CC BY
54
Сельскохозяйственные науки
УДК 633.18:631.527.8:581.143.6 М.В. Илюшко
ВЛИЯНИЕ ХОЛОДОВОЙ ОБРАБОТКИ НА КУЛЬТУРУ ПЫЛЬНИКОВ ГИБРИДОВ РИСА IN VITRO*
Изучено влияние двух режимов холодовой обработки пыльников (5°С и 10°С в течение семи дней) для культуры in vitro дальневосточных гибридов риса Oryza sativa L подвида japonica. Каллусообразование оказалось одинаковым при обоих режимах. Обработка пыльников температурой 5°С значительно эффективнее за счет более высокого выхода зеленых побегов на каллус (t=2,45; p=0,04) и меньшего альбинизма (1=2,69; p=0,02).
Ключевые слова: рис, культура пыльников, in vitro, холодовая обработка, регенерант.
M.V. Ilyushko
THE INFLUENCE OF THE LOW-TEMPERATURE TREATMENT ON THE ANTHER CULTURE OF THE
RICE HYBRIDS IN VITRO
The influence of two modes of the antherlow-temperature treatment (5°С and 10°С for seven days) for culture in vitro of the far eastern hybrids of rice Oryza sativa L. subspecies japonica is studied. The tylosis formation appeared to be identical in both modes. The treatment of anthers by the 5°С temperature is much more effective due to the higher outcome of green sprouts on tylosis(t=2,45; p=0,04) and loweralbinism(t=2,69; p=0,02).
Key words: rice, anther culture, in vitro, low-temperature treatment, regenerant.
Введение. Рис - уникальная культура для юга Дальнего Востока. Возделывать ее возможно на ограниченных территориях нашей страны в связи с ее теплолюбивостью. Приморье с давних пор использует свое преимущество. В связи с этим обязательна селекционная работа. Направления селекции по этой культуре для получения высоких стабильных урожаев в Приморском крае четко обозначены исследователями [1, 2].
Культура пыльников широко используется в селекционных программах риса во всем мире [3-7] и в нашей стране, позволяя сократить селекционный процесс на 5-6 лет [8]. Методы биотехнологии используются для создания исходного селекционного материала в Приморском крае почти 30 лет [1, 9, 10]. К сожалению, в Государственном реестре селекционных достижений РФ по 12-й зоне пока отсутствуют «биотехнологические» сорта риса [11, www.gossort.com].
В Приморском НИИСХ впервые начаты исследования по созданию исходного материала для селекции риса методом культуры пыльников in vitro. Методики получения регенерантов риса андроклинного происхождения отражены в ряде работ [8]. Однако любое начинание требует отработки методики и оптимизации условий для применяемых генотипов. Критическими в получении регенерантов риса в культуре пыльников являются ряд факторов: генотип исходных растений, условия выращивания исходных растений, состав индукционных питательных сред, температура предобработки пыльников и др. [5-8].
Изучение влияния последнего фактора стало предметом данного исследования. Известно, что холо-довая обработка пыльников значительно увеличивает как индукцию каллусов, так и выход зеленых растений у риса [12]. Для сортов риса подвида japonica наиболее эффективна температура 5°С в течение семи дней [12]. Дальневосточные исследователи рекомендуют температуру 8-12° С в течение 7-12 дней [9, 13].
Цель исследования. Подобрать эффективный режим холодовой обработки пыльников дальневосточных гибридов риса, используемых в селекционном процессе, для культуры in vitro.
Материалы и методы. В качестве исходного материала использовано потомство четырех гибридов второго поколения риса посевного Oryza sativa L. подвида japonica. Родительскими формами являлись сорта отечественной, в том числе дальневосточной, и японской селекции: 1-2 ((Рассвет х Новатор) х Новатор); 2-1 (Новатор х (Приозерный х (Дальневосточный х Hayakaze))); 7-1 (Хазар х Дарий 23); 13-3 (Луговой х Вираж).
Растения-доноры выращивали на вегетационной площадке лаборатории селекции риса до периода сбора метелок.
Холодовая обработка и выделение пыльников проводились согласно методике, опубликованной в работах М.В. Илюшко [14, 15]. Режим обработки пыльников 5 и 10°С в течение семи дней.
Получение регенерантов проводилось в два этапа. На первом этапе в культуре пыльников индуцировали пролиферацию каллуса. Для этого использованы восемь вариантов индукционных сред, состав которых представлен в таблице 1. Второй этап заключался непосредственно в получении растений-регенерантов, для чего каллусы пересаживали на регенерационную среду N6, состав среды и условия культивирования пыльников и каллусов приведены в работах [14, 15].
* Работа частично поддержана грантом «Программа фундаментальных исследований ДВО РАН «Дальний Восток» №1546-005.
Для укоренения регенерантов использована среда Т. МигавЫде, Р.Экоод [17] с половинным минеральным составом макросолей, в вариации, приведенной Ю.К. Гончаровой [12].
Регенеранты с развитой корневой системой высаживали в горшечную культуру и продолжали выращивать в условиях культуральной комнаты до образования семян.
Математическую обработку данных проводили в программе Э1аМюа, разницу между вариантами определяли с помощью ^критерия Стьюдента.
Состав питательных индукционных сред, мг/л
Таблица 1
Компонент N6-1 N6-2 N6-3 MS-и Mix-1 Mix-2 Ma-пр №-пр
Макросоли N6* N6 N6 MS** N6 N6 Ma*** N6
Микросоли N6 N6 N6 MS MS MS Ma N6
Железо-хелат N6 N6 N6 MS MS MS M8 N6
Тиамин HCl - Bi 1,0 1,0 1,0 0,4 0,4 0,4 5,0 1,0
Пиридоксин HCl - Вб 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 2,5 0,5
Никотиновая кислота - PP 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 3,0 0,5
Глицин 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 10,0 2,0
Аланин - - - - - - 10,0 -
Мезо-инозитол - - - 100,0 100,0 100,0 - -
Казеин гидролизат - - - - - 500,0 - -
L-глутамин - - - - - 500,0 - -
ФУК - - - - - 15,0 10,0 10,0
2,4-Д 2,0 1,0 0,5 2,0 2,0 - - -
НУК - - 1,0 - - 2,0 2,0 2,0
Кинетин - 0,2 0,2 - - - - -
БАП - - - - - 0,5 - -
AgNOa - - - - - 7,5 - -
Мальтоза, г/л - - - - - 54,0 - -
Сахароза, г/л 30,0 40,0 40,0 30,0 30,0 - 30,0 30,0
Агар, г/л 8,0 9,0 9,0 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0
рН 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8
Примечание. * - среда C. C приведенной в работе [8].
hu [16]; ** - среда T. Murashige and F. Skoog [17]; *** - среда по прописи,
Результаты. Пыльники были введены в культуру in vitro в 2013 году в количестве 4030 штук. В каждом варианте на питательные среды инокулировано от 20 до 128 эксплантов.
После холодовой обработки пыльников 5°С каллусообразование на разных вариантах сред составило от 0 до 38,8 % (табл. 2), в среднем - 8,43 %. После холодовой обработки 10°С каллусообразование было выше - от 0 до 40,0 % (табл. 3), в среднем 11,02 %. Статистически значимых различий не обнаружено (t=1,09; p=0,28), т.е. процесс каллусообразования происходит одинаково как при холодовой обработке 5°С, так и при 10°С.
Каллусообразование пыльников риса, прошедших холодовую обработку 5°С, %
Таблица 2
Гибрид Ва риант индукционной сре ды
N6-1 N6-2 N6-3 MS-и Mix-1 Mix-2 №-пр
1-2 16,2 3,9 6,4 0 7,8 0 2,9 2,6
2-1 3,7 0 0 6,0 5,2 0 12,1 1,7
7-1 3,4 11,5 13,2 7,8 38,8 2,5 19,1 12,5
13-3 14,5 11,6 9,5 12,0 22,1 2,5 10,7 9,6
X 9,5 6,8 7,2 6,5 18,5 1,3 11,2 6,6
Сельскохозяйственные науки
Таблица 3
Каллусообразование пыльников риса, прошедших холодовую обработку 10°С, %
Гибрид Ва риант индукционной среды
N6-1 N6-2 N6-3 МЭ-и М1х-1 М1х-2 Ма-пр №-пр
1-2 5,0 8,8 0 0 0 0 0 7,5
2-1 3,7 0 8,8 0 3,7 0 17,5 9,4
7-1 22,0 10,0 12,5 25,0 25,0 13,2 26,3 15,0
13-3 28,9 11,0 40,0 10,2 30,0 5,0 4,0 10,0
х 14,9 7,5 15,3 8,8 14,7 4,6 12,0 10,5
Каллусные агрегаты, полученные на индукционных средах, были пересажены на среду N6 для регенерации. После холодовой обработки пыльников температурой 5°С в среднем 57,0 % каллусов образовали побеги (табл. 4). При применении 10°С средний процент каллусов с побегами был несколько ниже - 46,3 %, различия недостоверны (1=1,06; p=0,31).
Число зеленых побегов на каллус, при использовании температуры 5°С, составило в среднем 3,86 шт., а при 10°С этот показатель в среднем был 3,05 шт. Различия также статистически недостоверны (1=0,83; р=0,42). С устранением из расчетов данных, полученных на средах М1х-2 и М8-пр, разница по числу зеленых побегов на каллус становится достоверной. При холодовой обработке пыльников 5°С среднее число зеленых побегов на каллус х=5,08, а при обработке 10°С х=3,21, что значительно ниже (1=2,45; р=0,04). Данные, полученные на среде М1х-2, удалили из расчета, поскольку на этой среде получен очень низкий процент каллусообразования (табл. 2 и 3), и только 1 и 2 каллуса с побегами (табл. 4). На среде М8-пр образовалось очень небольшое количество зеленых побегов в сравнении с альбиносами, что объясняется высоким содержанием железа в составе питательной среды. Избыток Ре+ ионов является одним их факторов повышения альбинизма [8].
Соотношение зеленых побегов и альбиносов при использовании температуры 5°С в два раза выше (1,12), чем при температуре 10°С (табл. 4), различия недостоверны. При удалении данных, полученных на среде М1х-2, соотношение при температуре 5°С х=1,28, а при температуре 10°С х=0,63, различия статистически значимы (1=2,69; р=0,02). Это означает, что в первом случае больше образуется зеленых побегов, а во втором случае - альбиносов.
Таблица 4
Влияние холодовой обработки пыльников на регенерацию побегов из каллуса
Вариант индукционной среды Холодовая обработка 5° С Холодовая обработка 10° С
Число каллусов с побегами Процент каллусов с побегами Число зеленых побегов на каллус Соотношение зеленых побегов/ альбиносов Число каллусов с побегами Процент каллусов с побегами Число зеленых побегов на каллус Соотношение зеленых побегов/ альбиносов
N6-1 26 78,8 4,54 1,49 25 58,1 4,28 0,92
N6-2 22 84,6 4,73 1,86 8 40,0 1,00 0,27
N6-3 24 92,3 5,92 1,63 21 60,0 4,76 0,58
МЭ-и 15 51,7 3,07 1,00 11 52,4 2,82 0,55
М1х-1 32 45,1 5,22 1,39 21 53,9 3,00 0,96
М1х-2 1 50,0 0 - 2 33,3 3,00 0,60
М8-пр 7 31,8 0,43 0,08 9 47,4 2,11 0,39
№-пр 3 21,4 7,00 1,50 5 25,0 3,40 0,71
х 57,0 3,86 1,12 46,3 3,05 0,62
Выводы. Таким образом, для дальневосточных гибридов холодовая обработка пыльников температурой 5°С значительно эффективнее за счет более высокого выхода зеленых побегов на каллус и меньшего альбинизма.
Практическим результатом данной работы стало получение регенерантных линий риса и их семян, которые переданы в селекционный питомник лаборатории селекции риса Приморского НИИСХ.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность заведующему лабораторией селекции риса ФГБНУ «Приморский НИИСХ» М.В. Анищенко и сотрудникам за предоставленные семена гибридов риса.
Литература
1. Ковалевская В.А. Селекция риса в Дальневосточной зоне рисосеяния // Достижения науки и техники АПК. - 2008. - № 6. - С. 8-10.
2. Холупенко И.П., Бурундукова О.Л. Модели интенсивных сортов риса для условий Дальневосточной зоны рисосеяния // Вестник КрасГАУ. - 2013. - № 12. - С. 96-100.
3. Гончарова Ю.К. Использование культуры пыльников в селекции риса в Китае: обзор // Рисоводство. -2005. - № 7. - С. 8-12.
4. Костылев П.И. Биотехнология и оценочный этап селекции риса: обзор // Зерновое хозяйство России.
- 2009. - № 1. - С. 25-30.
5. Datta S.K. Androgenic haploids: factors controlling development and its application in crop improvement // Current Science. - 2005. - Vol. 10. - P. 1870-1878.
6. Dunwell J.M. Haploids in flowering plants: origin and exploitation // Plant Biotechnology Journal. - 2010. - № 8.
- P. 377-424.
7. Germana M.A. Anther culture for haploid and doubled haploid production // Plant Cell. Tiss. Organ. Cult. -2011. - Vol. 104. - P. 283-300.
8. Гончарова Ю.К. Использование метода культуры пыльников в селекции риса. - Краснодар: Изд-во ВНИИ риса, 2012. - 91 с.
9. Змеева В.Н. Тенденции изменчивости некоторых хозяйственно полезных признаков в популяции со-маклонов и андрогенных дигаплоидов риса Oryza sativa L.: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.12.
- Владивосток, 1995. - 27 с.
10. Змеева В.Н., Журавлев Ю.Н. Использование методов биотехнологии в селекции риса в Приморском крае // Научное обеспечение АПК Дальнего Востока: мат-лы науч. сессии (Уссурийск, 18-20 августа 1993 г.). - Новосибирск, 1995. - С. 132-136.
11. Сорта риса селекции ГНУ «Приморский НИИСХ Россельхозакадемии». - Тимирязевский, 2012. - 10 с.
12. Гончарова Ю.К. Использование культуры пыльников в селекции риса. - Краснодар, 2007. - 56 с.
13. Журавлев Ю.Н. Отчет по гранту ДВО РАН за 2006 г. «Методы биотехнологии в селекции сои и риса».
- Владивосток, 2006. - 9 с.
14. Илюшко М.В. Применение феноксиуксусной кислоты в культуре пыльников риса in vitro // Вестник КрасГАУ. - 2014. - № 6. - С.143-148.
15. Ilyushko M.V. Ehe effect of auxin on plant regeneration on rice from anther culture in vitro // Science Time. -2014. - № 10 - P. 160-167.
16. Chu C. The N6 medium and its applications to anther culture of cereal crops // Plant Tissue Culture. - 1978. -P. 43-50.
17. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15. - P. 473-497.
