CC BY
41
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2005 Биология Вып. 6
Медико-биологические науки
УДК 612.017.1
ВЛИЯНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ЭОЗИНОФИ-ЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЖЕНЩИН. РОЛЬ Са2+-АКЦЕПТИРУЮЩИХ БЕЛКОВ
С. А. Заморина3, С. В. ШиршеваЬ
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,614081, г. Пермь, ул. Голева, 13 ь Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Изучено влияние хорионического гонадотропина (ХГ), основного гормона беременности, на фагоцитарную активность эозинофилов в периферической крови женщин. Установлено, что в эозинофилах, полученных от женщин в фолликулярной фазе, высокая доза ХГ (100 МЕ/мл) снижала процент фагоцитирующих клеток и их поглотительную активность. В лютеиновую фазу менструального цикла гормон в дозе 100 МЕ/мл угнетал только поглотительную активность эозинофилов. Однако на фоне блокады Са2+-акцептирующих белков циклоспорином А депрессивный эффект ХГ в высокой дозе отменялся независимо от фазы цикла. В то же время в сочетании с циклоспорином А ХГ в низкой дозе (10 МЕ/мл) оказывал супрессивный эффект на фагоцитоз, который был более выражен в фолликулярную фазу. Таким образом, ХГ угнетает фагоцитарную активность эозинофилов в периферической крови женщин, при этом эффективна только высокая доза гормона (100 МЕ/мл), а реализация эффектов зависит от функционирования Са2+-акцептирующих белков.
Введение
Одна из функций эозинофилов - обеспечение противогельминтного иммунитета, при этом ключевым моментом их активации является дегрануляция (Giembycz, Lindsay, 1999). Эозинофилы также могут функционировать как антигенпрезенти-рующие клетки, модулируя иммунный ответ в сторону Thj-типа (Shi, 2004). Известна также способность этих клеток фагоцитировать патогены благодаря экспрессии С1- ,СЗ- и С4-рецепторов комплемента (Giembycz, Lindsay, 1999). На поверхности большей части эозинофилов экспрессируется Fcy-peuenTop (Beeken et al., 1987), а также Fca 5 ^r-рецепторы (Giembycz, Lindsay, 1999). Кроме того, на поверхности эозинофилов присутствуют интег-рины, селектины и рецепторы к компонентам комплемента С4- и Clq (Giembycz, Lindsay, 1999). В отношении окислительной активности эозинофилов выявлено, что IgG-, IgE-комплексы и ФМА стимулируют продукцию Н202 (Rossi, 1989), а ИЛ-5 повышает уровень люминол-зависимой хемилю-минесценции (Tsai, Yu, Wang, 1993). В то же время эозинофилы являются эстрогензависимыми клетками (Giembycz, Lindsay, 1999), которые аккумулируются из периферической крови в эндометрий,
где выполняют иммунорегуляторную и фагоцитарную функции.
Регуляция фагоцитарной активности эозинофилов хорионическим гонадотропином (ХГ) - основным гормоном беременности - практически не изучена. ХГ помимо регуляции стероидогенеза плаценты и плода активно участвует в контроле иммунных процессов (Hammarstrom et al., 1979; Yagel et al., 1989; Magnie et al., 1990; Ширшев 1997; 1998), что обусловлено необходимостью одновременного обеспечения процессов беременности и защиты полуаллогенного плода от атаки им-мунокомпетентных клеток матери. Таким образом, целью работы являлось изучение влияния ХГ на фагоцитарную активность эозинофилов.
Известно, что в период гестации и в течение 7-11 месяцев после родов биологически активный ХГ синтезируется NK-клетками, моноцитами и в меньшей степени лимфоцитами периферической крови, причем пик секреции приходится на 9-16 неделю беременности (Alexander et al., 1998). Флуориметрическими исследованиями с использованием антител к ХГ выявлено связывание гормона этими клетками, реализуемое через ЛГ/ХГ-рецептор (Alexander et al. 1998). Однако на грану-лоцитах этот рецептор не идентифицирован, что позволяет предположить, что ХГ реализует свои
О С. А. Заморина, С. В. Ширшев, 2005
эффекты в данном случае через «альтернативную» мембранную структуру - TLRs (toll-like receptors), внеклеточные домены которых гомологичны гор-монсвязывающему сайту ЛГ/ХГ-рецептора (Така-hashi et al., 1985), Известно, что эозинофилы конститутивно экспрессируют TLR1, TLR4, TLR7, TLR9 и TLR10 mRNAs (Nagase, 2003) и способны к ЛПС-зависимой активации с вовлечением CD 14 (Plotz et al. 2001), вследствие чего мы предполагаем, что гормон реализует свои модулирующие эффекты через TLRs.
Материалы и методы
В работе использовали цельную кровь небеременных женщин в возрасте 19-48 лет. Обследуемые женщины были разделены на две группы в зависимости от фазы менструального цикла: первая («фолликулярная фаза») состояла из женщин, у которых кровь забирали на 5-9 день менструального цикла (п=8); вторая («лютеиновая фаза») группа состояла из женщин, у которых кровь брали на 18-25 день цикла (п=8).
Использовался ХГ («profasi», Serano, Италия) в дозах 10, 50 и 100 МЕ/мл, что соответствует разным срокам беременности. На 50-й день (7 нед.) беременности концентрация гормона достигает 50 МЕ/мл, на 70-й день (10 нед.) - 100 МЕ/мл, в последующие II-III триместры концентрация гормона снижается до 10 МЕ/мл и держится на таком уровне до конца беременности (Wide, 1962; Jaffe, 1969). Гормон разводили ex tempore средой 199 (НПО «Биомед», Россия).
В качестве ингибитора кальмодулина (Carsten, 1982) использовали циклоспорин А (ЦсА) “San-dimmun” (Sandos, Швейцария) в среднетерапевтической дозе 0,05 мг/мл (Обух, 1988).
Фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали с помощью светового микроскопа, регистрируя поглощение объектов фагоцитоза. В качестве объектов использовали формалинизированные эритроциты барана (ФЭБ) (Каплин, 1996), трижды отмытые в избытке среды 199 центрифугированием при 400 g. Концентрацию ФЭБ в суспензии доводили до 108/мл.
Для оценки фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови в капроновых пробирках смешивали 0,1 мл цельной гепаринизирован-ной крови и 0,1 мл отмытых ФЭБ. Пробы инкубировали 20 мин при 37°С. Затем содержимое пробирок ресуспендировали и готовили мазки, которые фиксировали метанолом и окрашивали по Ро-мановскому-Гимзе. Время окрашивания (15-20 мин) подбирали таким образом, чтобы ФЭБ имели сине-фиолетовую окраску, а собственные эритроциты - розовую. Подсчет вели под иммерсией (объектив х90), просчитывали не менее 300 клеток на мазке. Рассчитывали следующие показатели:
1) процент фагоцитоза - количество клеток, за-
хвативших один и более объектов фагоцитоза (ФЭБ^на 100 потенциальных фагоцитов;
2) фагоцитарный индекс (ФИ) - количество объектов фагоцитоза, которое приходится на одну фагоцитирующую клетку («истинный» фагоцит), что характеризует индивидуальную поглотительную активность фагоцитов.
Парциальную фагоцитарную активность оценивали в цельной крови, рассчитывая указанные показатели отдельно для эозинофилов.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием ^-критерия Стьюдента, как парного (а), так и непарного (Ь).
Результаты и обсуждение
Известно, что функционально менструальный цикл может быть разделен на фазы, в динамике которых уровень циркулирующих гонадотропинов, эстрогенов, андрогенов и прогестинов изменяется (Midgley, Jaffe, 1968). Фолликулярная фаза характеризуется низким уровнем прогестерона и 17-оксипрогестерона, но относительно высокой концентрацией гонадотропинов и эстрогенов. Наиболее существенным эндокринным проявлением лю-теиновой фазы является выраженное увеличение секреции прогестерона. Параллельно, но в меньшей степени, нарастает уровень 17-оксипрогесте-рона, эстрадиола и эстрогена, снижаются уровни ЛГ и ФСГ в плазме (Judd, Yen, 1973).
Для расшифровки механизма действия ХГ на фагоцитоз эозинофилов использовали циклоспорин А (ЦсА). Известно, что ХГ реализует иммуномодулирующие эффекты через Са2+-зависимые механизмы (Ширшев, 1998). Ввиду селективной активности ЦсА в отношении Са2+-акцептирующих белков предполагается следующий механизм действия в этих клетках: взаимодействие препарата с циклофилинами (O’Neil et al., 1995) приводит к образованию комплекса с кальцийневрином, что необходимо для реализации эффекта на уровне экспрессии цитокиновых генов (Morris, 1981; Borel, 1986). Выявлено наличие циклофилинов в нелимфоидных клетках, в частности эозинофилах (Giembycz, Lindsay, 1999). Помимо кальцийневри-на ЦсА блокирует работу кальмодулина (Carsten, 1982), участвующего в фосфорилировании протеинов, и других Са2+-акцептирующих белков (Morris, 1981; Borel, 1986).
Установлено, что в эозинофилах, полученных в фолликулярной фазе, высокая доза ХГ(100МЕ/мл) угнетала все исследуемые показатели фагоцитоза (рис. 1). ЦсА оказывал самостоятельный депрессивный эффект на все исследуемые показатели фагоцитарной активности эозинофилов. Депрессивный эффект ХГ100 МЕ/мл на фоне блокады Са2+-акцептирующих белков полностью снимался, что может объясняться повышением уровня (Са2+)|. В то же время на фоне применения ЦсА проявился
депрессивный эффект низкой дозы ХГ1 ОМЕ/мл на фагоцитоз, причем угнетались все исследуемые показатели (рис. 1).
фолликулярная фаза
контроль инкубации
ХЛООМЕ/мл
ХГ10 МЕ/мл+ЦсА ХПОО МЕ/мл+ЦсА
контроль инкубации контроль гормона ХГЮ МЕ/мл ХГ50 МЕ/мл ХГЮОМЕ/ил ДсА
ХГЮ МїУмл+ЦсА ХГ50 МЕ/мл+ЦсА ХПОО МЕ/мл+ЦсА
Рис. 1. Влияние ХГ на фагоцитарную активность эозинофилов периферической крови, находящихся в фолликулярной фазе цикла у женщин. Роль Са2+-акцептирующих белков
В лютеиновую фазу менструального цикла гормон в дозе ЮОМЕ/мл угнетал только поглотительную активность эозинофилов (ФИ), но не фагоцитарную активность. ЦсА оказывал аналогичное действие. Низкая доза ХГ1 ОМЕ/мл на фоне блокады кальмодулина, напротив, оказывала супрессивное влияние на уровень фагоцитирующих эозинофилов (рис. 2).
Таким образом, в эозинофилах депрессивный эффект ХГ реализуется по-разному. В фолликулярной фазе гормоном предположительно модулируется конформация мембран посредством изменения уровней внутриклеточного цАМФ и Са2+, в результате чего происходит маскировка, блокада или утрата рецепторов, в том числе и для ХГ. В лютеиновую фазу, напротив, число распознающих поверхностных структур, по-видимому, не меняется, но депрессивный эффект гормона затрагивает функционирование актин-миозинового комплекса. На фоне блокады кальмодулина и других Са2+-акцептирующих белков гормон реализует разнона-
правленные дозозависимые эффекты.
контроль инкубации контроль гормот ХГЮ МЕ/мл ХГ50 МЕ/мл ХГ 100 МЕ/мл ЦсА
ХПО МЕ/мл+ЦсА
ХГ50 МЕ/мл+ЦсА ХГ100 МЕ/мл+ЦсА
люгенновая фаза
Ч
0,5
ФИ
1,5
кошроль тодбации
ХГЮ МЕ/мл
ХГ100 МЕ/мл
ХГЮ МЕ/мл+ЦсА
ХГ100 МЕ/мл+ЦсА
Рис. 2. Влияние ХГ на фагоцитарную активность эозинофилов периферической крови, находящихся в лютеиновой фазе цикла у женщин. Роль Са2+-акцептирующих белков
В фагоцитирующих клетках, особенно на периферии цитоплазмы, содержится большое количество актина и миозина. Образование псевдоподий вокруг объекта фагоцитоза связано с мобилизацией ионов Са2+, которые стимулируют энергозависимую сборку и функционирование сократительных белков (1опЪзоп, Кко§а\уа, 1985). Вероятно, избыточный уровень (Са2+); в условиях применения ЦсА нарушает текучесть мембран и адекватное функционирование ферментных комплексов, локализуемых в них, вследствие этого ЦсА оказывает преимущественно депрессивное влияние на фагоцитарную активность эозинофилов.
Однако при пересечении эффектов ЦсА с действием ХГ фагоцитоз может стимулироваться за счет вовлечения активационного сигнала с ТЬЯб. Известно, что сигналы с Т1Лб могут регулировать
фагоцитарную активность клеток, способствуя поглощению микробных объектов на разных стадиях фагоцитоза (Blander, Medzhitov, 2004). В то же время разница эффектов в разные фазы цикла объясняется стероид-зависимой экспрессией TLRs на клетках.
Таким образом, ХГ способен угнетать фагоцитарную активность эозинофилов в крови человека, при этом наиболее выраженный эффект наблюдался по отношению к эозинофилам, полученным из крови женщин в фолликулярной фазе менструального цикла. Направленность эффекта гормона зависит от функционирования Са2+-акцептирующих белков, таких как кальмодулин и кальцийневрин. ХГ на фоне блокады вышеназванных белков оказывает преимущественно стимулирующий эффект на фагоцитарную активность эозинофилов, вероятно, за счет включения активационного сигнала с TLRs. Возможно, гормон взаимодействует на поверхности эозинофилов с TLRs, потому как внеклеточные домены этих белков гомологичны гор-монсвязывающему сайту ЛГ/ХГ-рецептора. Однако нельзя исключать вероятности прямого контакта эозинофилов с другими лейкоцитами в условиях цельной крови, вследствие чего происходит модуляция фагоцитарной активности эозинофилов.
Библиографический список
Катин В.Н. Нетрадиционная иммунология инфекции. Пермь: Изд.-во Перм. мед. акад., 1996. 163 с. Обух И. Б. Фармакологические особенности циклоспорина А. Применение при трансплантации почки // Терапевтический архив. 1988. № 5. С. 136-143.
Ширшев С. В. Молекулярные механизмы иммуномодулирующего действия хорионического гонадотропина на Т- и В- лимфоциты интактной селезенки // Биохимия. 1997. Т. 62, вып. 5. С. 603-612.
Ширшев С. В. Клеточные и молекулярные механизмы иммуномодулирующего действия хорионического гонадотропина // Успехи соврем, биологии. 1998. Т. 118, № 1. С. 69-85.
Ширшев С. В. Механизмы иммуно-эндокринного контроля процессов репродукции. В 2 т. Т. 2. Екатеринбург, 2002. 557 с.
Alexander Н. et al. HCG Secretion by periperal mononuclear cells during pregnancy // Domest. An. Endocrinol. 1998. V. 15, № 15. P. 377-387.
Batiuk T.D., Pazderka F., Halloran P.F. Calcineurin activity is only partially inhibited in leukocytes of cyclosporine-treated patients // Transplantantation. 1995. V. 59, № 10. P. 1400-1404.
Beeken W.L. et al. Eosinophils of human colonic mucosa: C3b and Fc gamma receptor expression and phagocytic capabilities // Clin. Immunol. Immu-nopathol. 1987. V. 43, № 3. P. 289-300.
Blander J.М., Medzhitov R. Regulation ofphago-some
maturation by signals from toll-like receptors // Science. 2004. V. 304, № 5673. P. 1014-1018.
Borel J.F. (ed.) Cyclosporine // Progress in Allergy. Basel: Karger, 1986. V. 38.
Carsten N. Cyclosporine A / Diss. Dokt. Med./ Fak. Techn. Univ. Munchen, 1982.
Giembycz M.A., Lindsay M.A. Pharmacology of the eosinophil // Pharmacological reviews. 1999. V. 51, №2. P. 213-339.
Hammarstrom Fuchs T., Smith C.J.E. The immu-nodepressive effect of human glicoproteins and their possible role in the honrejection process during pregnancy // Acta Obstet. Gynecol. Scand. 1979. V. 58, № 5. P. 417-422.
Jaffe R.B., Lee P.A., Midgley A.R. Serum gonadotropin before, at the inception of, and following human pregnancy // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1969. V. 29. P. 1022-1031.
Johnson R.B.Jr., Kitagawa S. Molecular basis for the enhanced respiratory burst of activated macrophages // Fed Proc. 1985.V. 44. P. 2927-2932.
Judd H.L., Yen S.S.C. Serum androstendione and testosterone levels during the menstrual cycle // J. Clin. Endocrinol Metab. 1973. V. 36. P. 475-479.
Lin J. et al. Lymphocytes from pregnant women express human chorionic gonadotropin/luteinizing hormone receptor gene // Mol. Cell. Endocrinol. 1995. V. 111, №. l.P. 13-17.
Magnie M. et al. Effects of chorionic gonadotropin (hCG) therapy on the immune system // Medicina (Firenze). 1990. V. 10, № 2. P. 148-149.
Midgley A.R. Jr., Jaffe R.B. Regulation of human go-nadortopins: VI. Correlation of serum concentrations of follicle-stimulating and luteinizing hormones during the menstrual cycle // J. Clin. Endocrinol Metab. 1968. V. 28. P. 1699-1709.
Morris P.J. Cyclosporine A. Overview // Transplantation. 1981. V. 32. P. 349-354.
Nagase H. et al. Expression and function of Toll-like receptors in eosinophils: activation by Toll-like receptor 7 ligand // J. Immunol. 2003. V. 171, № 8. P. 3977-3982.
O’Neill E.A. et al. The FK-506- and CSA-sensitive phosphatase, calcineurin, enchances activation of NF-kB in several cell types: Abstr. Keystone Symp. Contr. And Manipul. Immune Response, Taos, N.M., March 16-22, 1995 // J. Cell. Bio-chem. (Suppl. 21a). P. 81-87.
Plotz S.G. et al. The interaction of human peripheral blood eosinophils with bacterial lipopolysaccha-ride is CD14 dependent // Blood. 2001. V. 97, № 1. P. 235-241.
Rossi G.A. et al. Oxidative metabolism of human peripheral blood eosinophils and neutrophils: H202 production after stimulation with phorbol myristate acetate and immune complexes // Eur. Respir. J. Suppl. 1989. V. 6. P. 435-440.
Shi H.-Z. Eosinophils function as antigen presenting cells // J. Leuk. Biol. 2004. V. 76. P. 1-8.
Takahashi N., Takahashi К, Putnam F. W. Periodicity of leucine and tandem repetition of a 24-amino acid segment in the primary structure of leucine-rich alpha 2-glycoprotein of human serum // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 1906-1910.
Tsai J.J., Yu L.N., Wang S.R. Enhanced eosinophil lu-minol-dependent chemi-luminescence and complement receptor expression by platelet-activating factor and interleukin-5 // Asian Рас. J. Allergy Immunol. 1993. V. 11,№ 1. P.5-11.
Wide L. An immunological method for the assay of human chorionic gonadotrophin // Acta Endocrinol. (Kbh). 1962. V. 41, suppl. 70. P. 1-100.
Yagel S., Parhar R.S., Lala P.K. Trophic effect of first-trimester human trophoblasts and human chorionic gonadortopin on lymphocyte proliferation // Am. J. Obstet. Gynecol. 1989. V .160, № 4. P. 946-953.
Поступила в редакцию 28.09.2005
Chorionic gonadotropin effects on eosinophil phagocytic activity in women. The role of Ca2+-accepting proteins
S.A. Zamorina, S.V. Shirshev
The influence of chorionic gonadotropin (CG), basic hormone of pregnancy, on eosinophil phagocyte activity of the women was investigated. The high doze of CG (100 MU/ml) reduced percent of the phagocytes and up-taken activity of eosinophils, received from the women in follicular phase of menstrual cycle. The hormone in a doze of 100 MU/ml reduced only uptaken activity of the cells in luteine phase. However, an oppressing effect of CG high dose was cancelled at blockade of Ca2 +-accepting proteins by cyclosporine A, irrespectively of phase of menstrual cycle. At the same time, the low doze of CG (10 MU/mI) in a combination with cyclosporine A rendered suppressive effect on phagocytosis, and it was more expressed in a folliculare phase. Thus, CG reduses eosinophil phagocyte activity of the women, but only the high doze of the hormone (100 MU/mI) is effective, and the realization of effects depends on Ca2 +-accepting proteins functioning.
