ВЛИЯНИЕ ХИРУРГИЧЕСКОГО ГЕМОСТАТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА "ГЕМОБЛОК"TM НА БАКТЕРИАЛЬНУЮ КОЛОНИЗАЦИЮ IN VITRO Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

RM'AX

www.cmac-journal.ru

КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ ХИМИОТЕРАПИЯ

ГСП

2020

DOI: 10.36488/cmac.2020.1.67-70

Оригинальная статья

Влияние хирургического гемостатического препарата «Гемоблок»™ на бактериальную колонизацию in vitro

Кузнецова М.В., Паршаков А.А., Кузнецова М.П., Афанасьевская Е.В., Гаврилов В.А., Самарцев В.А.

ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России, Пермь, Россия

Контактный адрес: Александр Андреевич Паршаков Эл. почта: parshakov@live.ru

Ключевые слова: Гемоблок, поли-акрилат, биопленки, сетчатый им-плантат.

Конфликт интересов: авторы заявляют

об отсутствии конфликтов интересов.

Внешнее финансирование: исследование проведено без внешнего финансирования.

Цель. Оценить влияние препарата «Гемоблок»™ на колонизационную активность бактерий in vitro. Материалы и методы. Оценено влияние препарата «Гемоблок»™ на рост и колонизацию клеток бактерий S. aureus АТСС 25923, S. epidermidis ATCC 28922, E. coli АТСС 25922, P. aeruginosa АТСС 27853 в суспензии и на поверхности монофиламентных макропористых полиэстеровых сетчатых имплантатов.

Результаты. Исследуемый препарат в концентрации 0,062% и выше подавлял рост бактерий, снижал биомассу биопленки и жизнеспособность входящих в нее микробных клеток. Кроме того, установлено, что кратковременная экспозиция сетчатого имплантата в растворе препарата приводит к ингибированию контаминации абиотической поверхности.

Выводы. Препарат «Гемоблок»™ позволяет не только достигнуть стойкого гемостаза при полостных и лапароскопических операциях, но и в случае контаминации снизить количество бактериальных клеток в окружающих тканях в интраоперационном и послеоперационном периодах.

Original Article

The effect of the surgical hemostatic product «Hemoblock»TM on in vitro bacterial colonization

Kuznetsova M.V., Parshakov A.A., Kuznetsova M.P., Afanasievskaya E.V., Gavrilov V.A., Samartsev V.A.

Perm State Medical University named after E.A. Wagner, Perm, Russia

Contacts:

Aleksandr A. Parshakov E-mail: parshakov@live.ru

Key words: Haemoblock, polyacrylate, biofilm, mesh implant.

Conflicts of interest: all authors report no conflicts of interest relevant to this article.

External funding source: no external funding received.

Objective. To evaluate effect of «Haemoblock»™ preparation on in vitro bacterial colonization. Materials and methods. Activity of «Haemoblock»™ product on the growth and colonization of S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 28922, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 cells in the suspension and on the surface of monofilament macroporous polyester mesh was evaluated. Results. This product at concentration of 0.062% and above inhibited bacterial growth and reduced biofilm mass and bacterial cell viability. In addition, the short-term exposure of the mesh implant to the tested product resulted in inhibition of the abiotic surface contamination.

Conclusions. «Haemoblock»™ product allows not only to ensure hemostasis in open and laparoscopic surgery, but also to reduce the bacterial cell count in the surrounding tissues in the intra- and post-operative periods.

Введение

В современной абдоминальной хирургии частота развития инфекции в области хирургического вмешательства (ИОХВ), по данным различных многоцентровых исследований, составляет около 15-25% от всех проведенных операций [1, 2]. Риск развития ИОХВ значимо возрастает при использовании различных хирургических имплантатов [3-5]. Основными возбудителями являются колонизирующие кожные покровы пациента микроорганизмы, такие как Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, а также микробиота желу-

Кузнецова М.В. и соавт.

дочно-кишечного тракта [Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Enterobacter spp. и др.) [6].

Перспективным направлением профилактики осложнений в хирургической практике является внедрение нового класса препаратов на основе нанокомпозитных органо-неорганических материалов [7]. Так, гидрофильные полимерные композиции часто содержат микропористый полиакрилат, который способен действовать как гемостатический агент, а также как матрица для биоцидов и/или анальгетиков [8, 9]. Полимеры с

внедренными наночастицами серебра, обладающие высокой абсорбционной активностью, являются наиболее известными антимикробными веществами [10]. По данным Fahmy A. и соавт. (2016), полиакриловый на-нокомпозит с высокодисперсными наночастицами серебра обладает антибактериальной активностью в отношении E. coli, B. subtilis и C. albicans [11]. В связи с этим большой интерес представляет изучение нового местного гемостатического препарата «Гемоблок»ТМ (MENORA Labs, Израиль), содержащего помимо полиакриловой кислоты наночастицы серебра, благодаря которым препарат обладает бактерицидным и бакте-риостатическим эффектами. Авторы ряда клинических исследований отмечают, что применение гемостатика при кровотечениях различной этиологии способствует надежному гемостазу [12, 13]. Тем не менее при поиске в реферативных базах данных Web of Science и Scopus не было обнаружено доказательных работ, посвященных оценке влияния препарата «Гемоблок»ТМ на колонизационную активность бактерий на абиотических поверхностях.

Цель данной работы - оценка влияния препарата «Гемоблок»ТМ на колонизационную активность бактерий in vitro.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования использовали референтные штаммы S. aureus АТСС 25923, S. epidermidis ATCC 28922, E. coli АТСС 25922, P. aeruginosa АТСС 27853, полученные из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК имени Л.А. Тарасевича (сейчас - ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва). Исследование проведено с применением хирургического препарата «Гемоблок»ТМ, зарегистрированного в Российской Федерации как медицинское изделие. Препарат является местным гемостатиком и представляет собой 1% водный раствор неполной серебряной соли полиакриловой кислоты. Эксперименты по оценке влияния «Гемоблок»ТМ на рост и колонизационную активность бактерий проводили двумя способами. В первом случае стандартизованные до 106 клеток/мл ночные культуры бактерий выращивали в течение суток в лунках плоскодонного полистиролового планшета в LB-бульоне с добавлением препарата до конечной концентрации 0,25%, 0,062%, 0,008% (по по-лиакрилату). Контролем служил вариант без добавления гемостатика. Количество жизнеспособных клеток в планктоне и биопленке оценивали по числу колони-еобразующих единиц (КОЕ/мл) после высева из децимальных разведений бактериальных суспензий на ага-ризованные селективные среды. Биомассу биопленки оценивали по методике Merritt J. и соавт. (2005) [14]. Во втором случае фрагменты (10x10 мм) монофила-ментного макропористого полиэстерового сетчатого имплантата Parietex™ Lightweight Monofilament Mesh (Medtronic, Ирландия) погружали на 10 мин. в раствор «Гемоблок»ТМ (1% полиакрилат) или в 0,89% NaCl (контроль), затем помещали в лунки 24-луночного плоскодонного полистиролового планшета Corning (Бельгия) с бактериальной суспензией, стандартизированной до

106 клеток/мл, и инкубировали в течение 24 ч. После экспозиции фрагменты сетчатых имплантатов трижды отмывали в 5 мл 0,89% раствора NaCl, погружали в 1,0 мл фосфатно-буферной среды и обрабатывали ультразвуком 5 раз в течение 1 мин. при 37 кГц путем погружения планшетов в ультразвуковую ванну Elma Ultrasonic 30S (Elma, Германия). Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/мл/см2) оценивали аналогично первому способу.

Статистический анализ проводили с использованием языка программирования R, v.3.4.3 с графической оболочкой RStudio, v.1.0.136, компьютерных программ Microsoft Office Excel (2018) и Statistica v.12.6. Показатели представлены в виде среднего арифметического и его ошибки (M ± m). Значимость различий средних величин определяли с помощью f-критерия. При p < 0,05 делали вывод о наличии статистически значимого различия между сравниваемыми выборками. Связь между количественными значениями определяли с помощью коэффициента корреляции Пирсона.

Результаты

Рост бактерий S. aureus и E. coli в планктоне был существенно подавлен во всех вариантах эксперимента с добавлением препарата «Гемоблок»ТМ (Таблица 1). Для штаммов S. epidermidis и P. aeruginosa снижение числа жизнеспособных клеток наблюдалось только при концентрациях полиакрилата 0,25% и 0,062%. Биомасса биопленки, сформированной бактериями в течение суток, у S. epidermidis и E. coli была значимо ниже во всех вариантах с «Гемоблок»ТМ. Культуры S. aureus и P. aeruginosa при росте с 0,008% полиакрилатом формировали биопленку, сопоставимую с контролем (Рисунок 1). Что касается жизнеспособных клеток в составе биопленки, то для S. aureus в вариантах с высокой концентрацией препарата их число оказалось меньше, чем в контроле, а в варианте с 0,008% по-лиакрилатом - сопоставимо с контролем (аналогично с биомассой), тогда как для S. epidermidis, E. coli и P. aeruginosa при всех концентрациях гемостатика число клеток снижалось. Коэффициент корреляции между количеством жизнеспособных клеток в планктоне и в биопленке для всех штаммов был более 0,85 (сильная связь). Интересно, что корреляция между количеством жизнеспособных клеток в сформированной биопленке и ее массивностью оказалась очень сильной для исследованных культур (r = 0,949, 0,849, 0,981 для S. aureus, S. epidermidis и E. coli соответственно), за исключением P. aeruginosa (r = 0,433). Данный факт может быть обусловлен тем, что стратегия выживания в условиях биопленки для синегнойной палочки существенно отличается от других бактерий за счет изменения соотношения между клетками и матриксным компонентом.

В экспериментах по адгезии референтных штаммов бактерий на поверхности сетчатого имплантата при росте в суспензионной культуре получены следующие данные. В контроле число адгезированных жизнеспособных клеток варьировало от 105 для E. coli до 107 для S. aureus и P. aeruginosa. Высокая способность к не-

Кузнецова М.В. и соавт.

КМАХ . 2020 . Том 22 . №1

Таблица 1. Жизнеспособность бактерий в планктоне и биопленке при росте в присутствии препарата «Гемоблок»ТМ

ОПЫТ РАБОТЫ

Культура Вариант Планктон Биопленка

КОЕ/мл КОЕ/мл/см2

S. aureus K* 1 1,8 x 109 ± 1,3 x 109 1,4 x 108 ± 7,5 x 107

0,25% 2 5,1 x 105 ± 6,4 x 105 7,1 x 104 ± 3,6 x 104 P(i_2) < 0,05 р(1_2) < 0,05

0,062% 3 5,0 x 105 ± 1,3 x 105 2,6 x 105 ± 2,5 x 105 P(i-3) < 0,05 р(1-3) < 0,05

0,008% 4 2,9 x 106 ± 1,4 x 106 7,5 x 107 ± 7,4 x 107 P(1 —4) < 0,05 р(2—4) < 0,05 P(3—4) < 0,05

S. epidermidis K* 5 1,9 x 107 ± 1,5 x 107 2,5 x 106 ± 1,5 x 106

0,25% 6 1,6 x 104 ± x 103 1,6 x 105 ± 3,7 x 105 P(5-6) < 0,05 р(5-6) < 0,05

0,062% 7 3,7 x 104 ± 7,8 x 103 5,5 x 105 ± 6,2 x 105 P(5-7) < 0,05 P(5-7) < 0,05

0,008% 8 1,4 x 107 ± 5,2 x 107 1,9 x 106 ± 2,5 x 106 P(6-8) < 0,05 р(5-8) < 0,05 P(7-8) < 0,05 р(6-8) < 0,05

P. aeruginosa K* 9 1,5 x 108 ± 7,5 x 107 1,5 x 1010 ± 1,4 x 109

0,25% 10 7,2 x 104 ± 6,4 x 106 2,2 x 105 ± 1,1 x 105 P(9-11) < 0,05 р(9-10) < 0,05

0,062% 11 5,9 x 103 ± 2,9 x 103 1,0 x 106 ± 8,2 x 105 P(9-11) < 0,05 р(9-11) < 0,05 P(3-11) < 0,05

0,008% 12 2,1 x 107 ± 1,0 x 107 8,0 x 105 ± 4,0 x 105 P(11-12) < 0,05 р(9-12) < 0,05

E. coli K* 13 5,3 x 109 ± 6,0 x 108 6,3 x 107 ± 2,7 x 107

0,25% 14 2,9 x 103 ± 6,0 x 102 1,1 x 104 ± 1,5 x 104 P(13-14) < 0,05 р(13-14) < 0,05

0,062% 15 7,6 x 105 ± 3,8 x 103 6,9 x 104 ± 5,9 x 104 P(13-14) < 0,05 р(13-15) < 0,05

0,008% 16 2,3 x 104 ± 8,2 x 103 7,0 x 104 ± 2,0 x 104 P(13-16) < 0,05 р(13-16) < 0,05

* Контроль (LB-бульон).

I I

12 3 4 S. aureus

12 3 4 S. epidermidis

г F

12 3 4 Е. coli

J_L

12 3 4 P. aeruginosa

KOE/wi/CM2 3,00E + 07 -i

2,50E + 07 -

2,00E + 07 -

1.50E + 07 -

1,00E + 07 -

5,00E + 06 -

0,00E + 00 ■

1,52É + 07

2,74Ê + 07

2,4 7Ï+

3,32E 04

1 | 2 S. aureus

i,90Ejl 05 6/47Ë|+Q5 1,14^+

1 | 2 S. epidermidis

1 | 2 E. coli

2,37Ë + 05

1 | 2 P. aeruginosa

Рисунок 1. Биомасса биопленки, сформированная бактериями при суточном росте с препаратом «Гемоблок»ТМ

1 - контроль ^В-бульон); 2 - 0,25% (по полиакрилату);

3 - 0,062%; 4 - 0,008%.

* Значимое различие в сравнении с контролем

(р < 0,05).

Рисунок 2. Количество жизнеспособных клеток, адгезированных на поверхности сетчатого имплантата при росте в течение суток

1 - в LB-бульоне (контроль); 2 - в присутствии препарата «Гемоблок»ТМ.

Кузнецова М.В. и соавт.

специфической (равно как и к специфической) адгезии последних общеизвестна. После обработки сетчатого имплантата раствором «Гемоблок»ТМ количество колонизировавших поверхность бактерий было существенно снижено, но значения в сравнении с контролем значимо не различались.

Увеличение количества сложных хирургических операций, при которых увеличивается объем, продолжительность оперативного вмешательства, травмирование тканей и кровопотеря, способствует росту частоты ИОХВ. Предоперационное системное применение антибактериальных препаратов является основным методом профилактики ИОХВ. Поиск новых, в том числе неспецифических, способов воздействия на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы в зоне операционного поля ведется постоянно. Материалы, содержащие на-ночастицы или имеющие нанотопографию, активно используются для создания нового класса хирургических материалов с расширенной функциональностью для решения различных хирургических задач.

Литература

1. Mihaljevic A.L., Mihaljevic A.L., Schirren R., Ottl S., Grün S., Michalski C.W., et al. Multicenter double-blinded randomized controlled trial of standard abdominal wound edge protection with surgical dressings versus coverage with a sterile circular polyethylene drape for prevention of surgical site infections: a CHIR-Net trial (BaFO; NCT01181206). Ann Surg. 2014;260(5):730-739. DOI: 10.1097/SLA.0000000000000954

2. Pinkney T.D., Calvert M., Bartlett D.C., Gheorghe A., Redman V., Dowswell G., et al. Impact of wound edge protection devices on surgical site infection after laparotomy: multicentre randomised

controlled trial (ROSSINI Trial). BMJ. 2013;347:f4305. DOI: 10.1136/bmj.f4305

3. Nguyen M.T., Berger R.L., Hicks S.C., Davila J.A., Li L.T., Kao L.S., et al. Comparison of outcomes of synthetic mesh vs suture repair of elective primary ventral herniorrhaphy: a systematic review and meta-analysis. JAMA Surg. 2014;149(5):415-421. DOI: 10.1001/jamasurg.2013.5014

4. Deerenberg E.B., Mulder I.M., Grotenhuis N., Ditzel M., Jeekel J., Lange J.F. Experimental study on synthetic and biological mesh implantation in a contaminated environment. Br J Surg. 2012;99:1734-1741. DOI: 10.1002/bjs.8954

5. Parshakov А.А., Gavrilov V.A., Samartsev V.A. Prevention of

challenges and nano-enabled solutions. Nano Today. 2014;9(5):574-589. DOI: 10.1016/j.nantod.2014.09.006

Выводы

Данное экспериментальное исследование показало, что препарат «Гемоблок»ТМ обладает выраженным антимикробным действием в отношении планктонных и биопленочных культур стафилококков, эшерихий и псевдомонад. В концентрации препарата 0,062% и выше (по полиакрилату) подавляется рост бактерий, снижается биомасса биопленки и жизнеспособность входящих в нее клеток. Кроме того, установлено, что кратковременная экспозиция сетчатого имплантата в растворе препарата приводит к ингибированию контаминации абиотической поверхности. В хирургической практике гемостатиче-ское средство «Гемоблок»ТМ позволит не только достигнуть остановки паренхиматозного кровотечения при полостных и лапароскопических операциях, но и в случае контаминации снизить количество бактериальных клеток в окружающих тканях в интраоперационном и послеоперационном периодах.

8. Chen Y., Tan H. Crosslinked carboxymethylchitosan-g-poly (acrylic acid) copolymer as a novel superabsorbent polymer. Carbohydr Res. 2006;341(7):887-896. DOI: 10.1016/j. carres.2006.01.027

9. Peng T. Biomaterials for hemorrhage control. Trends Biomater Artif Organs. 2010;24(1):27-68.

10. Kim T., Nam S., Lim S., Kim H. Facile in-situ preparation of poly (acrylic acid)-silver nanocomposite thin films with highly dispersed silver nanoparticles. Mol Crystals Liq Crystals. 2012;568(1):170-178. DOI: 10.1080/15421406.2012.710393

11. Fahmy A., Eisa W.H., Yosef M., Hassan A. Ultra-Thin Films of Poly(acrylic acid)/Silver Nanocomposite Coatings for Antimicrobial Applications. J Spectroscopy. 2016(5):1-11. DOI: 10.1155/2016/7489536

12. Andreev A.I., Ibragimov A.I., Kuznecov M.V., Fatyhov A.M., Anisimov AJu. Clinical experience of using «Haemoblock» hemostatic solution in surgical practice. Kazanskij medicinskij zhurnal. 2015;96(3):451-455. Russian. (Андреев А. И., Ибрагимов А.И., Кузнецов М.В., Фатыхов А.М., Анисимов А.Ю. Опыт клинического применения гемостатического средства «Гемоблок» в хирургической практике. Казанский медицинский журнал. 2015;96(3):451-455.)

Plotkin A.V., Pokrovskij E.Zh., Voronova G.V., Menglet K.A. The evaluation of the effectivity of hemostatic activity of «Haemoblock» for local topical use in different surgical situations. Multicenter clinical trials. Vestnik sovremennoj klinicheskoj mediciny. 2015;8(1):56-61. Russian. (Плоткин А.В., Покровский Е.Ж., Воронова Г.В., Менглет К.А. Оценка эффективности гемоста-тического действия препарата «Гемоблок» при полостных и лапароскопических вмешательствах. Mультицентровые клинические исследования. Вестник современной клинической медицины. 2015;8(1):56-61.)

Merritt J.H., Kadouri D.E., O'Toole G.A. Growing and analyzing static biofilm. Curr Protoc Microbiol. 2005;22(1):1B.1.1-1B.1.18. DOI: 10.1002/9780471729259.mc01b01s00

complications of incisional hernia repair: current problem state 13 (review). Sovremennye tehnologii v medicine. 2018;10(2):175-186. Russian. (Паршаков А.А., Гаврилов В.А., Самарцев В.А. Профилактика осложнений в хирургии послеоперационных грыж передней брюшной стенки: современное состояние проблемы (обзор). Современные технологии в медицине. 2018;10(2):175-186.) DOI: 10.17691/stm2018.10.2.21

6. Anderson D.J. Surgical site infections. Infect Dis Clin North Am. 2011;25(1):135-153. DOI: 10.1016/j.idc.2010.11.004

7. Annabi N., Tamayol A., Shina S.R., Ghaemmaghami A.M., Peppas N.A., Khademhosseini A. Surgical materials: Current 14.

Кузнецова М.В. и соавт.