина Светлана Анатольевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» Уральского отделения РАН
Ширшев Сергей Викторович, доктор медицинских наук, профессор
ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» Уральского отделения РАН
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
